專利名稱：一種利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉pfy及其產生微生物油脂的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用預處理后的木質纖維素為底物發酵生產不飽和脂肪酸的新菌種。
背景技術：
通常用微生物發酵方法對這些廢棄材料進行處理利用時存在生產效率低和生產成本高等問題，而且需要結合其他的物理或化學方法對材料進行預處理，有時需要多步酶解處理和發酵才能得到產品。利用酶解糖化液進行發酵生產 ，雖然微生物可以很容易的利用酶解產生的糖化液進行發酵，但是這樣需要纖維素酶的加入并因此增加了生產成本。在利用木質類纖維素發酵生產的產品以纖維素乙醇報道較多，但是利用其發酵生產油脂的相關報道較少，而利用單一菌種對木質纖維素直接進行發酵生產生物產品的研究更少。微生物油脂(microbial oil)又稱單細胞油脂(single cell oil, SCO),主要是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物利用各種碳源和氮源，輔以無機鹽而合成的油脂。微生物油脂脂肪酸組成和一般植物油的組成大致相同，以油酸、棕擱酸、亞油酸和硬脂酸等C16、 C18系脂肪酸為主。與生產動、植物油脂相比，微生物油脂的生產有許多優點原料來源廣泛，價格低廉，而且能利用食品工業的廢棄物，減輕了對環境的污染；生產周期短，能連續大規模生產；同時不受季節、氣候變化的限制。由于微生物油脂中含有多不飽和脂肪酸，多不飽和脂肪酸具有許多生理功能，被廣泛應用于食品、醫藥、化工等領域。另外，利用微生物生產生物柴油已成為國內外生物能源領域研究的重點。

發明內容
本發明的目的是提供一種株能直接高效利用木質纖維素生產微生物油脂的菌種。為了實現上述目的本發明采用如下技術方案
利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法， 其特征在于包括以下步驟
A、將長孢被孢霉菌株接種到含有木質纖維素的培養基中進行培養，培養條件為溫度 20°C-35°C，搖床轉速120 rpm-180 rpm，氮源為尿素，培養4-7天；
B、將發酵后的物質烘干、粉碎后，采用石油醚萃取干物中的粗油脂。所述長孢被孢霉為被孢霉屬真菌，分類命名為長孢被孢霉，經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為5070。將獲取的土樣梯度稀釋后，稀釋濃度為原樣的KT1至10_6，取90-110 Ul稀釋液均勻涂布到剛果紅培養基上進行培養，挑取生長較快且有透明圈的菌落進行純化培養；篩選得到上述的長孢被孢霉。所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的剛果紅培養基配方為=K2HPO4 0. 5-1.0g/L，MgSO40. 2-0. 5g/L，微晶纖維素粉 1.0-2. Og/L，剛果紅 0. 1_0. 5g/L，瓊脂 10_20g/L 和明膠 l_2g/ L0所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質纖維素選自農作物秸桿、木質材料及其下腳料、纖維類的腐殖質、植物果實或果實殘渣。所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質纖維素中木質素含量不高于20%的木質素基材料，不需要對其進行預處理就可直接進行培養。
所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質纖維素的培養基為(g/L):木質類纖維素10-50，尿素 1-5，MgS04 0. 1-0. 5，K2HPO4 0. 5-1. 0，CaCl2 0. 5-1. O。所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的菌體培養后的干物中粗油脂為不飽和脂肪酸酯為主的混合脂肪酸酯，含量為10%-30%。所篩菌種已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)申請了專利菌種保藏， 保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期為2011年7月18日，分類命名為長孢被孢霉(Mortierella elongata))，保藏編號為 CGMCC No. 5070。本發明的優點
(1)所篩菌種來自于自然界，屬于野生型菌種，抗逆性強，易于培養和生長；
(2)對木質纖維素進行高效快速利用。菌種可以對未預處理的木質類纖維素和預處理后的木質類纖維素進行直接發酵，不需要再對其進行酶解糖化，實現了單一菌種的同步糖化發酵，發酵工藝簡單，發酵周期較短；
(3)菌種在發酵過程中可以積累含量較豐富的油脂，并且其中不飽和脂肪酸的含量較
聞;
(4)發酵所得的產品不僅成本較低廉而且產品的營養價值很高，且可以用木質類的廢棄物替代葡萄糖進行高附加值產品的發酵生產。
具體實施例方式實施例I :將土樣梯度稀釋后，分別取0.2mL均勻涂布到剛果紅培養基上，在30°C 下培養，每天觀察培養基上的菌落生長情況，記錄菌落的大小和形成的透明圈的直徑。挑取生長較快的菌落，采用三分區劃線法再次接種到剛果紅培養基上進行分離純化培養，獲得單菌落，選取生長迅速的單菌落作為目標微生物進行保存。其中，剛果紅培養基的配方為(g/L) =K2HPO4 0. 5-1. 0，MgSO4 0. 2-0. 5，微晶纖維素粉 I. 0-2. 0，剛果紅 0. 1-0. 5，瓊脂 10-20，明膠 1-2，pH 自然。實施例2 :對微生物進行觀察發現該菌株菌絲起初為白色，而后變成灰綠色，菌落局限，菌絲匍匐生長；菌絲有隔膜，有分枝，無假根；孢子梗直立，孢子囊呈棒狀或橢球狀； 菌絲透明或有淺綠色，孢子串生，孢子淺綠色。經ITS全序列分析結果可知該菌株為長孢被袍篤(Mortierella eIongatalsp.。長孢被孢霉為被孢霉屬真菌；分類命名為長孢被孢霉， 經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為5070。
實施例3 :以未經過預處理的稻草秸桿為底物進行發酵，在發酵培養基中接種所篩菌種長孢被孢霉PFY，30°C下培養5天，發酵完成后將搖瓶中的物質過濾、烘干，烘干后的質量約為投料量的70%,干物中油脂含量為4%左右。實施例4 :用“三氧化硫氣體處理秸桿的方法”專利技術(專利號200910116615) 對稻草秸桿進行原位微熱爆預處理，將預處理后的稻草秸桿作為底物進行發酵，在液態發酵培養基上接種所篩菌株，在30°C下培養5天，搖床轉速為170r/min，發酵完成后將搖瓶中的物質過濾、烘干，烘干后的質量約為投料量的50%。用有機溶劑提取其中的油脂、粗油脂產率為20%左右。實施例5 :以粉碎后的玉米芯為底物，不經過剝離木質素的預處理過程，接種所篩菌種，在30°C下在30°C下培養5天，搖床轉速為170r/min，發酵完成后將搖瓶中的物質過濾、烘干，用有機溶劑提取干物中的油脂，測定其中的粗油脂含量，經測定，其含量為25%左右。實施例6 :將獲得的油脂作甲酯化處理，之后進行GC-MS分析，經分析，該油脂中不飽和脂肪酸含量為59%，亞油酸含量約為27%，甲酯化方法采用國標法，分析檢測條件為 E1:70ev，接口溫度280°C，離子源溫度230°C，全掃描，掃描范圍20m/z-330m/z，溶劑延遲 3. 5min。
權利要求
1.一種利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于包括以下步驟 將獲取的土樣梯度稀釋后，稀釋濃度為原樣的 ο—1至10_6，取90-110 μ I稀釋液均勻涂布到剛果紅培養基上進行培養，挑取生長較快且有透明圈的菌落進行純化培養； 將步驟A所篩菌種接種到含有木質纖維素的培養基中進行培養，培養條件為溫度20°C-35°C，搖床轉速120 rpm-180 rpm，氮源為尿素，培養4-7天； 將發酵后的物質烘干、粉碎后，采用石油醚萃取干物中的粗油脂； 經ITS全序列分析，所篩菌株為被孢霉屬真菌；分類命名為長孢被孢霉，經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏中心登記入冊編號為5070。
2.根據權利要求I所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的剛果紅培養基配方為=K2HPO4 O. 5-1. Og/L，MgSO4 O. 2-0. 5g/L，微晶纖維素粉 I. 0-2. Og/L,剛果紅 O. 1-0. 5g/L，瓊脂 10_20g/L 和明膠l_2g/L。
3.根據權利要求I所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質纖維素選自農作物秸桿、木質材料及其下腳料、纖維類的腐殖質、植物果實或果實殘渣。
4.根據權利要求2所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質纖維素中木質素含量不高于20%的木質素基材料，不需要對其進行預處理就可直接進行培養。
5.根據權利要求I所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的木質纖維素的培養基為(g/L):木質類纖維素10-50，尿素 1-5，MgS04 O. 1-0. 5，K2HPO4 O. 5-1. O, CaCl2 O. 5-1. O。
6.根據權利要求I所述的利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其特征在于所述的菌體培養后的干物中粗油脂為不飽和脂肪酸酯為主的混合脂肪酸酯，含量為10%-30%。
全文摘要
本發明公開了一種利用木質纖維素發酵產生微生物油脂的長孢被孢霉PFY及其產生微生物油脂的方法，其主要是通過剛果紅培養基培養篩選菌種，然后接種到含有木質纖維素的培養基中進行培養，然后將發酵后的物質烘干、粉碎后，用有機溶劑萃取法提取干物中的粗油脂；最后經ITS全序列分析，所篩菌株為被孢霉屬真菌；該菌種生長迅速，能高效的利用木質纖維素，發酵完成后木質纖維素利用率高達90%，發酵完成后干物中含有較多的微生物油脂，其中不飽和脂肪酸的含量為59%。
文檔編號C12R1/645GK102618447SQ201210004558
公開日2012年8月1日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者姚力蓉, 姚日生, 張遙, 張鵬, 王淮, 鄧勝松 申請人:合肥工業大學, 安徽安生生物化工科技有限責任公司