專利名稱：一種檢測魚類致病菌的試劑盒和方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測魚類致病菌的試劑盒，屬于生物技術領域。
背景技術：
鮰愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)于1979年首次作為斑點叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)養殖的一種新的致病菌被報道，近年從斑點叉尾鮰病魚診斷分離得到的細菌85%是鮰愛德華氏菌。檢測鮰愛德華氏菌的傳統方法是細菌的常規分離鑒定，但所需時間長，程序繁瑣，準確度較低。近年來，用PCR檢測診斷的疾病的方法正在興起。梁萬文，“斑點叉尾鮰敗血癥PCR診斷方法的建立”，大連水產學院學報，2007年8月第22卷第4期公開了一種用PCR方法檢測斑點叉尾鮰敗血癥的方法，但該方法的檢測靶標是一種有待驗證的基因 (Edwardsiella ictaluri putative protein, eip)，其是否為致病性基因也有待進一步探討，不具有代表性，且該文獻檢測對象為廣西研究所魚病研究室從叉尾鮰上分離鑒定并保存的，不是標準菌株，不能說明該文獻的方法能準確檢測鮰愛德華氏菌。亟需尋找一種能準確檢測鮰愛德華氏菌的方法。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種新的試劑盒。本發明提供了一種檢測魚類致病菌的試劑盒，所述的試劑盒包含核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 2所示的引物，用以擴增鮰愛德華氏菌的基因。本發明還提供一種檢測魚類致病菌的方法，它包括如下步驟(1)提取待檢樣本的基因組DNA ；(2)以前述基因組DNA為模板，用SEQ ID NO. 1 2所示的引物擴增；(3)對擴增結果進行檢測。所述步驟(1)中待檢樣本為魚體或者養殖水體。所述魚體為肌肉、肝臟、鰓或者脾臟。本發明最后提供了 SEQ ID NO. 1 2所示的核苷酸序列在擴增或者檢測來自鮰愛德華氏菌的基因的用途。本發明提供的檢測試劑盒和檢測方法特異性強、靈敏度高，可以快速準確地判斷魚體或者水體是否被鮰愛德華氏菌污染，為斑點叉尾鮰的養殖提供保障。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。


圖1鮰愛德華氏菌常規PCR引物驗證實驗結果。1 :DNA ；2 單菌落；3 空白對照； M =DNA maker I，該maker有6條條帶，從上至下分子量依次為600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp 和 IOObp。圖2鮰愛德華氏菌PCR檢測體系的特異性檢測結果。1 空白對照；2:熒光假單胞菌；3 河水弧菌；4 嗜水氣單胞菌；5 豚鼠氣單胞菌；6 溫和氣單胞菌；7 柱狀黃桿菌；8 鮰愛德華氏菌；M =DNA marker I。圖3鮰愛德華氏菌PCR檢測體系的靈敏度檢測結果。1-8 梯度稀釋的DNA模板， 濃度依次為 25ng/ μ L-2. 5fg/ μ L ；9 空白對照；M =DNA maker I。圖4鮰愛德華氏菌PCR檢測體系的靈敏度檢測結果。1-8:梯度稀釋的菌液，濃度依次為 0. 28X 108cfu/mL-0. 28X IO1CfuAiL ；9 空白對照；M =DNAmaker I。圖5斑點叉尾鮰病原檢測結果。M =DNA maker I ；1 肌肉組織；2 肌肉組織；3 肝組織；4 肌肉組織；5 肌肉組織；6 肌肉組織；7 肌肉組織；8 肌肉組織；9 肌肉組織；10 空白對照；11 魚鰓；12 魚鰓；13 脾；14 血液；15 陽性對照。
具體實施例方式實驗材料實驗菌株柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌，均購自中國科學院水生生物研究所，鮰愛德華氏菌ATCC33202，購自ATCC。試齊[J:5U/yL Taq DNA polymerase (Promega，含 IOXreaction buffer 禾口 25mM Mg2+) UOmM dNTPs (Promega) > DNA marker I (Tiangen) ；Sterile Millipore H20(自 ； 細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen)。實施例1引物設計實驗1、引物設計從GenBank上查找愛德華氏菌phosphoserine transaminase的保守基因序列， 根據這些序列設計引物。其中，根據鮰愛德華氏菌serC的編碼基因序列(基因序列號為 AFl 10153. 1，為致病基因)，設計的一對引物為Ei IF(5-CATGATAATACCCGGTGTTGG-3)EilR(5-GTATTGCTGGGGAACAACTC-3)，如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示，其預期擴增片段的大小為124bp。引物由上海生工生物服務有限公司合成。2、引物驗證(1)模板制備活化和制備鮰愛德華氏菌ATCC 33202的菌懸液，并提取基因組 DNA。DNA采用Tiangen的細菌基因組DNA提取試劑盒提取。(2)擴增用上述設計的引物對在Bio-Rad Mycycler梯度擴增儀上擴增；20 μ L的PCR反應體系(終濃度)
4反應緩沖液Ix
上游引物及下游引物0.3μΜ
Mg2+2mM
TaqDNA 聚合酶1.25U
dNTP0.2 mM 模板PCR程序為95°C預變性 ^iin ；94°C變性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 個循環；72°C保溫5min后在4°C條件下終止反應。(3)檢測2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。3、結果實驗結果如圖1所示，泳道1和2擴增得到了預期的基因片段，而空白對照僅有模糊且分子量較小的條帶，其為引物二聚體條帶，無預期的基因片段，說明將本發明設計的引物用于擴增鮰愛德華氏菌基因組中的基因片段是有效的。實施例2PCR檢測體系的特異性和靈敏度檢測1、實驗方法(1)模板制備以柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌，鮰愛德華氏菌的基因組DNA為模板測定方法的特異性；用梯度稀釋的鮰愛德華氏菌的菌液(濃度范圍為0. 28X 108cfu/mL-0. 28 X lO^fu/mL)及梯度濃度的基因組 DNA (濃度范圍從25ng/ μ L 2. 5fg/ μ L)為模板測定方法的靈敏度。DNA采用Tiangen提供的細菌基因組DNA提取試劑盒提取。(2)擴增用實施例1設計的引物對在Bio-Rad Mycycler梯度擴增儀上擴增；20 μ L的PCR反應體系(終濃度)
反應緩沖液Ix
上游引物及下游引物 0.3μΜ
Mg2+2mM
TaqDNA 聚合酶1.25U
dNTP0.2 mM
模板PCR程序為95°C預變性 ^iin ；94°C變性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 個循環；72°C保溫5min后在4°C條件下終止反應。(3)檢測2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。2、實驗結果特異性實驗結果如圖2所示，柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等幾種常見的非靶標魚類致病菌均無靶標擴增條帶，僅有模糊且分子量較小的條帶，其為引物二聚體條帶，檢測結果呈陰性，鮰愛德華氏菌有靶標擴增條帶，檢測結果呈陽性，說明本發明提供的引物具有良好的特異性。敏感性實驗結果如圖3 4所示，所建立的PCR體系對于鮰愛德華氏菌基因組DNA的檢測下限為25pg/y L，即對于鮰愛德華氏菌菌液的檢測下限為0. ^X 105cfu/mL，靈敏度極好。實驗說明，根據鮰愛德華氏菌serC的編碼基因序列設計的如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物特異性和靈敏度均較好，可用于鮰愛德華氏菌的檢測。實施例3試劑盒的組成及使用方法1、試劑盒的組成(1)、PCR反應液(10 μ L/次)緩沖液，核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物，Mg2+，dNTPs ；(2)、Taq 酶(0. 25 μ L/ 次)；(3)、6%吐6161_100(0嫩提取液，20(^17次)；0)、滅菌超純水。2、使用方法(1)提取待檢樣本的基因組DNA ；(2)以提取待檢樣本的基因組DNA為模板，用前述試劑盒進行擴增20 μ L的PCR反應體系(終濃度)
反應緩沖液Ix
上游引物及下游引物 0.3μΜ Mg2+2mM
Taq DNA polymerase 1.25U dNTP0.2mM
模板2汕PCR程序為95°C預變性 ^iin ；94°C變性 15s，56°C退火 10s，72°C延伸 15s，38 個循環；72°C保溫5min后在4°C條件下終止反應。(3) 2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。實施例4斑點叉尾鮰病魚的檢測1、提取患病魚體組織的DNA從養殖魚池現場采集患病的斑點叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)病魚樣品，病魚的頭部、鰭的基部及尾部出現開口小潰蕩，眼睛突出，鰓片鮮紅，腹部腫脹，體腔內有淡黃色的液體，肝臟灰白。各取一小塊組織塊，分別加入200μ1 Millipore H2O,搗爛，取出殘留的組織塊，剩余渾濁液于12，000r/min離心lmin，棄上清，加入200μ 1 Millipore H2O重懸。充分混勻后取50 μ 1加入到200 μ 1 6%的chelex-100中，混勻，56°C保溫20min，劇烈震蕩后于100°C保溫8min，劇烈震蕩，并于12，000r/min離心3min，取上清作為PCR擴增的模板。2、檢測以提取的樣本基因組DNA作為模板，用實施例3提供的試劑盒和檢測方法進行檢測。
3、結果樣品2和樣品8為非潰瘍肌肉組織，樣品1、4_7和9均為潰瘍肌肉組織，肝、腮、脾均出現病變。檢測結果如圖5所示，病魚的潰瘍處肌肉組織(樣品1、4-7和9)、肝(樣品 3)、鰓(樣品11-12)、脾(樣品13)檢測結果與陽性對照(樣品15)的結果一致，均檢測出鮰愛德華氏菌，非潰瘍肌肉組織(樣品2和樣品8)與空白對照(樣品10)結果一致，均沒有檢測出鮰愛德華氏菌，這與臨床癥狀及解剖檢查結果相吻合。血液(樣品14)中沒有檢測到鮰愛德華氏菌，可能與該病魚的病變程度不高有關。上述實驗表明鮰愛德華氏菌是斑點叉尾鮰的致病菌之一，且本發明提供的試劑盒可以準確檢測出患病魚體中的鮰愛德華氏菌。綜上，實驗證明本發明提供的試劑盒能快速準確地檢測鮰愛德華氏菌，為有針對性治療和有效預防魚病提供了可靠的診斷結果，為供應安全的水產品提供了保證。
權利要求
1.一種檢測魚類致病菌的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 2所示的引物，用以擴增鮰愛德華氏菌的基因。
2.一種檢測魚類致病菌的方法，其特征在于包括如下步驟(1)提取待檢樣本的基因組DNA；(2)以步驟(1)中的基因組DNA為模板，用SEQID NO. 1 2所示的引物進行擴增；(3)對擴增結果進行檢測。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中待檢樣本為魚體或者養殖水體。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于所述魚體為肌肉、肝臟、鰓或者脾臟。
5.SEQ ID NO. 1 2所示的核苷酸序列在擴增或者檢測來自鮰愛德華氏菌的基因中的用途。
全文摘要
本發明提供了一種檢測魚類致病菌的試劑盒，所述的試劑盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物，用以擴增鮰愛德華氏菌的基因。還提供了一種魚類致病菌的檢測方法和SEQ ID NO.1～2所示的引物的用途。本發明提供的試劑盒可以快速準確地檢測斑點叉尾鮰致病菌——鮰愛德華氏菌，從而實現有針對性地防治檢測斑點叉尾鮰腸敗血癥，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/01GK102382881SQ20111034382
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者劉天強, 劉衍鵬, 李茂 , 黃冠軍 申請人:通威股份有限公司