專利名稱：脫氮微生物菌劑及其制備方法和固定化顆粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脫氮微生物菌劑及其制備方法，還涉及一種固定化顆粒和它們在脫氮中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水是自然界的基本要素，是有生命的物質(zhì)得以生存和繁衍的基本物質(zhì)條件之一。目前，全球水環(huán)境面臨著淡水資源缺乏、水體污染、洪澇災(zāi)害等問題，其中水體污染問題尤為突出。當(dāng)進入水體的污染物在數(shù)量上超過了該物質(zhì)在水體中的本體含量和水體的環(huán)境容量，即為水體污染。水體污染最初主要是自然因素造成的，如地面水滲漏和地下水流動將地層中某些礦物質(zhì)溶解，使水中的鹽分、微量元素或放射性物質(zhì)濃度偏高而使水質(zhì)惡化。而當(dāng)前，隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)和交通運輸業(yè)的發(fā)展及人口的增加，水體污染主要是人類的生產(chǎn)和生活活動造成的。在人類高強度的干預(yù)影響下，氮、磷等進入湖泊、河口、海灣等環(huán)流水體中，引起藻類及其他浮游生物迅速繁殖，水體溶解氧量下降、水質(zhì)惡化、魚類及其他生物大量死亡。在自然條件下，水體需經(jīng)過非常緩慢的自然過程才能從貧營養(yǎng)狀態(tài)過渡到富營養(yǎng)狀態(tài)，而人為排放的營養(yǎng)物質(zhì)所引起的水體富營養(yǎng)化則可以在短時間內(nèi)出現(xiàn)。近幾十年來，我國湖泊、水庫和江河富營養(yǎng)化的發(fā)展趨勢非常迅速，富營養(yǎng)化問題十分嚴(yán)峻。我國的幾大湖泊、水庫、大江和河流的水質(zhì)均不同程度的受到威脅。我國水體富營養(yǎng)化問題早已被環(huán)保部門及其他相關(guān)部門重視，從地方到中央投入較多的人力物力進行污染的治理，但多年來治理成效并不十分理想。國外水體也曾發(fā)生過富營養(yǎng)化或有出現(xiàn)富營養(yǎng)化的趨勢。世界范圍內(nèi)，各國都有許多整治水體的實例，但效果甚微。實踐也證明了富營養(yǎng)化的逆轉(zhuǎn)是相當(dāng)困難的，對這種現(xiàn)象可謂是全球慢性災(zāi)害。今天我們遇到的水體富營養(yǎng)化問題，實際上是地球水環(huán)境在一個漫長的時間內(nèi)量變的結(jié)果，因此我們也需認(rèn)清對于富營養(yǎng)化的治理與修復(fù)也應(yīng)是一場持久戰(zhàn)。在富營養(yǎng)化的過程中，氮和磷則是藻類生長的限制因素，一般認(rèn)為水體中氮濃度超過0.2-0.3mg/L，磷濃度超過0.01-0.02mg/L就足以引起藻類的急劇繁殖，從而導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化。引起水體污染的中的氮元素主要以氨態(tài)氮(如銨離子或氨)、亞硝酸鹽態(tài)氮(如NO2-)和硝酸鹽氮(如NO3-)等形式存在。因此，將水體中的氮元素含量降低到符合環(huán)保要求的水平已經(jīng)成為迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服日益嚴(yán)重的水體富營養(yǎng)化問題，提供一種能夠有效地將水體中的氮元素含量降低到符合環(huán)保要求的水平的脫氮微 生物菌劑和固定化顆粒及其制備方法和它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種脫氮微生物菌劑，其中，該脫氮微生物菌劑含有培養(yǎng)基和菌體，所述菌體含有ACCC 05728枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和 ACCC05731類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes),并且,每毫升所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為0.1XIOki到SXlOici個，其中，所述枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。本發(fā)明還提供了所述的脫氮微生物菌劑的制備方法，其中，該方法包括將ACCC05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC05731類產(chǎn)堿假單胞菌接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使得到的每毫升微生物菌劑的總活菌數(shù)為0.1 X IOltl到8X IOltl個，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述八0:0)5729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。本發(fā)明還提供了一種含有微生物的固定化顆粒，其中，該固定化顆粒由含有菌體、包埋劑和無機載體的組合物在交聯(lián)劑存在下固定化后分離得到，其中，所述菌體含有ACCC05728 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729 門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)、ACCC 05730 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和 ACCC 05731 類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes),并且,每毫升所述固定化顆粒所含的總活菌數(shù)為0.4X 101°到3.2X IOltl個，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。本發(fā)明中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是指從中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心商購得到的牌號為ACCC 05728的市售品；ACCC05729門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendoci na)是指從中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心商購得到的牌號為ACCC05729的市售品；ACCC 05730枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是指從是指從中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心商購得到的牌號為ACCC 05730的市售品；ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)是指從中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心商購得到的牌號為ACCC 05731的市售品。此外，還提供了本發(fā)明的微生物菌劑或固定化顆粒在脫氮中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的脫氮微生物菌劑及含有微生物的固定化顆粒能夠有效地將水體中的氮元素含量降低到符合環(huán)保要求的水平，為控制水體污染提供了新的途徑。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種脫氮微生物菌劑，該脫氮微生物菌劑含有培養(yǎng)基和菌體，其中，所述菌體含有:ACCC 05728枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和 ACCC05731類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes),并且,每毫升所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為0.1XIOki到SXlOici個，其中，所述枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述40:0)5731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45% ;優(yōu)選地，所述ACCC05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基的種類可以在很大范圍內(nèi)改變，可以為各種能夠用于培養(yǎng)ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌，例如，可以為PDA培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，用于培養(yǎng)ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的PDA培養(yǎng)基組成為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，所述PDA培養(yǎng)基為將200重量份的去皮土豆、20重量份的葡萄糖和1000重量份水混合后調(diào)整PH值為7.0后得到。本發(fā)明還提供了所述脫氮微生物菌劑的制備方法，其中，該方法包括將ACCC05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC05731類產(chǎn)堿假單胞菌接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使得到的每毫升微生物菌劑的總活菌數(shù)為0.1 X IOltl到8X IOltl個，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述八0:0)5729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。本發(fā)明中，所述將ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法可以在很大范圍內(nèi)改變，例如，該 方法包括:在各自獨立的培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌；并將分別培養(yǎng)得到的ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌按照比例進行混合，使得到的微生物菌劑中，以得到的微生物菌劑的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。優(yōu)選地，所述混合的比例使得到的微生物菌劑中，以得到的微生物菌劑的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30 %、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述40:0)5731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。根據(jù)本發(fā)明，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種2-5重量份的枯草芽孢桿菌的菌株，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.1XlO10到2 X 101°個/mL的培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明，所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種2-5重量份的枯草芽孢桿菌的菌株，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為0.1XlO10到2 X 101°個/mL的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種2-5重量份的枯草芽孢桿菌的菌株，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為0.1XlO10到2 X 101°個/mL的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的培養(yǎng)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種2-5重量份的枯草芽孢桿菌的菌株，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為0.1XlO10到2 X 101°個/mL的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，所述混合的條件沒有特別的限制，只要能夠使得到的微生物菌劑滿足以下條件即可:使得到的微生物菌劑的總活菌數(shù)為0.1XlO10到SXlOici個/mL的微生物菌劑，其中，以得到的微生物菌劑的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述40:0)5729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。優(yōu)選地，所述混合使得到的微生物菌劑中，以得到的微生物菌劑的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。本發(fā)明還提 供了一種含有微生物的固定化顆粒，其中，該固定化顆粒由含有菌體、包埋劑和無機載體的組合物在交聯(lián)劑存在下固定化后分離得到，其中，所述菌體含有ACCC05728 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729 門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)、ACCC 05730 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和 ACCC 05731 類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes),并且,每毫升所述固定化顆粒所含的總活菌數(shù)為0.4X 101°到3.2X IOltl個，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。優(yōu)選地，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述八0:0)5729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。本發(fā)明中，未做相反說明的情況下，各種物料的體積均為室溫下的體積數(shù)值；其中，所述固定化顆粒的體積是指其自然堆積體積。根據(jù)本發(fā)明，所述含有菌體、包埋劑和無機載體的組合物中，所述包埋劑和無機載體的含量可以在很大范圍內(nèi)改變，只要能使每毫升所述固定化顆粒所含的總活菌數(shù)為
0.4X IO10到3.2 X IO10個即可，優(yōu)選地，所述含有菌體、包埋劑和無機載體的組合物中，相對于總活菌數(shù)為1.6X IO14個的菌體，所述包埋劑的含量為20-500克，更優(yōu)選為50-200克，所述無機載體的含量為3-100克，更優(yōu)選為10-30克；相對于所述組合物中的總活菌數(shù)為1.6X IO14個的菌體，以溶質(zhì)的量計，所述交聯(lián)劑的用量為50-1000克，更優(yōu)選為120-400克。根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基可以為PDA培養(yǎng)基，所述包埋劑可以為聚乙烯醇和/或海藻酸鈉，所述無機載體可以為活性炭，所述交聯(lián)劑可以為含氯化鈣的硼酸溶液。其中，未做相反說明的情況下，交聯(lián)劑的用量以溶質(zhì)的量計算。本發(fā)明中，所述ACCC05728 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729 門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731類產(chǎn)喊假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)可以通過商購得到，例如,從中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心商購得到。本發(fā)明還提供了所述固定化顆粒的 制備方法，其中，該方法包括:在各自獨立的培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌；并將分別培養(yǎng)得到的ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌按照比例進行混合，之后依次加入無機載體、包埋劑和交聯(lián)劑，混合均勻并造粒。所述包埋劑和無機載體的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，只要能使每毫升所述固定化顆粒所含的總活菌數(shù)為OjXlOui到3.2 X IOltl個即可，但優(yōu)選地，所述組合物中，相對于總活菌數(shù)為1.6X IO14個的菌體，所述包埋劑的含量為20-500克，所述無機載體的含量為3-100克；更優(yōu)選地，所述組合物中，相對于總活菌數(shù)為1.6 X IO14個的菌體，所述包埋劑的含量為50-200克，所述無機載體的含量為10-30克。其中，相對于所述組合物中的總活菌數(shù)為1.6 X IO14個的菌體，以溶質(zhì)的量計，所述交聯(lián)劑的含量為50-1000克，優(yōu)選為120-400克。ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的混合比例使，所述ACCC05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。優(yōu)選地，混合比例使以得到的微生物菌劑的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。所述包埋劑、無機載體和交聯(lián)劑的種類如上文所述，在此不再贅述。此外，還提供了本發(fā)明的微生物菌劑或固定化顆粒在脫氮中的應(yīng)用。下面通過具體的實施例對本發(fā)明進行更加詳細(xì)的說明。實施例1本實施例用于說明本發(fā)明提供的微生物菌劑及其制備方法。(I)在100重量份的PDA培養(yǎng)基(將200重量份的去皮土豆、20重量份的葡萄糖和1000重量份水混合后調(diào)整pH值為7.0后得到，以下相同)中接種3重量份的ACCC 05728枯草芽孢桿菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為101°個/mL的培養(yǎng)基。(2)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種4重量份的ACCC 05729門多薩假單胞菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基。(3)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種2重量份的ACCC 05730枯草芽孢桿菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為IOltl個/mL的培養(yǎng)基。(4)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種2重量份的ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基。(5)將步驟(I)至(4)中得到的ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌分別稀釋到活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基的濃度后按照比例進行混合，使得到的微生物菌劑中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25%，得到微生物菌劑Al。實施例2本實施例用于說明本發(fā)明提供的微生物菌劑及其制備方法。(I)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種5重量份的ACCC 05728枯草芽孢桿菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為IOltl個/mL的培養(yǎng)基。(2)在100重量份的P DA培養(yǎng)基中接種2重量份的ACCC 05729門多薩假單胞菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基。(3)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種3重量份的ACCC 05730枯草芽孢桿菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為IOltl個/mL的培養(yǎng)基。(4)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種4重量份的ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基。(5)將步驟(I)至(4)中得到的ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌分別稀釋到活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基的濃度后按照比例進行混合，使得到的微生物菌劑中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的30%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的30%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的25%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15%，得到微生物菌劑A2。實施例3本實施例用于說明本發(fā)明提供的微生物菌劑及其制備方法。(I)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種2.5重量份的ACCC 05728枯草芽孢桿菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為101°個/mL的培養(yǎng)基。
(2)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種3.5重量份的ACCC 05729門多薩假單胞菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基。(3)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種4.5重量份的ACCC 05730枯草芽孢桿菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為IOltl個/mL的培養(yǎng)基。(4)在100重量份的PDA培養(yǎng)基中接種3.5重量份的ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌(購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)，30°C發(fā)酵培養(yǎng)，直至ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基。(5)將步驟(I)至(4)中得到的ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌分別稀釋到活菌數(shù)為IO9個/mL的培養(yǎng)基的濃度后按照比例進行混合，使得到的微生物菌劑中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的30%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的40%，得到微生物菌劑A3。實施例4-6分別用實施例1-3中得到的微生物菌劑A1-A3對含氮的富營養(yǎng)化水(用模擬富營養(yǎng)化水代替)進行處理，具體步驟如下:分別取總活菌數(shù)為4X 101°個的實施例1-3制得的微生物菌劑A1-A3，并分別加入到IOOml 模擬富營養(yǎng)化水中，每隔24小時檢測氨氮和總氮濃度，氨氮濃度測定采用納氏試劑比色法(按照GB/T 7479-87的規(guī)定進行)，亞硝酸鹽濃度和硝酸鹽濃度測定采用離子色譜法(按照GB/T 5009.33-2008的規(guī)定進行)。模擬富營養(yǎng)化水的各組分參數(shù)如下表I所示。檢測結(jié)果如下表2所示。表I
權(quán)利要求
1.一種脫氮微生物菌劑，該脫氮微生物菌劑含有培養(yǎng)基和菌體，其特征在于，所述菌體含有ACCC 05728枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和 ACCC05731類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes),并且,每毫升所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為0.1X1010到8X 1010個，其中，所述枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述40:0)5731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫氮微生物菌劑，其中，所述ACCC05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。
3.權(quán)利要求1所述的脫氮微生物菌劑的制備方法，其中，該方法包括將ACCC05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，使得到的每毫升微生物菌劑的總活菌數(shù)為0.1X1010到8 X 1010個，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACC⑶5729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的 10-45% ο
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其中，所述將ACCC05728枯草芽孢桿菌、ACCC05729門多薩假單胞菌、ACCC 05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌接種于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法包括:在各自獨立的培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC 0573 0枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌；并將分別培養(yǎng)得到的ACCC 05728枯草芽孢桿菌、ACCC 05729門多薩假單胞菌、ACCC05730枯草芽孢桿菌和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌按照比例進行混合，使得到的微生物菌劑中，以得到的微生物菌劑的總活菌數(shù)為基準(zhǔn)，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述40:0)5729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10_45%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其中，所述ACCC05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。
6.一種含有微生物的固定化顆粒，其中，該固定化顆粒由含有菌體、包埋劑和無機載體的組合物在交聯(lián)劑存在下固定化后分離得到，其中，所述菌體含有ACCC 05728枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC 05729 門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)、ACCC 05730 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和 ACCC 05731 類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes),并且，每毫升所述固定化顆粒所含的總活菌數(shù)為0.4X 101°到3.2X 101°個，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10_45%、所述ACCC05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的10-45%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的固定化顆粒，其中，所述ACCC05728枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05729門多薩假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15_30%、所述ACCC 05730枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%、所述ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌的活菌數(shù)為總活菌數(shù)的15-30%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所 述的固定化顆粒，其中，所述組合物中，相對于總活菌數(shù)為1.6 X IO14個的菌體，所述包埋劑的含量為20-500克，所述無機載體的含量為3-100克；相對于所述組合物中的總活菌數(shù)為1.6 X IO14個的菌體，以溶質(zhì)的量計，所述交聯(lián)劑的用量為50-1000 克。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的固定化顆粒，其中，所述組合物中，相對于總活菌數(shù)為1.6 X IO14個的菌體，所述包埋劑的含量為50-200克，所述無機載體的含量為10-30克；相對于所述組合物中的總活菌數(shù)為1.6 X IO14個的菌體，以溶質(zhì)的量計，所述交聯(lián)劑的用量為120-400 克。
10.權(quán)利要求1或2所述的微生物菌劑或權(quán)利要求6-9中的任意一項所述的固定化顆粒在脫氮中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脫氮微生物菌劑及其制備方法，還涉及一種固定化顆粒和它們在脫氮中的應(yīng)用。所述脫氮微生物菌劑含有培養(yǎng)基和菌體，所述菌體含有ACCC 05728枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、ACCC 05729門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，并且，每毫升所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為0.1×1010到8×1010個。本發(fā)明提供的脫氮微生物菌劑及含有微生物的固定化顆粒能夠有效地將水體中的氮元素含量降低到符合環(huán)保要求的水平。
文檔編號C12N11/14GK103205371SQ20121000876
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者朱昌雄, 肖晶晶, 郭萍, 田云龍, 俞曉蕓, 龔明波, 劉雪, 葉婧, 李峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所, 開創(chuàng)陽光環(huán)保科技發(fā)展(北京)有限公司