專利名稱：一種產氨基甲酸乙酯脫氨酶的枯草芽孢桿菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及食品安全領域，尤其涉及一種產氨基甲酸乙酯脫氨酶的枯草芽孢桿菌菌株及其應用。
背景技術：
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)又名脲燒,屬多位點致癌物質，于2007年被 WHO 認定為 2A 級致癌物(Baan R, et al. Carcinogenicity of alcoholic beverages. The Lancet Oncology,2007,8(4) :292-293 ；E.Dybing, et al. Risk assessment of dietary exposures to compounds that are genotoxic and carcinogenic—an overview. Toxicology letters，2008，180 :110-117)。氨基甲酸乙酯曾作為醫藥和獸藥使用，后因有毒且療效欠佳而被禁止用于人類醫藥領域。氨基甲酸乙酯是食品發酵和貯藏過程中的天然產生物，廣泛存在于飲品酒類(葡萄酒、黃酒等)、酸乳酪、醬油等發酵制品中，不同的發酵食品中氨基甲酸乙酯含量不一，一般低于650 μ g/kg(Dirk ff. et al. The composition of unrecorded alcohol from eastern Ukraine Is there a toxicological concern beyond ethanol alone . Food and chemical toxicology, 2010,48 :2842-2827 ;石維妮，等.發酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量調研.中國釀造，2009，11 :124-126)。其中，酒精飲品是膳食攝入氨基甲酸乙酯的主要來源，其次為谷物類和豆類發酵食品，因此，長期飲酒的消費者是氨基甲酸乙酯受害的高危人群(EFSA. Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food chain on a request from the European Commission on ethyl carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages.The EFSA Journal 2007,551 :1-44)。現階段，各類食品中并無統一的氨基甲酸乙酯限量標準，但部分國家已制訂出酒精飲品中氨基甲酸乙酯的最高限量，如加拿大對多種酒精飲品的氨基甲酸乙酯限量從 30-400 μ g/L不等；歐盟部分成員國也制訂了相應標準；韓國于2008年頒布葡萄酒中氨基甲酸乙酯限量標準為 30 μ g/L (World Trade Organization Committee on Sanitary and Phytosanitary Measures G/SPS/N/K0R/272. 6 February 2008 ；The Korean Food and Drug Administration Advance Notice No. 2008-25 (31 January 2008))。根據氨基甲酸乙酯的形成機理，針對性地形成了一些相應的控制方法，對降低食品中的氨基甲酸乙酯含量具有一定的作用。(I)發酵原料中尿素的控制通過對發酵大米的精制或多次清洗，可以有效地降低原料中50%以上的尿素，但該方法會導致原料營養價值降低，影響發酵產品的質量。(2)工藝控制發酵過程中的溫度、PH等工藝條件均對氨基甲酸乙酯的形成有較為顯著的影響，可以通過控制相關工藝參數降低產品中氨基甲酸乙酯的含量。但由于發酵食品的風味受發酵工藝條件影響較大，該方法在實際應用時的可行性較低。(3)高性能菌株選育利用誘變和基因工程手段，獲得精氨酸酶缺陷型或表達受阻的酵母突變菌株(Heui-dong Park, et al. Antisense-mediated inhibition ofarginase(CARl) gene expression in Saccharomyces cerevisiae. J. Biosci. Bioengin., 2001,92(5) :481-484)，或通過對葡萄酒釀造中蘋果酸-乳酸發酵階段酒類酒球菌的選育， 獲得精氨酸轉化能力受阻的突變菌株(王華，等.不同酒類酒球菌蘋果酸-乳酸發酵對葡萄酒中氨基酸的影響.中國食品學報，2003，3 (4) :51-55)，均能有效地降低產品中氨基甲酸乙酯的含量。高性能基因工程菌株選育曾經也被認為是控制發酵制品中氨基甲酸乙酯形成的最好方法，但由于食品安全和生物安全性原因，基因工程菌株在食品生產過程的應用受到非常嚴格的規定，尤其是歐盟區的嚴格法律規定導致該方法在最近幾年均未有新的進展。(4)脲酶對尿素的分解脲酶可以將尿素分解為氨和CO2，在生產過程中利用脲酶控制成品酒中氨基甲酸乙酯含量是最為常用方法。國際葡萄酒組織、歐盟、美國FDA等均允許脲酶作為食品添加劑使用，因此在脲酶的生產菌株選育、發酵工藝優化、生產應用等方面都有較多研究(Marco Esti, et al. Modeling of urea degradation in white and rose wines by acid urease. J. Agric. Food Chem. , 2007, 55 :2590-2596)。我國出口黃酒均米用該方法控制氨基甲酸乙酯的含量。黃酒生產以大米為原料，成分復雜。釀造過程包括原料經蒸煮、冷淋、發酵、過濾得到黃酒原酒，黃酒原酒再經冷藏、去沉淀、勾兌、罐裝滅菌等環節得到黃酒成品，整個過程步驟較多，周期較長，因此，黃酒中的氨基甲酸乙酯形成途徑較多。利用不同方法控制黃酒釀造過程中氨基甲酸乙酯前體物質的產生，可以在一定程度上降低產品中氨基甲酸乙酯的含量，但不可能將多種不同控制方法同時應用于同一批次的黃酒生產中，因此產品中氨基甲酸乙酯含量通常較高。而采用單一的源頭控制方法只能部分降低體系中氨基甲酸乙酯的含量，很難有效降低甚至完全清除產品中的氨基甲酸乙酯。

發明內容
本發明提供了一種產氨基甲酸乙酯脫氨酶的枯草芽孢桿菌菌株，用于制備可快速、高效降解黃酒中氨基甲酸乙酯的氨基甲酸乙酯脫氨酶。一種產氨基甲酸乙酯脫氨酶的枯草芽孢桿菌菌株，命名為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)ZJ09，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2012年2月10日，保藏編號為CCTCC M 2012012。該菌株為從土壤中分離、篩選得到的，經鑒定為枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌ZJ09的生理生化特性為能分解淀粉，可以利用檸檬酸鈉為碳源， 可以利用硝酸鈉為能源；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖發酵產酸；能水解酪朊和明膠；接觸酶反應和V-P反應陽性。細胞直桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢橢圓；平板培養基上菌落略皺縮。本發明提供了一種利用上述枯草芽孢桿菌菌株制備氨基甲酸乙酯脫氨酶的方法， 包括將經活化的枯草芽孢桿菌ZJ09接種到含氨基甲酸乙酯的液體培養基中進行發酵培養；發酵完成后，從發酵液中分離純化得到氨基甲酸乙酯脫氨酶。所述的氨基甲酸乙酯在液體培養基中的質量百分比濃度優選為0. 5-1. 5% ;更優選為1.0%。采用不添加氨基甲酸乙酯的培養基進行菌株發酵，檢測不到氨基甲酸乙酯脫氨酶的產生。在液體培養基中添加適量的氨基甲酸乙酯能誘導菌株代謝生成氨基甲酸乙酯脫
4氨酶，實驗發現，當氨基甲酸乙酯濃度為O. 5-1. 5%時，單位體積發酵液中氨基甲酸乙酯脫氨酶的酶活較高；特別地，當濃度為I. 0%時酶活最高。但過高濃度的氨基甲酸乙酯會引起發酵液體系PH值上升，影響菌體生長，使氨基甲酸乙酯脫氨酶的產生受到影響。以體積IL計，所述的液體培養基由以下組分組成葡萄糖14_16g，酵母膏5_6g，蛋白胨7-8g，玉米漿7-9g，磷酸二氫鉀l_2g，硫酸鎂O. 6-1. Og,氨基甲酸乙酯5_15g，余量為水。該配方組分的液體培養基能為枯草芽孢桿菌ZJ09提供菌體生長和氨基甲酸乙酯脫氨酶產生所需要的營養成分，其中葡萄糖是主要的碳源；酵母膏和蛋白胨提供氮源，并含有一定量的生長因子；玉米漿含有豐富的維生素和生長因子；磷酸二氫鉀和硫酸鎂提供菌體生長所需的磷、硫、鉀和鎂等元素。所述的發酵培養溫度優選為36_38°C，利于菌體生長。所述的發酵培養時間優選為45_50h，單位體積發酵液中氨基甲酸乙酯脫氨酶的酶活最高。根據枯草芽孢桿菌ZJ09的生長曲線，發酵培養到36-40h時，菌體含量達到最高; 再經9-10h，發酵液中氨基甲酸乙酯脫氨酶產量達到最高。所述的分離純化為對發酵液依次進行鹽析、離子交換層析和膜濃縮處理，再經冷凍干燥，制得凍干粉。依序進行多步分離純化，能得到純度較高的氨基甲酸乙酯脫氨酶，且在操作過程中氨基甲酸乙酯脫氨酶損失較少，活性保持較好；同時，將氨基甲酸乙酯脫氨酶制成凍干粉，不但能延長甲酸乙酯脫氨酶的保質期，而且也便于在使用時定量控制其用量。本發明還提供了一種采用上述方法制得的氨基甲酸乙酯脫氨酶，該酶酶活較高， 能降解黃酒中的氨基甲酸乙酯。本發明還提供了上述氨基甲酸乙酯脫氨酶在降解黃酒中氨基甲酸乙酯中的應用， 包括(I)取經冷藏的黃酒原酒；(2)將氨基甲酸乙酯脫氨酶加入黃酒原酒中，進行酶解反應；(3)去除沉淀。在冷藏后的黃酒原酒中，含有大量的氨基甲酸乙酯，此時加入氨基甲酸乙酯脫氨酶對其進行酶解處理，不需要新增其他設備，操作工藝簡單。經過酶解反應，可以降解黃酒中的氨基甲酸乙酯；且處理結束后可繼續原有的生產工藝過程，即去沉淀、勾兌、罐裝滅菌等，去沉淀時可同時除去酶解過程中產生的部分不溶物，不會影響黃酒產品的風味，同時產品中氨基甲酸乙酯的清除率可達95%以上。優選地，所述的酶解反應溫度為18_25°C，酶解反應時間為ll_13h ;更優選地，所述的酶解反應溫度為25°C，酶解反應時間為12h。根據黃酒原有生產工藝，冷藏結束后，室溫放置不能超過24h，否則會影響原有生產方案的運行和產品質量；該酶解條件下，最有利于對黃酒中氨基甲酸乙酯的充分酶解，且符合實際生產的需要。所述氨基甲酸乙酯脫氨酶的加入量優選為O. 05-0. 15kg/l噸黃酒原酒；更優選為 O. lkg/Ι噸黃酒原酒。該加量條件下既能保證其與黃酒釀造過程中產生的氨基甲酸乙酯充分反應，又不會浪費氨基甲酸乙酯脫氨酶。本發明的枯草芽孢桿菌ZJ09在合適的培養條件下可代謝生成氨基甲酸乙酯脫氨酶，以該酶在黃酒冷藏處理后加入黃酒原酒中，能直接酶解黃酒釀造過程中產生的總氨基甲酸乙酯，實現快速、高效地降低黃酒產品中氨基甲酸乙酯的含量。試驗證明，采用本發明方法制得的黃酒產品，其氨基甲酸乙酯的含量低于30yg/L，顯著提高了黃酒產品的安全性。本發明方法操作方便，不受氨基甲酸乙酯形成途徑的限制，處理方式簡單易行。
具體實施例方式實施例I枯草芽孢桿菌ZJ09的分離和鑒定利用選擇性培養基從嘉興學院校園土壤中分離氨基甲酸乙酯降解菌，該選擇性培養基的組分為葡萄糖10g，氨基甲酸乙酯IOgJK IOOOmL ;固體培養基另加酚紅lg，瓊脂 20g。將土壤樣品Ig加入到IOOOmL的上述液體選擇性培養基中，28°C恒溫振蕩培養，每隔 3d取樣一次，涂布于上述選擇性培養基的固體平板上，挑取菌落周圍變紅菌株進行純化，然后利用其進行氨基甲酸乙酯降解測定。經分離、篩選，獲得I株具有較強氨基甲酸乙酯降解能力的菌株，編號ZJ09。對降解產物進行GC-MS分析，發現該菌降解氨基甲酸乙酯的原因在于其可以產生氨基甲酸乙酯脫氨酶，進而將氨基甲酸乙酯降解為氨和甲酸乙酯。該菌株的生理生化特性為能分解淀粉，可以利用檸檬酸鈉為碳源，可以利用硝酸鈉為能源；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖發酵產酸；能水解酪朊和明膠; 接觸酶反應和V-P反應陽性。細胞直桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢橢圓；平板培養基上菌落略皺縮。經鑒定,該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌株在合適的培養條件下可代謝生成氨基甲酸乙酯脫氨酶。將該菌株保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏日期為2012年2月10日，保藏編號為CCTCC M 2012012。實施例2氨基甲酸乙酯脫氨酶的發酵枯草芽孢桿菌ZJ09的種子培養基牛肉膏7. 5g，蛋白胨15g，磷酸二氫鉀3. 5g，硫酸鎂 O. 5g，氯化鈉 4. 5g，葡萄糖 25g，水 IOOOmL, pH 7.0,121°C滅菌 30min。氨基甲酸乙酯脫氨酶的發酵培養基葡萄糖15g，酵母膏5. 5g，蛋白胨7. 5g，玉米漿8. 0g，磷酸二氫鉀I. 5g，硫酸鎂O. Sg，氨基甲酸乙酯IOgjjC IOOOmL, pH 7.0，121°C滅菌 30mino將活化好的枯草芽孢桿菌ZJ09斜面菌種適量接入裝有50mL液體種子培養基的 250mL三角瓶中，于37°C恒溫培養，搖床轉速為200rpm。48h后取上述液體菌種IOmL接入新鮮的發酵培養基，培養條件同種子發酵，當單位體積發酵液中氨基甲酸乙酯脫氨酶比活力達到10U/mL以上時中止發酵。將上述發酵液6000rpm離心20min去除菌體，所得上清液即為氨基甲酸乙酯脫氨酶的粗酶液。氨基甲酸乙酯脫氨酶酶活定義lmin內轉化氨基甲酸乙酯I μ mol,即酶活單位數為IU0實施例3氨基甲酸乙酯脫氨酶的純化(I)鹽析取含氨基甲酸乙酯酶的上清液，40% 50%飽和度硫酸銨分級鹽析，沉淀經pH 7. 2,0. 05mol/LTris-HCl緩沖液透析脫鹽；酶液的氨基甲酸乙酯脫氨酶比活力為 500U/mL，濃縮倍數為50，回收率為85%。⑵離子交換層析透析液過Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱,先用pH7. 2，lOmmol/LTris-HCl緩沖液平衡柱子，再用相同緩沖液配制的Omol/L O. 5mol/L的 NaCl梯度洗脫，流速為O. 4mL/min，收集含氨基甲酸乙酯脫氨酶的洗脫峰。(3)膜濃縮對收集的酶液用截斷分子量為5000的膜柱濃縮至氨基甲酸乙酯脫氨酶比活力為10000U/mL，濃縮倍數為20，回收率為90%。(4)冷凍干燥對膜濃縮后的酶液進行冷凍干燥，得到高純度的氨基甲酸乙酯脫氨酶凍干粉。酶粉的氨基甲酸乙酯脫氨酶活力為50000U/g。實施例4黃酒中氨基甲酸乙酯的酶法降解(I)原料經蒸煮、冷淋、發酵、過濾、冷藏等工藝過程后，得到黃酒原酒；(2)向黃酒原酒中加入氨基甲酸乙酯脫氨酶凍干粉，加入后混合均勻，于25°C反應12h ;其中，每噸黃酒原酒中加入的酶量為0. Ikg ；(3)酶解反應完成后，對黃酒原酒進行去沉淀、勾兌、灌裝滅菌等工藝過程，制得黃酒成品酒。對比例I不進行步驟(2)，按照步驟(I)和(3)的操作釀造黃酒。采用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)檢測黃酒成品酒中氨基甲酸乙酯的含量，結果顯示，本實施例4制得的成品酒中氨基甲酸乙酯含量為25μ g/kg ;對比例I制得的成品酒中氨基甲酸乙酯含量為353 μ g/kg。可見，采用枯草芽孢桿菌ZJ09代謝生成的氨基甲酸乙酯脫氨酶對黃酒原酒進行酶解處理，能有效降低成品酒中氨基甲酸乙酯的含量。
權利要求
1.一種產氨基甲酸乙酯脫氨酶的枯草芽孢桿菌菌株，其特征在于，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZJ09，保藏號為 CCTCC M 2012012。
2.一種利用如權利要求I所述的枯草芽孢桿菌菌株制備氨基甲酸乙酯脫氨酶的方法， 其特征在于，包括將經活化的枯草芽孢桿菌ZJ09接種到含氨基甲酸乙酯的液體培養基中進行發酵培養；發酵完成后，從發酵液中分離純化得到氨基甲酸乙酯脫氨酶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的氨基甲酸乙酯在液體培養基中的質量百分比濃度為O. 5-1. 5%。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，以體積IL計，所述的液體培養基由以下組分組成葡萄糖14-16g，酵母膏5-6g，蛋白胨7-8g，玉米漿7-9g，磷酸二氫鉀l_2g，硫酸鎂·O.6-1. 0g，氨基甲酸乙酯5-15g，余量為水。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的發酵培養溫度為36-38°C，發酵培養時間為45-50h。
6.一種采用如權利要求2-5任一所述的方法制得的氨基甲酸乙酯脫氨酶。
7.如權利要求6所述的氨基甲酸乙酯脫氨酶在降解黃酒中氨基甲酸乙酯中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，包括(1)取經冷藏的黃酒原酒；(2)將如權利要求6所述的氨基甲酸乙酯脫氨酶加入黃酒原酒中，進行酶解反應；(3)去除沉淀。
9.根據權利要求8的所述的應用，其特征在于所述的酶解反應溫度為18-25°C，酶解反應時間為ll_13h。
10.根據權利要求8的所述的應用，其特征在于所述氨基甲酸乙酯脫氨酶的加入量為·O.05-0. 15kg/l噸黃酒原酒。
全文摘要
本發明公開了一種產氨基甲酸乙酯脫氨酶的枯草芽孢桿菌菌株及其應用。該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZJ09，保藏號為CCTCC M 2012012。其在合適的培養條件下可代謝生成氨基甲酸乙酯脫氨酶，以該酶在黃酒冷藏處理后加入黃酒原酒中，能直接酶解黃酒釀造過程中產生的總氨基甲酸乙酯，從而實現快速、高效地降低黃酒產品中氨基甲酸乙酯的含量，顯著提高了黃酒產品的安全性。本發明方法操作方便，不受氨基甲酸乙酯形成途徑的限制，處理方式簡單易行。
文檔編號C12N1/20GK102586159SQ201210065608
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者李加友, 毛怡俊, 毛楷林 申請人:嘉興學院