專利名稱：快速檢測新疆出血熱病毒的熒光定量rt-pcr試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學檢測領域，特別涉及一種快速檢測新疆出血熱病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，試劑盒的檢測方法及該試劑盒在臨床、口岸檢驗新疆出血熱病毒的應用。
背景技術：
新疆出血熱(Xinjian hemorrhagic fever，XHF)是由布尼亞病毒科內羅病毒屬的新疆出血熱病毒(Xinjian hemorrhagic fever virus，簡稱XHFV，又稱克里米亞-剛果出血熱病毒)引起的急性傳染病，經蜱媒傳播，主要流行于歐、亞、非三大洲，新疆出血熱的發生有明顯的季節性，每年4 5月為流行高峰，與蜱在自然界的消長情況及牧區活動的繁忙季節相符合。臨床特征有發熱、頭痛、困倦乏力、嘔吐、血尿、蛋白尿甚至休克等。目前對新疆出血熱尚無特效治療，原則應采取綜合治療措施，以控制出血和抗休克為主。因此早期快速診斷是控制病情，提高治愈率，避免臨床誤診貽誤治療時機的關鍵。我國部分地區的地理、氣候、傳播媒介-蜱、傳染源等條件與歐、亞、非三大洲流行區相似，隨著全球經濟的發展，國際間的人群交往更為便利，全球貿易一體化和都市化生活等趨勢使得病毒和傳播媒介更易在各個國家之間傳播。所以有必要建立新疆出血熱病毒的快速分子生物學檢測方法，在國境口岸對出入境人群和媒介生物進行早期快速的檢測和監控，防止該傳染病在口岸的傳入，做到及時預防、控制疾病的傳播，對保障我國的經濟發展和人民身體健康有著重要的意義。目前國內對新疆出血熱病毒的研究較少，僅建立了該病毒的組織培養和RT-PCR 檢測方法。國外對新疆出血熱病毒的診斷方法主要包括組織培養、血清學診斷和新發展的分子生物學方法。新疆出血熱病毒的培養要求實驗室的生物安全等級高，需在BSL-3實驗室進行，病毒分離、鑒定的時間較長，且檢測靈敏度不高；血清學方法主要包括(1)補體結合試驗主要檢測補體結合抗體，陽性反應出現較遲，臨床實驗室較少采用；(2)中和試驗 方法很復雜，一般不應用于臨床；(3)血凝抑制試驗，需采集雙份血清標本，以第二份血清的抗體效價呈4倍以上升高為近期感染指標。此外，尚有報道采用捕獲ELISA、間接免疫熒光等方法檢測特異性抗體。分子生物學方法與組織培養、血清學診斷相比，具有檢測靈敏度高，特異性強和檢測時間短等優點，但目前尚沒有適合口岸快速檢測新疆出血熱病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒。

發明內容
本發明的目的在于克服上述技術缺點，提供一種快速檢測新疆出血熱病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒及檢測方法，以適合臨床、口岸等場新疆出血熱病毒的快速檢驗。本發明的檢測新疆出血熱病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其包括 (I)RT-PCR 反應選用的試劑盒為 AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit (美國 Ambion 公司產品)。內含25XRT-PCR酶混合液包含反轉酶、熱啟動Taq酶；2XRT-PCR反應buffer 和ROX陽性參照染料。(2)正向引物 100 μ L，濃度為 12. 5μΜ;
(3)反向引物100μ L，濃度為17. 5μΜ;
(4)熒光探針50μ L，濃度為12. 5μΜ；
(5)無菌DEPC 7jC :5mL
(6)陽性對照即含有新疆出血熱病毒特異的基因RNA片斷；
(7)陰性對照無菌DEPC處理水。所述引物對及熒光探針是合成的DNA片段，堿基序列分別為 正向引物5’ -TGACAGCATT TCTTTAACAGACATCA-3，，
反向引物5’ -AAACACGGCAGCCTTAAGCA-3，， 熒光探針5，-FAM-TCGCCAGGGACTTTATATTCTGCAAGG-TAMRA-3，。上述引物、探針是用Lasergene軟件包中的kqMan程序分析從Genbank上獲得的新疆出血熱病毒核苷酸序列，選擇有核苷酸特異的區域，用I^rimer Express〗.0軟件設計得到的特異性引物和探針，該引物和探針在新疆出血熱病毒基因組上的定位依據是GenBank 序列號為HQ833035. 1的毒株序列，相關信息詳見表1。表權利要求
1.快速檢測新疆出血熱病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征是包括以下試劑(1)RT-PCR反應試劑盒，內含25 X RT-PCR酶混合液包含反轉酶、熱啟動Taq酶； 2 X RT-PCR反應buffer和ROX陽性參照染料；(2)正向引物100μ L，濃度為12. 5μΜ；(3)反向引物100μ L，濃度為17. 5μΜ；(4)熒光探針50μ L，濃度為12. 5μΜ；(5)無菌DEPC 7jC :5mL ；(6)陽性對照即含有新疆出血熱病毒特異的基因片斷的質粒；(7)陰性對照無菌DEPC處理水；所述引物對及熒光探針是合成的DNA片段，堿基序列分別為 正向引物5’ -TGACAGCATT TCTTTAACAGACATCA-3，， 反向引物5，-AAACACGGCAGCCTTAAGCA-3，， 熒光探針5，-FAM-TCGCCAGGGACTTTATATTCTGCAAGG-TAMRA-3，。
2.采用權利要求1所述試劑盒檢測新疆出血熱病毒的方法(1)提取待測樣品的RNA;(2)RT-PCR擴增，方法如下在 RT-PCR 試劑管內加入 25 X RT-PCR 酶混合液 1 μ 1，2 X RT-PCR 反應 buffer 12. 5 μ 1， 正向引物1μ 1，反向引物1μ 1，熒光探針0.5μ 1，模板RNA IOOpg至Iyg (彡5 μ )，用 DEPC處理水補充至25 μ 1 ；瞬時離心混勻；同時設立陰性對照和陽性對照一起置RT-PCR儀擴增擴增條件為45°C反應10分鐘；95°C反應15分鐘；進入擴增循環，95°C反應15秒， 60°C反應45秒，循環40次；(3)RT-PCR結果判定無Ct值或Ct > 45，且無明顯擴增曲線，判定為陰性； Ct ^ 40，并有明顯擴增曲線，判定為陽性；40 < Ct ^ 45，重新檢測，若見有明顯擴增曲線，則為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發明涉及一種快速檢測新疆出血熱病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，本發明根據新疆出血熱病毒所特有的一段保守序列設計特異引物并成功建立了新疆出血熱病毒的PCR檢測方法的基礎上，研制成簡單快速敏感的RT-PCR檢測試劑盒。用本發明試劑盒及檢測方法檢測新疆出血熱病毒，檢測過程方便快速，2-3小時即可得知檢測結果，檢測靈敏度及準確性高，特別適合口岸出入境檢驗檢疫的需要。
文檔編號C12Q1/70GK102424866SQ20121000536
公開日2012年4月25日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者丁永健, 孫立新, 朱臨, 朱光耀, 朱國強, 楊慶貴, 胡紅霞 申請人:中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局