專(zhuān)利名稱(chēng)：一種降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母凍干菌粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母凍干菌粉的制備方法，適用于降血清膽固醇功能性益生菌制劑及發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
益生菌是指一類(lèi)通過(guò)腸道定殖作用改善宿主特定部位微生態(tài)平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它們通過(guò)改善腸道微生物生態(tài)平衡，控制腸道感染，降低血清膽固醇水平，提高乳糖不耐癥者對(duì)乳糖的利用，并能刺激特異性或非特異性免疫反應(yīng)，具有免疫增強(qiáng)的作用。益生菌制品的活菌應(yīng)該代謝穩(wěn)定，活性較強(qiáng)，通過(guò)消化道后大量存活，進(jìn)入腸道后發(fā)揮益生菌作用。目前用于生產(chǎn)益生菌制劑的優(yōu)良菌種有雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、酵母屬、克魯維酵母屬等。酵母菌包括乳糖發(fā)酵性和乳糖非發(fā)酵性二類(lèi)。其中乳糖發(fā)酵性酵母有克魯維酵母屬(如馬克斯克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、保加利亞克魯維酵母)、假絲酵母屬(如乳酒假絲酵母)和酒香酵母屬等，是制作發(fā)酵乳制品和益生菌制劑的良好菌種。早在1963年人們就證實(shí)攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌發(fā)酵的酸奶具有降低血清膽固醇含量的功效。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳酸菌降膽固醇作用機(jī)理的研究尚存在不同觀點(diǎn)，主要集中于以下三點(diǎn)1.乳酸菌菌體細(xì)胞直接吸收同化膽固醇；2.乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結(jié)合態(tài)膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用；3.其他理論，如吸收同化與共沉淀聯(lián)合作用。有關(guān)酵母菌的益生性也有文獻(xiàn)報(bào)道。酵母菌作為益生菌的應(yīng)用起源于飼料，如 Saccharomyces boulardii被用于不同類(lèi)型痢疾的治療。Psomas等(2003年)研究了 Saccharomyces boulardii具有降低膽固醇的功效。本發(fā)明所用馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3作為益生菌，可在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量高活力的膽鹽水解酶，經(jīng)過(guò)體外牛津杯試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明有降低機(jī)體血清膽固醇含量的功效，其降血清膽固醇的作用機(jī)理與乳酸菌有相似之處。目前，國(guó)內(nèi)利用乳酸菌制備凍干菌粉專(zhuān)利較多，如中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李博等人申請(qǐng)的 “一種開(kāi)菲爾凍干菌粉及其制備方法和應(yīng)用” (CN1911118)是利用開(kāi)菲爾粒中一系列未分離鑒定菌種制備凍干菌粉；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)張和平等人申請(qǐng)的“干酪乳桿菌^iang高密度培養(yǎng)方法、使用它們制備凍干菌粉的方法與所得到的凍干菌粉及其用途”(CN101418270)是利用干酪乳桿菌^iang制備凍干菌粉；上海譜萊生物技術(shù)有限公司方曙光申請(qǐng)的“一種嗜酸乳桿菌凍干菌粉的制備方法”(CN101486986)是利用嗜酸乳桿菌制備凍干菌粉；上海譜萊生物技術(shù)有限公司方曙光申請(qǐng)的“一種雙歧桿菌凍干菌粉的制備方法”(CN101486987)是利用雙歧桿菌制備凍干菌粉。但關(guān)于利用降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母制備凍干菌粉的方法未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和專(zhuān)利報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3凍干菌粉的制備方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的所述方法中，馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)Kl和M3菌株均分離篩選自吉林省普通家庭的藏靈菇，并已于2006年9月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 1812(菌株Kl)和CGMCC No. 1811(菌株 M3)。所述方法中，馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3在含有抗生素的馬鈴薯乳糖選擇性培養(yǎng)基上的菌落大小為3 4mm，表面光滑，邊緣整齊，呈圓形，有光澤，微隆起，乳白色，不透明；個(gè)體形態(tài)呈卵圓形或短橢圓形(Kl菌株)、長(zhǎng)橢圓形或圓柱形(M3菌株)，不形成假菌絲；無(wú)性繁殖為多邊芽殖，在馬鈴薯乳糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出芽率較高，有性繁殖形成子囊孢子。馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3作為益生菌，均可降低機(jī)體血清膽固醇含量。所述方法中，馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3的活化培養(yǎng)基為馬鈴薯乳糖液體培養(yǎng)基，其成分為馬鈴薯200g，乳糖20g，蒸餾水1000mL。其制法為將馬鈴薯去皮切塊，稱(chēng)取 200g加入IOOOmL蒸餾水，煮沸15 20min，雙層紗布過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至IOOOmL,加入乳糖，攪拌溶化，分裝，于115°C滅菌20min。所述方法中，馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3的發(fā)酵培養(yǎng)基為改良馬鈴薯乳糖液體培養(yǎng)基，其成分為馬鈴薯200g，乳糖20g，酵母浸粉10g，蒸餾水1000mL。其制法為將馬鈴薯去皮切塊，稱(chēng)取200g加入IOOOmL蒸餾水，煮沸15 20min，雙層紗布過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至IOOOmL,冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH6.0，加入乳糖和酵母浸粉，攪拌溶化，分裝，于115°C滅菌 20mino所述方法中，利用活化培養(yǎng)基，將保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3分別于接種量1 % (V/V)，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間21h的條件下進(jìn)行活化，并在相同條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用發(fā)酵培養(yǎng)基，將菌株Kl和M3擴(kuò)大培養(yǎng)液分別于接種量2% 3% (V/V)，發(fā)酵溫度32°C，發(fā)酵時(shí)間21 Mh的條件下進(jìn)行發(fā)酵， 得到發(fā)酵液。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用離心機(jī)，將菌株Kl和M3發(fā)酵液分別于 4°C、8000r/min條件下離心lOmin，棄掉上清液，收集得到菌泥。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用九陽(yáng)牌食物料理機(jī)，將新鮮去皮馬鈴薯直接打漿成為馬鈴薯泥，于115°C滅菌15min ；按上述離心前發(fā)酵液1/10體積的量，取滅菌馬鈴薯泥作為凍干基質(zhì)，并分裝于600mL的凍干瓶中，每個(gè)凍干瓶裝量為100mL。所述方法中，采用單因素多水平試驗(yàn)，確定馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3凍干菌粉的凍干保護(hù)劑組合(W/ν) 谷氨酸鈉和3%脫脂奶粉。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，將Kl和M3離心所得菌泥分別置于凍干基質(zhì)中，并按比例加入凍干保護(hù)劑，混合均勻后，于-30°C條件下，預(yù)凍1 至凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍物。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用6L LABC0NC0真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)) 將預(yù)凍物于凍干溫度_55°C、真空度0. 16mBar的條件下，凍干4 至完全干燥狀態(tài)，得到凍干菌粉。所述方法中，馬克斯克魯維酵母Kl和M3凍干菌粉具有降低血清膽固醇、提高機(jī)體抗氧化能力、促進(jìn)腸道菌群平衡等諸多益生功效。上述方法得到的降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母Kl和M3凍干菌粉的制備方法屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明而不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為重量對(duì)體積的百分含量。實(shí)施例1、降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母Kl和M3凍干菌粉的制備方法1、活化將保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的馬克斯克魯維酵母菌Kl和M3分別接種于IOmL馬鈴薯乳糖液體培養(yǎng)基中，于條件下，培養(yǎng)21h。如此傳代培養(yǎng)3次得到活化后的菌種培養(yǎng)液，其活菌數(shù)可達(dá)IO7CfuAiL以上。2、擴(kuò)大培養(yǎng)將上述0. 5mL活化后的菌株Kl和M3培養(yǎng)液分別接種于50mL馬鈴薯乳糖液體培養(yǎng)基中，在條件下，培養(yǎng)21h，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液。3、發(fā)酵將上述20 30mL菌株Kl和M3擴(kuò)大培養(yǎng)液分別接種于IOOOmL改良馬鈴薯乳糖液體培養(yǎng)基中，在32°C條件下，發(fā)酵21 Mh，得到發(fā)酵液，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。4、離心濃縮與加入保護(hù)劑利用九陽(yáng)牌食物料理機(jī)，將新鮮去皮馬鈴薯直接打漿成為馬鈴薯泥，115°C滅菌 15min ；按上述離心前發(fā)酵液1/10體積的量，取滅菌馬鈴薯泥作為凍干基質(zhì)，分裝于600mL 的凍干瓶中，每個(gè)凍干瓶裝量為IOOmL ；將上述IOOOmL菌株Kl和M3發(fā)酵液于4°C、8000r/ min條件下離心lOmin，棄掉上清液，收集得到Kl和M3菌泥，分別加入凍干基質(zhì)中；按表1 配方加入凍干保護(hù)劑，混合均勻后，得到濃縮物，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。表1凍干保護(hù)劑組合試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種利用菌株K1CGMCC No. 1812為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus) 制備降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母凍干菌粉的方法，其特征在于將菌株Kl于接種量 1 % (V/V)，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間21h的條件下進(jìn)行活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液； 將擴(kuò)大培養(yǎng)液于接種量2% 3%，發(fā)酵溫度32°C，發(fā)酵時(shí)間21 Mh的條件下進(jìn)行發(fā)酵， 得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液于4°C、8000r/min條件下離心lOmin，棄掉上清液，收集得到菌泥；取發(fā)酵液體積1/10量的滅菌馬鈴薯泥作為凍干基質(zhì)，分裝于600mL的凍干瓶中，每個(gè)凍干瓶裝量為IOOmL ；將離心收集后的菌泥置于凍干基質(zhì)中，加入谷氨酸鈉(W/V)和3%脫脂奶粉(W/V)的凍干保護(hù)劑，均勻混合后，于_30°C溫度下預(yù)凍1 至凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍物； 利用美國(guó)產(chǎn)6L LABCONCO真空冷凍干燥機(jī)將預(yù)凍物于凍干溫度_55°C、真空度0. 16mBar的條件下，凍干4 至完全干燥狀態(tài)，得到凍干菌粉。
2.一種利用菌株M3CGMCC No. 1811為馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus) 制備降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母凍干菌粉的方法，其特征在于將菌株M3于接種量 1 % (V/V)，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間21h的條件下進(jìn)行活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液； 將擴(kuò)大培養(yǎng)液于接種量2% 3%，發(fā)酵溫度32°C，發(fā)酵時(shí)間21 Mh的條件下進(jìn)行發(fā)酵， 得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液于4°C、8000r/min條件下離心lOmin，棄掉上清液，收集得到菌泥；取發(fā)酵液體積1/10量的滅菌馬鈴薯泥作為凍干基質(zhì)，分裝于600mL的凍干瓶中，每個(gè)凍干瓶裝量為IOOmL ；將離心收集后的菌泥置于凍干基質(zhì)中，加入谷氨酸鈉(W/V)和3%脫脂奶粉(W/V)的凍干保護(hù)劑，均勻混合后，于_30°C溫度下預(yù)凍1 至凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍物； 利用美國(guó)產(chǎn)6L LABCONCO真空冷凍干燥機(jī)將預(yù)凍物于凍干溫度_55°C、真空度0. 16mBar的條件下，凍干4 至完全干燥狀態(tài)，得到凍干菌粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母凍干菌粉的制備方法，適用于降血清膽固醇功能性益生菌制劑及發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。本發(fā)明利用篩選自藏靈菇的馬克斯克魯維酵母K1和M3兩株降血清膽固醇的菌種，經(jīng)過(guò)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)、發(fā)酵、離心濃縮和加入凍干保護(hù)劑、預(yù)凍和凍干，制備凍干菌粉。本發(fā)明優(yōu)化凍干保護(hù)劑組合配方，使菌種存活率達(dá)到65％以上，且凍干菌粉活菌數(shù)達(dá)到109cfu/g以上。本發(fā)明制備降血清膽固醇馬克斯克魯維酵母凍干菌粉，具有降低血清膽固醇、提高機(jī)體抗氧化能力、促進(jìn)腸道菌群平衡等諸多益生功效。
文檔編號(hào)A23C9/12GK102524794SQ201210005579
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者劉慧 , 張紅星, 熊利霞, 謝遠(yuǎn)紅, 賈慧, 鐘思瓊, 高秀芝 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院