專利名稱：高產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的菌株及其發(fā)酵培養(yǎng)基和產(chǎn)酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，特別涉及一種高產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的菌株及其發(fā)酵培養(yǎng)基和生產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的方法。
背景技術(shù)：
植酸是一類六磷酸肌醇物質(zhì)，化學名稱是環(huán)己6醇-1，2，3，4，5，6-六磷酸二氫酯， 是一種淡黃色粘稠狀液體，廣泛存在于谷物，豆科植物和油料作物中，是磷元素的主要貯存形式。植酸具有極強的螯合能力，表現(xiàn)出很強的抗營養(yǎng)作用，可與多種金屬離子如Si2+、 Ca2+、CU2+、i^2+、Mg2+、Co2+等螯合成相應的不溶性絡(luò)合物，從而影響動物對礦物元素的消化吸收；植酸能與蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等螯合，使其溶解性降低，影響動物對這些營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；植酸還能與動物消化道內(nèi)胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶等結(jié)合降低其活性，從而影響動物對蛋白質(zhì)、碳水化合物的消化吸收。大多數(shù)植物性飼料中60% -80%的磷是以植酸磷的形式存在的，而單胃動物(豬、家禽和魚等)缺乏內(nèi)源型的植酸酶系統(tǒng)，因此不能有效代謝以谷物、豆科植物和油料作物為主要成分的飼料中富含的植酸及植酸鹽，其磷利用率僅為(Γ40%，未被動物體利用的大量植酸磷大部分排出體外，一方面造成磷的巨大浪費，另一方面排出體外的磷進入土壤和水中，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖中排放磷對環(huán)境的污染。而為了滿足動物生長過程中的營養(yǎng)需要，必須在飼料中添加無機磷及其他礦物鹽，這不僅造成大量資源浪費和飼料成本的提高，還對環(huán)境產(chǎn)生了極大的污染。而我國磷資源比較匱乏，價格昂貴，如何解決好飼料中大量的植酸磷不能被單胃動物利用而又不得不添加無機磷從而增加飼料成本這個矛盾，人們把目光轉(zhuǎn)向了生物酶一植酸酶降解法。植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸水解酶，是一類能催化植酸及植酸鹽水解成低磷酸化的肌醇衍生物和磷(或磷酸鹽)的酶的總稱，被譽為綠色飼料添加劑，廣泛存在于植物、 動物和微生物中，其中微生物來源的植酸酶是近年來研究的熱點。在飼料中添加植酸酶，改良磷酸鹽的生物利用度，消除植酸的抗營養(yǎng)作用；減少磷在環(huán)境中的排泄，由此降低了農(nóng)業(yè)生態(tài)的負擔，并減緩了水生環(huán)境的富營養(yǎng)化；同時也減少了動物飼料中無機磷的添加，后者是一種不可再生的資源。此外，在食品中應用植酸酶可以改善鐵和鋅的吸收，這對于發(fā)展中國家的人群營養(yǎng)具有顯著的意義。目前，植酸酶作為單胃動物飼料添加劑，其飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到廣泛確證。但植酸酶在實際應用中也存在著很多的不足，首先便是植酸酶的生產(chǎn)成本和價格居高不下，影響了實際推廣。我國植酸酶產(chǎn)品的酶活僅為500 U/g。產(chǎn)品酶活大幅度提高， 必將大幅度降低植酸酶的成本，在當前畜禽養(yǎng)殖場排泄物含磷量尚未出臺有關(guān)法規(guī)加以限制的情況下，只有進一步降低植酸酶的成本和價格，而且顯著低于磷源的價格，植酸酶才能在我國得到大規(guī)模的推廣和應用。其次是植酸酶的耐熱性普遍較低，沒有較好的耐熱性，就無法抵御在飼料高溫制粒時引起的酶失活，又進一步提高了其成本。我國每年通過動物糞便排入自然界的磷資源的量尤為可觀，這不僅造成了巨大的磷資源的浪費，而且還導致了嚴重水體環(huán)境污染。如何切實有效的消減由于飼料吸收而流失的磷資源，使之變廢為寶，消除其對環(huán)境的污染，成為目前急需解決的重要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的菌株，菌株的分類命名為 芽孢桿菌feci/^As / ea/so/ ii，其保藏編號為CGMCC No. 5396。保藏日期為2011年10月 28日，保藏單位是中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心。由該菌株生產(chǎn)的植物酶分子量為43kDa，反應的最適溫度為55°C，最適pH值為 7. 5，該酶對高溫的耐熱性較好，在80°C溫浴下，30min后還保留41%的活性，而在90°C條件下，IOmin后還保留73%的活性，30min后保留21%的活性。對堿具有較好的耐受性，不耐酸， 大部分金屬離子對該植酸酶的活性都有不同程度的抑制作用，且隨著其濃度的上升而加強其抑制作用，而Ca2+對該酶無抑制作用，反而有輕微的促進作用。具有很強的底物特異性。 該酶在耐熱性要高于目前已分離得到的同類植酸酶，具有很好的商業(yè)化應用價值。本發(fā)明采用現(xiàn)在生物化工技術(shù)，從土壤中分離和篩選了一株安全的、能夠高產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的芽孢桿菌菌株ifeciBm /7M/s0/7ii，對該菌株的產(chǎn)酶過程進行了優(yōu)化， 并對其產(chǎn)酶特性進行了評價。本發(fā)明對于解決飼料中大量的植酸磷不能被單胃動物利用而又不得不添加無機磷從而增加飼料成本這一問題具有重要意義。本發(fā)明菌株的分離方法如下取自浙江、云南植物根際土壤，高溫地帶土壤樣品， 經(jīng)經(jīng)80°C水浴IOmin后殺死普通雜菌，獲取目的芽孢桿菌芽孢，再取菌液涂布于篩選平板，利用其水解植酸鈣產(chǎn)生透明圈的特性篩選目的菌株，挑取透明圈較大的菌株進行劃線分離，獲取其單菌落，完成首輪初篩。初篩后的菌株，還要通過偏釩酸銨法測定酶活力進行復篩以確定是否存在假陽性菌株和菌株產(chǎn)酶活力的高低，挑選活力最高的菌株，命名為 ZJ0902用甘油保存。采用傳統(tǒng)的菌株鑒定與分子生物學鑒定相結(jié)合的方式對篩選得到的菌株進行鑒定。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第8版)，對ZJ0902進行革蘭氏染色與芽孢染色，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)及芽孢位置，再結(jié)合芽孢桿菌屬的一些特殊生理反應，設(shè)計了相應的培養(yǎng)基以及一系列生化反應管。由該菌的生理生化反應現(xiàn)象，初步將其定位于芽孢桿菌屬中的短桿菌。 菌株的生理生化鑒定結(jié)果如下表所示。
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的菌株，菌株的分類命名為-MciIlus細—，其保藏編號為 CGMCC No. 5396。
2.權(quán)利要求1所述菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，由以下重量百分比的組分組成3. 7% 麩皮，2. 27% 蛋白胨，0. 5% 硝酸銨，0. 00863% 無機磷，0. 2%CaCl2，0. 05% KCl， 0. 03%MgS04，0. 003%FeS04，0. 003% MnSO4,0. 03% NaCl，余量為水。
3.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的pH值為7.0。
4.一種生產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的方法，其特征在于包括以下步驟將菌種CGMCC No. 5396接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下重量百分比的組分組成3. 7%麩皮，2. 27% 蛋白胨，0. 5% 硝酸銨，0. 00863% 無機磷，0. 2%CaCl2，0. 05% KCl, 0. 03%MgS04, 0. 003%FeS04，0. 003% MnSO4,0. 03% NaCl，余量為水，ρΗ7· 0 ；接種量 7%, 34 °C發(fā)酵 84 小時； 將所得發(fā)酵液離心，依次通過PEG20000濃縮，DEAE-Sepharose FF初步柱層析，G-100葡聚糖凝膠二次柱層析的方法對植酸酶進行分離純化，得耐熱型中性植酸酶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的菌株，菌株的分類命名為芽孢桿菌Bacillusnealsonii，其保藏編號為CGMCC No.5396，保藏日期為2011年10月28日，保藏單位是中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心。由該菌株生產(chǎn)的植物酶對高溫的耐熱性較好，在80℃溫浴下，30min后還保留41%的活性，而在90℃條件下，10min后還保留73%的活性，30min后保留21%的活性。本發(fā)明還提供了上述菌株的培養(yǎng)基以及利用該菌株生產(chǎn)耐熱型中性植酸酶的方法。
文檔編號C12N9/16GK102424803SQ20111036668
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者于平 申請人:浙江工商大學