專利名稱：大腸癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種大腸癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估大腸癌發病的風險級別與程度，并作為預防和治療大腸癌的參考指南。
背景技術：
大腸癌為結腸癌和直腸癌的總稱，是我國常見的腫瘤，其發病率已位居惡性腫瘤譜的第3 5位，且呈繼續上升趨勢.引起大腸癌的危險因素很多，我國20多年大腸癌的流行病學研究明確了引起中國人大腸癌的危險因素主有腸息肉史、慢性腹瀉、慢性便秘、 粘液血便、精神刺激史、飲不潔水史、闌尾手術史和家族腫瘤史等，這些因素又可歸為環境因素與遺傳因素兩大類。最近的研究表明，大腸癌的發生與CYP2E1、hMLHl、GSTMU GSTTU MTHFR五個遺傳易感基因密切相關。CYP2E1又稱細胞色素P4502E1，是細胞色素P450酶體系的一員，是藥物代謝的核心體系成員。該酶主要分布于肝臟，其最適底物多為親脂性小分子化合物，包括苯、乙醇、氯乙烯、亞硝胺等，其中大部分為前致癌物和前毒物。CYP2E1能夠將這些前致癌物和前毒物活化，從而對機體帶來傷害。目前研究表明，CYP2E1基因上多態現象能改變其編碼酶的表達水平與活性，因而影響到機體對環境毒物的代謝能力，導致多種癌癥的發生。CYP2E1存在RsaI多態性，影響了 CYP2E1基因的轉錄。研究發現，CYP2E1 RsaI等位基因在大腸癌病例組和對照組中的分布具有顯著差異，是大腸癌發生的易感因素，特別是在與酒精協同作用下，患大腸癌的風險進一步上升。CYP2E1 RsaI單核苷酸多態性位點的基因型有C/C、C/T、T/T三種，其中T/T基因型與大腸癌密切相關，該風險基因型攜帶者，CYP2E1基因表達的蛋白將使苯、乙醇、氯乙烯、亞硝胺等前致癌物轉化為致癌物質，使個體患大腸癌的風險驟然升高。因此，CYP2E1 RsaI單核苷酸多態性位點是可以用于大腸癌的遺傳檢測與風險評估。谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)屬于II相代謝酶，能促進各種親電子的化合物(包括環境致癌物及其中間代謝產物)與谷胱甘肽結合，形成易溶于水的化合物排除體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關的酶類，已知人類GSTs家族中GSTMl和GSTTl與腫瘤發生的關系最為密切。GSTMl具有present和null兩個等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指結構基因缺失的純合子，又稱為空白基因型，缺乏GSTMl酶活性。GSTTl基因多態現象與GSTMl類似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl和GSTTl酶活性可能通過促進致癌劑的親電作用及從體內的排除而保護易感組織，防止體細胞的DNA突變，而GSTMl或GSTTl基因的純和缺失可能會降低或喪失機體代謝及排出致癌物的功能，從而具有較大的腫瘤危險性。因此,GSTMl、GSTTI基因缺失可以作為大腸癌發生的重要危險因素。MTHFR 的全稱為 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH),是亞甲基四氫葉酸還原酶蛋白編碼基因。MTHFR作為一種還原酶，可將葉酸代謝通路中的5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸，從而有利于葉酸生物學功能的發揮。此外，由于葉酸代謝通路與同型半胱氨酸代謝通路耦聯，因此，MTHFR酶活性的正常發揮有利于保持血液中的同型半胱氨酸水平，不至于出現高同型半胱氨酸血癥，為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基。此外葉酸的中間代謝產物在核苷酸合成過程中也有重要的作用，通過一碳單位代謝為嘌呤環的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷將導致機體多個基礎生化途徑的紊亂，包括細胞周期調控、DNA復制、DNA甲基化修飾等，由此將引發癌癥、心腦血管等多種病癥。研究發現，MTHFR C677T單核苷酸多態性位點與大腸癌患病風險有關，當葉酸攝入和吸收水平高時，677T/T和677C/T基因型人群患大腸癌風險較低，這兩類基因型被視為大腸癌保護基因，而677C/C基因型人群在MTHFR酶耐熱性較強，不利于dUMP轉變為dTMP，容易造成DNA損傷，大腸癌發生風險明顯增強。綜上所述，鑒于CYP2E1、GSTMl、GSTTl、hMLHl和MTHFR基因與大腸癌的發生有著重要的關聯關系，可以做為預測和篩查大腸癌的潛在指征，通過對這些大腸癌易感基因的檢測，能在預測預防和指導治療大腸癌方面起到重要作用，并能大大降低大腸癌在中國人群中的發病概率。

發明內容
本發明基于CYP2E1基因上單核苷酸多態性位點RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上單核苷酸多態性位點T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present) ,MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T (rsl801133)這5個多態性位點基因型可作為評估大腸癌發病的致病因素和危險因子的基礎上，研制出一種大腸癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP2E1 RsaI (rsl051740) , hMLHl Tl 151A，GSTMl，GSTTl，MTHFRC677T(rsl801133)5個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)； PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul TaqDNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ;ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.大腸癌檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應
使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(1)CYP2E1 RsaI 正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'CYP2E1 RsaI 反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)hMLHl T1151A 正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'hMLHl Tll5IA 反向引物5/ TGTCTTATCCTCTGTGACAATG3'(3)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(5)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5 ill ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u I,ddH20 19. 175u I ；CYP2E1反應條件為94°C預變性5min，然后94°C變性30s，58°C 30s退火，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C延伸10分鐘。hMLHl反應條件為94°C預變性5min，然后94°C變性40s，55°C 40s退火，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C延伸10分鐘。GSTTU GSTMl反應條件為94°C預變性5min，然后94°C變性50s，56°C 50s退火，72°C延伸40s，32個循環后，72 °C延伸10分鐘。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物20ul，lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(1)CYP2E IRsaI 測序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'(2)hMLHl T1151A 測序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(3)GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(4)GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'
(5)MTHFR(C677T)測序引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析 熟悉DNA測序技術的本領域技術工程師能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。實施例2.篩查大腸癌風險人群的基因無創檢測服務I.無創采樣
由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔粘膜上皮細胞取樣，樣本用細胞保存液常溫保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法對采集到的口腔粘膜細胞進行DNA抽提。3.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CYP2E1基因上Rsal(rsl051740), GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present), hMLHl基因上T1151A，MTHFR基因上C677T (rsl801133)的5個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這5個SNPs位點的基因型。4.大腸癌發病高危人群生物信息學分析及風險評估通過對受檢者SNPs基因型的生物信息學分析和風險評估模型鑒定，出具大腸癌易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者CYP2E1基因上RsaI (rsl051740)，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，hMLHl基因上T1151A，MTHFR基因上C677T (rsl801133)這5個SNP位點基因檢測信息、大腸癌風險評估結果和防治方案。根據受檢者的風險等級，由醫師向受檢者詳細說明并解讀大腸癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.ー種檢測大腸癌易感基因的無創檢測試劑盒，其組成成分為檢測CYP2E1基因上單核苷酸多態性位點RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上單核苷酸多態性位點T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T(rsl801133)基因型的PCR特異引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%こ醇溶液、100%こ醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特點在于所述的特異性引物對是指針對CYP2E1基因上單核苷酸多態性位點RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上單核苷酸多態性位點T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T (rsl801133)，能特異性擴增出包含5個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特點在于所述的DNA測序引物是針對CYP2E1基因上 RsaI (rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T(rsl801133)，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述5個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其所含的5對特異性引物序列如下(1)CYP2E1RsaI 正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3; CYP2E1 RsaI 反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)hMLHl T1151A 正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3' hMLHl T1151A 反向引物5' TGTCTTATCCTCTGTGACAATG3'(3)GSTMl (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3' GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3' GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3' (5)MTHFR(C677T)正向引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3' MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的5條DNA測序引物序列如下(1)CYP2E1RsaI 測序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3;(2)hMLHl T1151A 測序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(3)GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(4)GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3' (5)MTHFR(C677T)測序引物5'GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 (1) 0 反應體系10父？0 反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶O. 75ul，10U/ul ExoI 酶0. 375ul，ddH20 3.875ul。
(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul，.100% こ醇溶液 15ul，70% こ醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測大腸癌易感基因的無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測5個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應體系、PCR產物純化體系、DNA測序反應體系等。本發明的試劑盒通過檢測與大腸癌發生密切相關的5個單核苷酸多態性位點的基因型來評估中國人群中大腸癌患病的風險級別與程度，并根據受檢者基因檢測結果從基因維度指導中國人群有針對性的預防大腸癌的發生，旨在降低大腸癌的發病概率。本發明所使用樣本為口腔粘膜脫落細胞，采用口腔無創采樣法采集樣本，該法無痛、無創、并能避免交叉感染。基因測序過程采用ABI3730型測序儀，方法簡便，結果準確，可靠，適合推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102703581SQ20121005364
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者潘加奎, 鄭俊斌 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司