專利名稱：一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法。
背景技術：
豆醬發酵過程中真菌種類繁多，這些真菌對豆醬發酵產生很大影響，可以改變豆醬發酵速度和產品風味，甚至會導致發酵失敗。摸清豆醬發酵過程中真菌的多樣性，對于實現豆醬工業化生產具有重要意義。但是現有對豆醬發酵過程中真菌種類及數量的研究中， 多以傳統分離培養方法，即形態鑒定結果為主，傳統的活菌計數方法局限于可培養的微生物，而很多微生物是不可培養的，因此丟失了許多不可培養微生物的信息。另外，傳統分離培養方法工作量大，在對微生物菌群進行培養時，主觀性比較強，不可避免地會造成菌株的富集或衰減，即人為改變了原始菌群的菌群構成，對研究結果造成的偏差較大。這就給客觀認識微生物的存在狀況造成了嚴重地障礙。

發明內容
本發明是要解決傳統的檢測豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法工作量大，檢測結果不準確的問題，提供一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法。本發明檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，按以下步驟進行一、稱取 IOg豆醬樣品，加入到50mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液中用移液器吹打至懸浮，再加入玻璃珠，振蕩5min,然后于200r/min離心5min,收集上清液；二、將沉淀用O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗漆，然后于200r/min離心5min,收集上清液,重復此步驟3次；三、合并步驟一和步驟二獲得的上清液，于9000r/min離心12min,棄上清,收集沉淀X,將沉淀X用5mL O. ImoI/ L的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，得洗凈的菌體，向洗凈的菌體中加入8mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液用移液器吹打至懸浮，振蕩均勻，得預處理的樣品；四、按照真菌DNAout說明書抽提預處理的樣品中的真菌基因組DNA ;五、以真菌基因組DNA為模板進行第一次PCR擴增，將第一次PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物A ； 六、將產物A稀釋100倍，以稀釋后的產物A為模板進行第二次PCR擴增，將第二次PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物B ;七、以產物B 作為上樣樣品，使用變性梯度凝膠電泳裝置進行電泳，凝膠變性梯度范圍為40% 70%，電泳電壓為130V，電泳時間為6h，即完成檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性；其中步驟三中第一次 PCR 擴增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列為 5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’， 下游引物nu-SSU-1536序列為5 ’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3，;步驟四中第二次PCR擴增所用上游引物nu-SSU-0817序列為5’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’，下游引物 nu-SSU-1196 序列為 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。本發明的優點待檢測的豆醬樣品不僅含有微生物細胞，還含有多種有機物質和無機鹽，這些雜質會對DNA后續分析產生巨大影響。因此本發明采用間接法提取豆醬樣品中總DNA，即先經過梯度離心、洗滌等步驟去除豆醬樣品中的雜質，然后再收集細胞并裂解細胞。這種對樣品預處理的方法所提取的總DNA的量具有較好的穩定性。本發明方法可以將不可培養微生物及數量極少的微生物都檢測出來，使檢測結果更加準確。可以在無需對菌種培養分離的情況下，對成分復雜的發酵樣品直接取樣進行分析，使試驗過程簡單便捷。而且該方法的靈敏度高、可重復性和可靠性好，能全面的反應菌群結構多樣性。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，按以下步驟進行一、稱取IOg豆醬樣品，加入到50mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液中用移液器吹打至懸浮，再加入玻璃珠，振蕩5min,然后于200r/min離心5min,收集上清液；二、 將沉淀用O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗漆，然后于200r/min離心5min,收集上清液，重復此步驟3次，三、合并步驟一和步驟二獲得的上清液，于9000r/min離心12min,棄上清，收集沉淀X，將沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，得洗凈的菌體，向洗凈的菌體中加入8mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液用移液器吹打至懸浮，振蕩均勻，得預處理的樣品；四、按照真菌DNAout說明書抽提預處理的樣品中的真菌基因組DNA;五、 以真菌基因組DNA為模板進行第一次PCR擴增，將第一次PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物A ;六、將產物A稀釋100倍，以稀釋后的產物A為模板進行第二次PCR擴增，將第二次PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物B;七、以產物B作為上樣樣品，使用變性梯度凝膠電泳裝置進行電泳，凝膠變性梯度范圍為40% 70%，電泳電壓為130V， 電泳時間為6h，即完成檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性；其中步驟三中第一次PCR 擴增所用上游弓I物nu-SSU-0817序列為5 ’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1536序列為5’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’ ；步驟四中第二次PCR擴增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列為 5 ’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1196 序列為 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。本實施方式所述O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液的pH值為7. O。步驟四所述真菌DNAout購買自天澤基因工程有限公司，產品編號為60304-50。本實施方式所用膠回收試劑盒為上海華舜生物工程有限公司的DNA膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中將沉淀X用 5mL0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌的方法具體為向沉淀X中加入5mL 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液，然后用移液器吹打至懸浮，于9000r/min離心lOmin。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟五中第一次 PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量
真菌基因組DNA5.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-15365.0μ
IOx Taq Buffer5.0μ
2.5mM dNTP Mixture4.0 μ
25mM MgCl25.0μ
5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ
無菌水20.0μ PCR擴增條件為94°C預變性2min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共 35個循環，再72 °C延伸7min，4°C保溫。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟六中第二次PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成
成分用量
稀釋后的產物A5.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-11965.0μ
IOx Taq Buffer5.0μ
2.5mM dNTP Mixture4.0 μ
25mM MgCl25.0μ
5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ
無菌水20.0μ PCR擴增條件為94°C預變性2min，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共 30個循環，再72 °C延伸7min，4°C保溫。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，按以下步驟進行一、稱取IOg豆醬樣品，加入到50mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液中用移液器吹打至懸浮，再加入玻璃珠，振蕩5min,然后于200r/min離心5min,收集上清液；二、 將沉淀用O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗漆,然后于200r/min離心5min,收集上清液,重復此步驟3次；三、合并步驟一和步驟二獲得的上清液，于9000r/min離心12min,棄上清， 收集沉淀X，將沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，得洗凈的菌體，向洗凈的菌體中加入8mL 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液用移液器吹打至懸浮，振蕩均勻，得預處理的樣品；四、按照真菌DNAout說明書抽提預處理的樣品中的真菌基因組DNA;五、以真菌基因組DNA為模板進行第一次PCR擴增，將第一次PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物A ;六、將產物A稀釋100倍，以稀釋后的產物A為模板進行第二次PCR擴增，將第二次PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物B ;七、以產物B作為上樣樣品，使用變性梯度凝膠電泳裝置(美國CBS公司生產的2401DGGE電泳裝置)進行電泳，先清洗玻璃板， 自然風干后，在安裝好膠外套墊圈的DGGE電泳裝置中用GM-40梯度灌膠器進行制膠，丙烯酰胺濃度為8. 0% (體積)，并根據實驗需要插入16孔的梳子，將膠置于45°C烘箱中聚合40min，在DGGE電泳裝置中倒入IXTAE電泳緩沖液，拔出梳子，固定膠板后，將膠板盒浸入預熱至60°C的電泳緩沖液箱里，將循環的流通管與電泳槽連接好，用電泳緩沖液沖洗上樣孔，并加滿電泳槽的上槽，打開熱循環攪拌器進行Buffer循環，50V恒壓預電泳約30min，凝膠變性梯度范圍為40% 70%，電泳電壓為130V，電泳時間為6h，銀染檢測，掃描照相，即完成檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性；其中步驟三中第一次PCR 擴增所用上游弓I物nu-SSU-0817序列為5 ’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1536序列為5’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’ ；步驟四中第二次PCR擴增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列為 5 ’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1196 序列為 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。步驟三中將沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌的方法具體為向沉淀 X中加入5mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液，然后用移液器吹打至懸浮，于9000r/min離心 IOmin0步驟五中第一次PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成
成分用量
真菌基因組DNA5.0μ
I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ
Iμιηο /μ 引物 nu-SSU-15365.0μ
IOx Taq Buffer5.0μ
2.5 mM dNTP Mixture4.0 μ
25mM MgCl25.0μ
5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ
無菌水20.0μ PCR擴增條件為94°C預變性2min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共 35個循環，再72 °C延伸7min，4°C保溫。步驟六中第二次PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量
稀釋后的產物A5.0|iL
1 (j_mol/[xL 引物 nu-SSU-08175.0|iL
l(j_mol/[jL 引物 nu-SSU-11965.0|iL
10x Taq Buffer5.0|iL
2.5mM dNTP Mixture4.0|iL
25mM MgCl25.0|iL
5U/[xL Taq 酶1.0|iL
無菌水20.0|iLPCR擴增條件為94°C預變性2min，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共 30個循環，再72 °C延伸7min，4°C保溫。本實施方式所述0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液的pH值為7. 0。步驟四所述真菌DNAout購買自天澤基因工程有限公司，產品編號為60304-50。本實施方式所用膠回收試劑盒為上海華舜生物工程有限公司的DNA膠回收試劑 盒(Gel Extraction Mini Kit)。本實施方式獲得的DGGE (變性梯度凝膠電泳)圖譜條帶清晰，無堆積現象，分離效 果較好。本實施方式所采用的傳統發酵豆醬樣品采集于齊齊哈爾市拜泉縣，在豆醬發酵階 段，采用本實施方式的方法可檢測到9種真菌,包括擴張青霉(Penicillium expansum)、米 曲霉(Aspergillus oryzae)、大毛霉(Phycomycetes)、普通青霉(Penicillium commune) > 犁頭霉(Absidia)、總狀毛霉(Mucor racemosus)、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、 曲霉(Aspergillus)和一種不可培養的真菌，且多組平行實驗結果相同。同樣的傳統發 酵豆醬樣品采用傳統分離培養方法只分離出來4種真菌,米曲霉(Aspergillus oryzae)、 大毛霉(Phycomycetes)、普通青霉(Penicillium commune)和擴張青霉(Penicillium expansum)，實驗結果說明本實施方式的方法靈敏度更高，檢測結果更加準確，可以檢測出 不可培養微生物或數量極少的微生物，能更全面的反應菌群結構多樣性。
權利要求
1.一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，其特征在于檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，按以下步驟進行一、稱取IOg豆醬樣品，加入到50mL O. Imol/ L的磷酸鹽緩沖液中用移液器吹打至懸浮，再加入玻璃珠，振蕩5min，然后于200r/min離心5min,收集上清液；二、將沉淀用O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗漆，然后于200r/min離心5min，收集上清液，重復此步驟3次；三、合并步驟一和步驟二獲得的上清液，于9000r/ min離心12min,棄上清,收集沉淀X,將沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗漆3次， 得洗凈的菌體，向洗凈的菌體中加入8mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液用移液器吹打至懸浮， 振蕩均勻，得預處理的樣品；四、按照真菌DNAout說明書抽提預處理的樣品中的真菌基因組DNA ;五、以真菌基因組DNA為模板進行第一次PCR擴增，將第一次PCR擴增產物用I % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物A ;六、將產物A稀釋100 倍，以稀釋后的產物A為模板進行第二次PCR擴增，將第二次PCR擴增產物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，得產物B ;七、以產物B作為上樣樣品，使用變性梯度凝膠電泳裝置進行電泳，凝膠變性梯度范圍為40% 70%，電泳電壓為130V， 電泳時間為6h，即完成檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性；其中步驟三中第一次PCR 擴增所用上游弓I物nu-SSU-0817序列為5 ’ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1536序列為5’ -ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3’ ；步驟四中第二次PCR擴增所用上游引物 nu-SSU-0817 序列為 5 ’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ’，下游引物 nu-SSU-1196 序列為 5’ -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’。
2.根據權利要求I所述的一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，其特征在于步驟三中將沉淀X用5mL O. lmol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌的方法具體為向沉淀X中加入 5mL 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液,然后用移液器吹打至懸浮,于9000r/min離心lOmin。
3.根據權利要求I所述的一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，其特征在于步驟五中第一次PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量真菌基因組DNA5.0μ Iμιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ Iμιηο /μ 引物 nu-SSU-15365.0μ IOx K/g Buffer5.OpL2.5mM dNTP Mixture4.0μ 25mM MgCl25.0μ 5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ 無菌水20.0μ PCR擴增條件為94°C預變性2min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共35個循環，再72*€延伸保溫。
4.根據權利要求I所述的一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，其特征在于步驟六中第二次PCR擴增的反應體系為50 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量稀釋后的產物A5.0μ I μιηο /μ 引物 nu-SSU-08175.0μ I μιηο /μ 引物 nu-SSU-11965.0μ 10χ K/g Buffer5.OpL.2.5mM dNTP Mixture4.0μ .25mM MgCl25.0μ .5υ/μ Taq 酶Ι.Ομ 無菌水20.0μ PCR擴增條件為94°C預變性2min，94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共30個循環，再72*€延伸保溫。
全文摘要
一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法，涉及一種檢測傳統豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法。是要解決傳統的檢測豆醬發酵過程中真菌多樣性的方法工作量大，檢測結果不準確的問題。方法稱取豆醬樣品，加入到磷酸鹽緩沖液中懸浮，再加入玻璃珠振蕩，離心，收集上清液；將沉淀洗滌，離心，收集上清液；離心棄上清，將沉淀用洗滌，得菌體，向菌體中加磷酸鹽緩沖液吹打至懸浮，振蕩，得預處理的樣品；抽提預處理的樣品中的真菌基因組DNA；PCR擴增得產物A；將產物A稀釋，PCR擴增得產物B；以產物B作為上樣樣品，使用變性梯度凝膠電泳裝置進行電泳，即完成。本發明方法簡單、靈敏度高、可重復性和可靠性好，全面反應菌群結構多樣性。
文檔編號C12Q1/68GK102586453SQ20121006553
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者凌宏志, 宋剛, 柴洋洋, 葛菁萍, 趙丹, 陳麗, 高冬妮 申請人:黑龍江大學