專利名稱：一種賴氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種賴氨酸的制備方法。
背景技術(shù)：
賴氨酸是人和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的八種必需氨基酸之一。它對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡、提高體內(nèi)對(duì)谷類蛋白質(zhì)的吸收、改善人類膳食營(yíng)養(yǎng)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育均有重要作用。目前主要用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)，從消費(fèi)結(jié)構(gòu)上看，賴氨酸在飼料中的消費(fèi)占了近90%，而在食品及醫(yī)藥中間體的消費(fèi)僅占10%。賴氨酸多是通過微生物發(fā)酵來制備的，一般通過將賴氨酸發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)生賴氨酸。在工業(yè)生產(chǎn)中，發(fā)酵罐一般包括一個(gè)或多個(gè)并列的發(fā)酵罐，各個(gè)發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種均由專門用于菌種培養(yǎng)的種子罐培養(yǎng)得到。但目前賴氨酸的制備方法的轉(zhuǎn)化率和單罐供酸量低，且種子罐一旦染菌，就不能接入發(fā)酵罐，生產(chǎn)不能連續(xù)進(jìn)行，影響生產(chǎn)能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中賴氨酸的制備方法的轉(zhuǎn)化率和單罐供酸量低，和種子罐染菌后生產(chǎn)不能連續(xù)進(jìn)行的缺陷，提供一種新的賴氨酸的制備方法。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，將在賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件下經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，可提高轉(zhuǎn)化率和單罐供酸量，并可避免種子罐染菌后生產(chǎn)不能連續(xù)進(jìn)行。因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種賴氨酸的制備方法，所述方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，所述賴氨酸發(fā)酵菌種含有在賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件下經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液裝載在一組或多組發(fā)酵罐中，每組發(fā)酵罐包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)酵罐，且同一組發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種來源于相同的組。本發(fā)明方法通過將含有在賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件下經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的賴氨酸發(fā)酵菌種接入培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，使得轉(zhuǎn)化率和單罐供酸量均有大幅度提高，且可使生產(chǎn)連續(xù)進(jìn)行，提高了生產(chǎn)能力，從而降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式
部分予以詳細(xì)說明。


圖1是本發(fā)明方法的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種賴氨酸的制備方法，該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，賴氨酸發(fā)酵菌種含有在賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件下經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種。根據(jù)本發(fā)明，盡管將含有在賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件下經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種接入培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即提高轉(zhuǎn)化率和單罐供酸量，并可使生產(chǎn)連續(xù)進(jìn)行，但為了方便采集菌種且使經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種得到充分利用，優(yōu)選情況下，培養(yǎng)液裝載在一組或多組發(fā)酵罐中，每組發(fā)酵罐包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)酵罐，且同一組發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種來源于相同的組。如圖1所示，姊發(fā)酵罐和3#發(fā)酵罐為不同組發(fā)酵罐，且 2#發(fā)酵罐和3#發(fā)酵罐各自分別包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)酵罐。2#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和種子罐培養(yǎng)出的菌種，或者2#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種僅為在1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種；3#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和種子罐培養(yǎng)出的菌種， 或者3#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種、在 2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和種子罐培養(yǎng)出的菌種(圖中未示出)，或者3# 發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種僅為在2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，或者3# 發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和在2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種(圖中未示出)。當(dāng)發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種既含有經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種又含有種子罐培養(yǎng)的菌種時(shí)，經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和種子罐培養(yǎng)的菌種的比例無特殊要求， 只要發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種含有經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種中含有經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種的比例越高效果越好，即可使發(fā)酵罐的單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率越高。當(dāng)3#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種既含有1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種又含有2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種時(shí)，1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種的比例無特殊要求，任意比例都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，且只要經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種的總含量是固定的，1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種的任意比例的效果均相差無幾。為了方便操作且為了降低接種時(shí)染菌的風(fēng)險(xiǎn)，更優(yōu)選情況下，多組發(fā)酵罐中的任意一組發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種含有經(jīng)多組發(fā)酵罐中的其他任意一組發(fā)酵罐培養(yǎng) 8-30小時(shí)的菌種。如圖1所示，姊發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30 小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和種子罐培養(yǎng)出的菌種，或者2#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種僅為在1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種；3#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在2# 發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種和種子罐培養(yǎng)出的菌種，或者3#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種僅為在2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種。為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率和單罐供酸量，且為了操作更加方便，并進(jìn)一步降低接種時(shí)染菌的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步優(yōu)選情況下，多組發(fā)酵罐中的任意一組發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為經(jīng)多組發(fā)酵罐中的其他任意一組發(fā)酵罐培養(yǎng)8-30小時(shí)的菌種。如圖1所示，姊發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在1#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種；3#發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為在2#發(fā)酵罐中經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在以上各種實(shí)施方式中，均可存在4#發(fā)酵罐、5# 發(fā)酵罐、6#發(fā)酵罐等多組發(fā)酵罐。且在一組發(fā)酵罐包括多個(gè)發(fā)酵罐時(shí)，可以由該組發(fā)酵罐中的一個(gè)發(fā)酵罐提供所述賴氨酸發(fā)酵菌種，也可以由該組發(fā)酵罐中的多個(gè)發(fā)酵罐提供所述賴氨酸發(fā)酵菌種，只要為經(jīng)過8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)得到的菌種即可。本發(fā)明中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積％。流加碳源的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在 5-10克/升，流加氮源的量使培養(yǎng)液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升。此處“流加碳源的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，流加氮源的量使培養(yǎng)液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升”是指通過控制流加碳源和流加氮源的速度來使在整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液中還原性糖的濃度維持在5-10克/升，使培養(yǎng)液中氮的濃度維持在0. 35-0. 8克 /升。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)應(yīng)該在空氣中進(jìn)行。為了有效利用發(fā)酵罐的產(chǎn)能，接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液的體積優(yōu)選為發(fā)酵罐體積的40-60 %，隨著流加碳源和流加氮源，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液的體積逐漸增大，為了保證發(fā)酵罐中的空氣量，優(yōu)選為流加碳源和流加氮源至發(fā)酵罐體積的70-80%時(shí)放料，為了保證放料后發(fā)酵罐中的菌種數(shù)量，不影響放料后發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)，放料體積優(yōu)選為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5-10%。本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)流加比間歇流加的發(fā)酵效果好，因此，本發(fā)明中的流加優(yōu)選為連續(xù)流加。本發(fā)明中，優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)45-50小時(shí)后放罐。本發(fā)明中的放罐是指將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液全部從發(fā)酵罐中放出，即停止發(fā)酵。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，為了得到純度較高的賴氨酸產(chǎn)品，本發(fā)明方法還包括從放料或放罐的溶液中提取賴氨酸。對(duì)于提取賴氨酸的方法無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的各種方法，例如，采用連續(xù)離子交換分離提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的濃硫酸調(diào)PH至2. 0-3. 0進(jìn)行酸化，酸化后經(jīng)過金屬膜或陶瓷膜過濾除去菌體，得到賴氨酸膜濾液即賴氨酸清液，或?qū)⑺峄蟮馁嚢彼岚l(fā)酵液經(jīng)絮凝過濾除菌體后得到賴氨酸清液，除菌體后的賴氨酸清液采用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附交換，樹脂吸附飽和后用稀氨水進(jìn)行洗脫，洗脫下來的賴氨酸經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)PH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使賴氨酸發(fā)酵液酸化，經(jīng)過濾或離心等方法除去菌體。在除去菌體后的賴氨酸清液中加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)PH值至8. 0-11. 5，使賴氨酸清液中的鹽、膠體等雜質(zhì)生成不溶物，經(jīng)固液分離后得到賴氨酸溶液，將賴氨酸溶液濃縮至每毫升賴氨酸溶液中賴氨酸的含量為0. 6-0. 8g，再經(jīng)過過濾可以得到高純度的賴氨酸溶液，然后經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)PH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品。本發(fā)明中，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的條件無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的條件，優(yōu)選為 溫度為 35-38"C，壓力為 0. 05-0. IMPa, pH 值為 6. 7-7. 0。本發(fā)明中，對(duì)賴氨酸發(fā)酵菌種的種類無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的菌種，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。
本發(fā)明中，碳源優(yōu)選為淀粉質(zhì)原料糖化清液。淀粉質(zhì)原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法制糖工藝制備。從工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備投資少，生產(chǎn)成本較低的方面考慮，優(yōu)選通過干法制糖工藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質(zhì)原料不經(jīng)浸泡直接進(jìn)行破碎和酶解。干法制糖工藝可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎，將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿，并加入淀粉酶對(duì)淀粉進(jìn)行第一次水解；對(duì)第一次水解產(chǎn)物進(jìn)行固液分離，并在得到的液相組分中加入糖化酶進(jìn)行第二次水解，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。優(yōu)選地，粉碎使淀粉質(zhì)原料過 30目篩的通過率大于75%，更優(yōu)選過30目篩的通過率為100%。調(diào)漿的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，但優(yōu)選地，調(diào)漿的方法可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17Β °。術(shù)語“波美度”是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計(jì)檢測(cè)溶液得到的度數(shù)。根據(jù)本發(fā)明，在第一次水解中，以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計(jì)，淀粉酶的用量可以為10-30酶活力單位，酶解的溫度可以為88-92°C，酶解的時(shí)間可以為90-120分鐘，酶解的 PH值可以為5. 5-6. 0。固液分離的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地，固液分離的條件使得到的液相組分中的固含量為19-22重量％，更優(yōu)選為20-21重量％。根據(jù)本發(fā)明，在第二次水解中，以每克液相組分計(jì)，糖化酶的用量可以為110-130 酶活力單位，酶解的溫度可以為55-65°C，酶解的時(shí)間可以為420-600分鐘，酶解的pH值可以為 4. 0-4. 5。本發(fā)明酶活力單位的定義為在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫
克淀粉轉(zhuǎn)化為還原性糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶。α-淀粉酶又稱淀粉1，4_糊精酶，它能夠任意地、不規(guī)則地切開淀粉鏈內(nèi)部的 α-1,4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4_糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和內(nèi)孢霉產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明，糖化酶優(yōu)選為α -1,4-葡萄糖水解酶。按照本發(fā)明，淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備賴氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種。本發(fā)明中，氮源的種類為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以為銨鹽。當(dāng)?shù)礊殇@鹽時(shí)，培養(yǎng)液中氮的濃度以銨根離子的濃度表示，氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升，則銨根離子的濃度控制在0. 5-1. 0克/升。本發(fā)明中，培養(yǎng)液的成分無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液， 例如，培養(yǎng)液可以含有淀粉質(zhì)原料糖化清液、糖蜜、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸。根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)液中各組分的含量可以在很大范圍內(nèi)改變， 優(yōu)選情況下，每升培養(yǎng)液中，淀粉質(zhì)原料糖化清液的含量可以為40-60克，糖蜜的含量可以為30-50克，玉米漿的含量可以為20-40克，硫酸銨的含量可以為20-40克，磷酸氫二鉀的含量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的含量可以為0. 4-0. 6克，蘇氨酸的含量可以為0. 1-0. 3 克，蛋氨酸的含量可以為0. 1-0. 3克，谷氨酸的含量可以為0. 2-0. 4克。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸發(fā)酵菌種在被接種至發(fā)酵培養(yǎng)液中之前， 采用常規(guī)方法將賴氨酸發(fā)酵菌種經(jīng)過種子罐培養(yǎng)，然后再將菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)液中。在種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、( (optical density)值測(cè)定對(duì)產(chǎn)賴氨酸微生物的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，當(dāng)通過上述方法觀察菌體形態(tài)正常、測(cè)定OD值達(dá)到0. 75以上時(shí)停止培養(yǎng)，然后再將種子罐的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中。種子罐培養(yǎng)可以采用一級(jí)種子罐培養(yǎng)也可以采用二級(jí)種子罐培養(yǎng)，一級(jí)種子罐培養(yǎng)即將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個(gè)種子罐中一直培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度；二級(jí)種子罐培養(yǎng)即先將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個(gè)種子罐中培養(yǎng)一段時(shí)間后再轉(zhuǎn)入另一個(gè)種子罐繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度。二級(jí)種子罐培養(yǎng)在各個(gè)種子罐的培養(yǎng)時(shí)間沒有具體限定，只要最終能培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度即可。為了操作方便，本發(fā)明的種子罐培養(yǎng)優(yōu)選采用一級(jí)種子罐培養(yǎng)。由于賴氨酸發(fā)酵菌種個(gè)體微小，數(shù)量不易統(tǒng)計(jì)，而種子液的OD值為被測(cè)種子液吸收的光密度，可以反映種子液中賴氨酸微生物的數(shù)量，因此，本領(lǐng)域中一般均采用OD值來表示種子液中賴氨酸微生物的數(shù)量，本發(fā)明也沿用本領(lǐng)域的采用OD值來表示種子液中賴氨酸微生物的數(shù)量的習(xí)慣。且本發(fā)明中，OD值用722N可見光分光光度計(jì)測(cè)定。種子罐培養(yǎng)基中各組分的含量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每升培養(yǎng)基中，淀粉質(zhì)原料糖化清液的含量可以為30-40克，玉米漿(干重為20-50重量％)的含量可以為70-90克，磷酸氫二鉀的含量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的含量可以為0. 4-0. 6克， 蘇氨酸的含量可以為0. 1-0. 3克，蛋氨酸的含量可以為0. 1-0. 3克，谷氨酸的含量可以為 0. 2-0. 4 克。本發(fā)明中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積％。當(dāng)將種子罐的種子液接入發(fā)酵罐時(shí)，接種量指的是接入發(fā)酵罐的種子液占接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液的12-18體積％ ；當(dāng)將經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間的培養(yǎng)液接入其他發(fā)酵罐時(shí)，接種量指的是接入其他發(fā)酵罐的經(jīng)一定時(shí)間發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)液占接種后且流加碳源和流加氮源之前其他發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液的12-18體積％。根據(jù)本發(fā)明方法的一種具體實(shí)施方式
，如圖1所示，本發(fā)明的方法包括將菌種接入種子罐中培養(yǎng)1818小時(shí)后接種到1#發(fā)酵罐中，在流加碳源和流加氮源的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)8-30小時(shí)后將一部分培養(yǎng)液接入2#發(fā)酵罐中，1#發(fā)酵罐中的剩余培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)45-50小時(shí)后放罐，經(jīng)1#發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)8-30小時(shí)后的一部分培養(yǎng)液接入姊發(fā)酵罐中后，在流加碳源和流加氮源的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng) 8-30小時(shí)后將一部分培養(yǎng)液接入3#發(fā)酵罐中，姊發(fā)酵罐中的剩余培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)45-50小時(shí)后放罐，經(jīng)2#發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)8-30小時(shí)后的一部分培養(yǎng)液接入3# 發(fā)酵罐中后，在流加碳源和流加氮源的條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，還可以存在4#發(fā)酵罐、5#發(fā)酵罐等多組發(fā)酵罐，重復(fù)上述步驟依次進(jìn)行下去。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)的菌種為經(jīng)過活化后進(jìn)行增殖培養(yǎng)后的菌種。活化和增殖培養(yǎng)為本領(lǐng)域的公知常識(shí)，在此不再贅述。
以上結(jié)合附圖詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式
中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。實(shí)施例以下的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。在下述實(shí)施例和對(duì)比例中OD值測(cè)定將取樣的發(fā)酵液進(jìn)行沈倍稀釋，采用722N可見光分光光度計(jì)，在波長(zhǎng) 562納米可見光下測(cè)定吸光值。按照GB/T5009. 7-2008的方法測(cè)定發(fā)酵液中還原性糖的濃度。按照GB3595-83的方法測(cè)定發(fā)酵液中銨根離子的濃度。按照GB10794-89標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)培養(yǎng)液中的賴氨酸濃度(以賴氨酸鹽酸鹽計(jì))。單罐供酸量=(放罐的賴氨酸濃度X放罐體積+中間放料賴氨酸濃度X中間放料體積)。轉(zhuǎn)化率(％ )=單罐供酸量/總糖的重量X100%，其中總糖的重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。實(shí)施例1本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。(1)將收獲的100重量份玉米通過機(jī)械加工將玉米顆粒粉碎，使玉米粉過30目篩的通過率為80%。(2)將粉碎后的產(chǎn)物加水調(diào)漿至12Β °，相對(duì)于每克粉碎產(chǎn)物的干重，加入20個(gè)酶活力單位的淀粉酶(諾維信公司，α -淀粉酶)，在90°C、ρΗ為5. 5的條件下酶解100分鐘，得到酶解產(chǎn)物。其中，將酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，分離出酶解清液 (固含量為20重量％)；之后加入115個(gè)酶活力單位的糖化酶(α-1，4_葡萄糖水解酶，諾維信公司)，在60°C、ρΗ為4. 5的條件下酶解420分鐘，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。(3)使用步驟(2)得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液配制種子罐培養(yǎng)基，具體組成為相對(duì)于每升的培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料糖化清液的含量為35克，玉米漿(干重為35重量％)的含量為80克，磷酸氫二鉀的含量為1. 0克，硫酸鎂的含量為0. 5克，蘇氨酸的含量為0. 2克， 蛋氨酸的含量為0. 2克，谷氨酸的含量為0. 3克。將培養(yǎng)基加熱到121°C消毒，維持20分鐘后降溫至37°C并保持恒定。開啟攪拌，調(diào)節(jié)罐壓為0. IMPa，按照通風(fēng)量與培養(yǎng)基1 0.5 體積比通入無菌空氣，用氨水調(diào)節(jié)PH至6.8并保持恒定。然后按照?qǐng)D1所示工藝流程將黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購(gòu)自江南大學(xué))活化和增殖后接入種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測(cè)定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達(dá)到0. 8時(shí)停止培養(yǎng)。(4)使用步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液配制發(fā)酵培養(yǎng)液，具體組成為相對(duì)于每升的培養(yǎng)液，淀粉質(zhì)原料糖化清液的含量為50克，糖蜜(產(chǎn)地新疆)的含量為40克， 玉米漿(干重為35重量％)的含量為30克，硫酸銨的含量為30克，磷酸氫二鉀的含量為 1. O克，硫酸鎂的含量為0. 5克，蘇氨酸的含量為0. 2克，蛋氨酸的含量為0. 2克，谷氨酸的含量為0. 3克。培養(yǎng)液加熱到121°C消毒30分鐘后降溫至37°C并保持恒定，用氨水調(diào)節(jié)pH 至 6. 9。(5)在1#發(fā)酵罐(為1個(gè)發(fā)酵罐)中裝入步驟(4)配制好的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液體積為1#發(fā)酵罐體積的50%。使用步驟( 所得的種子液，接入1#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，步驟C3)所得的種子液的接種量為15體積％。接種后連續(xù)流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa，發(fā)酵溫度控制為37°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 9進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的75%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的8%，培養(yǎng)15小時(shí)后1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為A，將該A 培養(yǎng)液一部分取出用作2#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在1#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng) 48小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度(即終點(diǎn)賴氨酸含量，下同)和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。(6)在2#發(fā)酵罐(為1個(gè)發(fā)酵罐)中裝入步驟( 配制好的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液體積為姊發(fā)酵罐體積的50%。將步驟( 得到的A培養(yǎng)液一部分接入姊發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，A培養(yǎng)液的接種量為15體積％。接種后連續(xù)流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa，發(fā)酵溫度控制為37°C，通氣量為0. 7 立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 9進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的75%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的8%。培養(yǎng)15小時(shí)后2#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為B，將該B培養(yǎng)液一部分取出用作3#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在2#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。(7)在3#發(fā)酵罐(為1個(gè)發(fā)酵罐)中裝入步驟(4)配制好的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液體積為3#發(fā)酵罐體積的50%。將步驟(6)得到的B培養(yǎng)液一部分接入3#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，B培養(yǎng)液的接種量為15體積％。接種后連續(xù)流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa，發(fā)酵溫度控制為37°C，通氣量為0. 7 立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 9進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加步驟( 得到的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的75%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的8%。發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方均與實(shí)施例1相同。在種子罐中接入活化和增殖后的黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購(gòu)自江南大學(xué)) 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測(cè)定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達(dá)到0.8時(shí)停止培養(yǎng)。1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為1#發(fā)酵罐體積的40%。將種子罐培養(yǎng)后的種子液接入1#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，種子液的接種量為12體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. 08MPa，發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5%，培養(yǎng)8小時(shí)后1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為A，將該A培養(yǎng)液一部分取出用作2#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在1#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。2#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為2#發(fā)酵罐體積的40 %。將A培養(yǎng)液一部分接入2#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，A培養(yǎng)液的接種量為12體積％。 接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. OSMPa,發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 7 立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5%。培養(yǎng)8小時(shí)后2#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為B，將該B培養(yǎng)液一部分取出用作3#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在2#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)后放罐。 測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。3#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為3#發(fā)酵罐體積的40%。將B培養(yǎng)液一部分接入3#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，B培養(yǎng)液的接種量為12體積％。 接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. 08MPa，發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 7 立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5%。發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例3本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方均與實(shí)施例1相同。在種子罐中接入活化和增殖后的黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購(gòu)自江南大學(xué)) 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測(cè)定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達(dá)到0.8時(shí)停止培養(yǎng)。1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為1#發(fā)酵罐體積的60%。將種子罐培養(yǎng)后的種子液接入1#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，種子液的接種量為18體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 8-1. 0克/升，將罐壓控制為0. 05MPa，發(fā)酵溫度控制為38°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在7. 0進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的80%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的10%，培養(yǎng)30小時(shí)后1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為A，將該A培養(yǎng)液一部分取出用作2#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在1#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)50小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表 1。2#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為2#發(fā)酵罐體積的60 %。將A培養(yǎng)液一部分接入2#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，A培養(yǎng)液的接種量為18體積％。 接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 8-1. 0克/升，將罐壓控制為0. 05MPa,發(fā)酵溫度控制為38°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在7. 0進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的80%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的10%。培養(yǎng)30小時(shí)后姊發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為B，將該B培養(yǎng)液一部分取出用作3#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在2#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)50小時(shí)后放罐。 測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。3#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為3#發(fā)酵罐體積的60 %。將B培養(yǎng)液一部分接入3#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，B培養(yǎng)液的接種量為18體積％。 接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 8-1. 0克/升，將罐壓控制為0. 05MPa，發(fā)酵溫度控制為38°C，通氣量為0. 7 立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在7. 0進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的80%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的10%。發(fā)酵培養(yǎng)50小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例4本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方均與實(shí)施例1相同。在種子罐中接入活化和增殖后的黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購(gòu)自江南大學(xué)) 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測(cè)定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達(dá)到0.8時(shí)停止培養(yǎng)。1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為1#發(fā)酵罐體積的40%。將種子罐培養(yǎng)后的種子液接入1#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，種子液的接種量為12體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. 08MPa，發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5%，培養(yǎng)8小時(shí)后1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為A，將該A培養(yǎng)液一部分取出用作2#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在1#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，再培養(yǎng)8小時(shí)(即培養(yǎng)16 小時(shí))后1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為Al，將該Al培養(yǎng)液一部分取出用作3#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在1#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。2#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為2#發(fā)酵罐體積的40 %。將A培養(yǎng)液一部分接入2#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，A培養(yǎng)液的接種量為12體積％。 接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. 08MPa，發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 7 立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5%。培養(yǎng)8小時(shí)后2#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為B，將該B培養(yǎng)液一部分取出用作3#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在2#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)后放罐。 測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。3#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為3#發(fā)酵罐體積的40%。將Al培養(yǎng)液一部分和B培養(yǎng)液一部分接入3#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，Al培養(yǎng)液一部分和B培養(yǎng)液一部分的體積比為1 1，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，Al培養(yǎng)液和B培養(yǎng)液的總的接種量為12體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 5-0. 7克/升，將罐壓控制為0. OSMPa,發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 7進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5%。發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。實(shí)施例5本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的賴氨酸的制備方法。淀粉質(zhì)原料糖化清液的制備方法、種子罐培養(yǎng)基配方、發(fā)酵罐培養(yǎng)液配方均與實(shí)施例1相同。 在種子罐中接入活化和增殖后的黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購(gòu)自江南大學(xué)) 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測(cè)定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達(dá)到0.8時(shí)停止培養(yǎng)。1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為1#發(fā)酵罐體積的50%。將種子罐培養(yǎng)后的種子液接入1#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，種子液的接種量為15體積％。接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa,發(fā)酵溫度控制為37°C，通氣量為 0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 9進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的75%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的8%，培養(yǎng)15小時(shí)后1#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液記為A，將該A培養(yǎng)液一部分取出用作2#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種，另一部分在1#發(fā)酵罐中繼續(xù)上述連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨以及放料的步驟進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后放罐。 測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。2#發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積為2#發(fā)酵罐體積的50 %。將A培養(yǎng)液一部分接入2#發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，A培養(yǎng)液的接種量為15體積％。 接種后連續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使培養(yǎng)液中銨根離子的濃度控制在0. 6-0. 8克/升，將罐壓控制為0. IMPa,發(fā)酵溫度控制為37°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培養(yǎng)液/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)PH維持在6. 9進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，流加制得的淀粉質(zhì)原料糖化清液和硫酸銨至發(fā)酵罐體積的75%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的8%。發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對(duì)比例1按照實(shí)施例5的方法制備賴氨酸，不同的是，將在1#發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)5小時(shí)后的培養(yǎng)液記為A，將該A培養(yǎng)液一部分取出用作2#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種接入2#發(fā)酵罐中。分別測(cè)定1#發(fā)酵罐和姊發(fā)酵罐的放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，分別計(jì)算1#發(fā)酵罐和2#發(fā)酵罐的單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對(duì)比例2按照實(shí)施例5的方法制備賴氨酸，不同的是，將在1#發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)40小時(shí)后的培養(yǎng)液記為A，將該A培養(yǎng)液一部分取出用作2#發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種接入2#發(fā)酵罐中。分別測(cè)定1#發(fā)酵罐和2#發(fā)酵罐的放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，分別計(jì)算1#發(fā)酵罐和2#發(fā)酵罐的單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。對(duì)比例3按照實(shí)施例5的方法制備賴氨酸，不同的是，僅有1#發(fā)酵罐，沒有2#發(fā)酵罐，1#發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后放罐。測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。表 權(quán)利要求
1.一種賴氨酸的制備方法，所述方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，所述賴氨酸發(fā)酵菌種含有在賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件下經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)液裝載在一組或多組發(fā)酵罐中，每組發(fā)酵罐包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)酵罐，且同一組發(fā)酵罐的賴氨酸發(fā)酵菌種來源于相同的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述多組發(fā)酵罐中的任意一組發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種含有經(jīng)所述多組發(fā)酵罐中的其他任意一組發(fā)酵罐培養(yǎng)8-30小時(shí)的菌種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述多組發(fā)酵罐中的任意一組發(fā)酵罐中接入的賴氨酸發(fā)酵菌種為經(jīng)所述多組發(fā)酵罐中的其他任意一組發(fā)酵罐培養(yǎng)8-30小時(shí)的菌種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的培養(yǎng)液為基準(zhǔn)，所述賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述流加碳源的量使培養(yǎng)液中還原性糖的濃度控制在5-10克/升，所述流加氮源的量使培養(yǎng)液中氮的濃度控制在0. 35-0. 8克/升。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液的體積為發(fā)酵罐體積的40-60%，流加碳源和流加氮源至發(fā)酵罐體積的70-80%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積的5-10%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述流加為連續(xù)流加。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)45-50小時(shí)后放罐。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或9所述的方法，其中，所述方法還包括從所述放料或所述放罐的溶液中提取賴氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為溫度為 :35-38°C，壓力為 0. 05-0. IMPa, pH 值為 6. 7-7. 0。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述賴氨酸發(fā)酵菌種為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述碳源為淀粉質(zhì)原料糖化清液。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述氮源為銨鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種賴氨酸的制備方法，所述方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)液中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，所述賴氨酸發(fā)酵菌種含有在賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)條件下經(jīng)8-30小時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)的菌種。本發(fā)明方法使得轉(zhuǎn)化率和單罐供酸量均有大幅度提高，且可使生產(chǎn)連續(xù)進(jìn)行，提高了生產(chǎn)能力，從而降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P13/08GK102399834SQ20111034384
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者盧宗梅, 吳曉艷, 周勇, 廖四祥, 鐘華 申請(qǐng)人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司