專利名稱：微生物發酵生產乳酸脫氫酶的方法
技術領域：
本項目涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種微生物發酵生產乳酸脫氫酶方法。該方法生產的乳酸脫氫酶主要應用于臨床白血病、心肌梗塞診斷，以及肺癌、淋巴瘤、卵巢癌等多種腫瘤的早期診斷和療效判斷，是生產丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒的主要原料，可以作為食品添加劑用于發酵奶制品、腌潰品、糖果制品和飲料的生產。
背景技術：
乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, EC111. 27,簡寫為LDH)是生物體糖酵解過程中重要的氧化還原酶(Ellen, Microbiological Reviews, 1980)。LDH普遍存在于動物、 植物及微生物。基于血清LDH活性水平可以反映富含LDH細胞的增殖、代謝等生物學性狀，LDH作為臨床診斷試劑被廣泛應用(張之南，血液病診斷與療效標準，1998)。目前主要應用是臨床白血病、心肌梗塞診斷，肺癌、淋巴瘤、卵巢癌等多種腫瘤的早期診斷和療效判斷，生產丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒的主要原料，作為食品添加劑用于發酵奶制品、腌潰品、糖果制品和飲料生產(王翰林，實用預防醫學，2010 ;石軒峰等，河南工業大學學報，2005)。早期生產LDH的方法是從動物臟器尤其是心肌和骨骼肌中提取，但很難得到純度較高的LDH，而通過微生物發酵法則容易制得，目前我國微生物發酵生產LDH處于菌種選育、發酵條件優化、酶分離純化、基因克隆及表達等研究階段(朱勇，食品與發酵工業，2006 ;楊海麟等，工業微生物，2005)。雖然關于微生物發酵生產LDH的報道較多，但LDH產量較低，我國目前醫用LDH主要依靠進口，LDH產業化、規模化微生物發酵生產還未見報道。由于動物臟器組織中酶系復雜，生物活性物質變化較大，難以提取高純度的乳酸脫氫酶。利用微生物發酵生產LDH比從動物組織中提取更容易制得純度高的乳酸脫氫酶，發酵生產工藝簡單，提取步驟相對簡易，酶的純化工藝穩定，生產不受原料來源影響，更適用于批量生產，且微生物發酵生產的LDH在醫用診斷、檢測精密度上要高于其他方法生產的LDH(蘇虹等，吉林大學學報，2006)。因此，微生物發酵生產乳酸脫氫酶具有廣闊的開發潛力和應用前
旦
o技術內容本發明的目的是提供一種微生物發酵生產乳酸脫氫酶的方法，該方法主要是微生物經過產物定向馴化后，在26 32°C液體發酵生產乳酸脫氫酶的方法，這種生產方法獲得的乳酸脫氫酶粗酶液活性可以達到120U/mL，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該方法生產的LDH操作簡單、方便、快捷、成本低，可以從根本上避免動物組織提取的繁瑣工藝和昂貴設備。本發明所述的一種微生物發酵生產乳酸脫氫酶的方法具體包括以下步驟(I)將產生乳酸脫氫酶的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32 °C生長良好；(2)按常規方法將產物定向馴化后的乳酸脫氫酶產生菌在26 32°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的4 10%接種量接入液體發酵培養基中，在26 32°C培養60 114h時，即微生物發酵生產乳酸脫氫酶結束；(4)將(3)的發酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為乳酸脫氫酶粗酶液；(6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。乳酸脫氫酶生產菌(CGCMM菌種編號1. 557或I. 1856)先活化、定向馴化后，按本發明產酶條件發酵生產乳酸脫氫酶，馴化后的菌株在4°C環境中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在-80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養基制備①菌種活化培養基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,瓊脂16. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌株產物定向馴化培養基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏
3.0 6. Og,丙酮酸0. 2 0. 7mL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養基蛋白胨8 12g,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,KH2PO4 I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 1.5g，自來水 I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。④發酵產酶培養基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米漿12. 5 16. 5mL，KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸銨I. 5 5. Og,丙酮酸0. 2 0. 6mL，吐溫80 1.5 4.5mL，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生乳酸脫氫酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好；(3)按常規方法將產物定向馴化后的乳酸脫氫酶產生菌在26 32°C培養36 60h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的4 6%接種量接入IOL液體發酵培養基中，在26 28°C培養96 114h時，即微生物發酵生產乳酸脫氫酶結束；(5)將(4)的發酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(6)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為乳酸脫氫酶粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。實施例二 (I)培養基制備①菌種活化培養基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,瓊脂16. Og,蒸餾水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌株產物定向馴化培養基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. 0 6. Og,丙酮酸0. 2 0. 7mL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養基蛋白胨8 12g,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,KH2PO4 I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 1.5g，自來水 I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。 ④發酵產酶培養基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米漿12. 5 16. 5mL，KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸銨I. 5 5. Og,丙酮酸0. 2 0. 6mL，吐溫80 1.5 4.5mL，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生乳酸脫氫酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好；(3)按常規方法將產物定向馴化后的乳酸脫氫酶產生菌在26 32°C培養36 60h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的6 8%接種量接入50L液體發酵培養基中，在28 30°C培養78 96h時，即微生物發酵生產乳酸脫氫酶結束；(5)將⑷的發酵液6，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(6)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為乳酸脫氫酶粗酶液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。實施例三(I)培養基制備①菌種活化培養基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,瓊脂16. Og,蒸懼水
I.0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌株產物定向馴化培養基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. 0 6. Og,丙酮酸0. 2 0. 7mL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。③液體種子培養基蛋白胨8 12g,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,KH2PO4 I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 1.5g，自來水 I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。④發酵產酶培養基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米漿12. 5 16. 5mL，KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸銨I. 5 5. Og,丙酮酸0. 2 0. 6mL，吐溫80 1.5 4.5mL，自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生乳酸脫氫酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好；
(3)按常規方法將產物定向馴化后的乳酸脫氫酶產生菌在26 32°C培養36 60h而后按5 8%的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的8 10%接種量接入100L液體發酵培養基中，在30 32°C培養60 78h時，即微生物發酵生產乳酸脫氫酶結束；(5)將(4)的發酵液6，000 8，OOOrpm離心收集菌體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；(6)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為乳酸脫氫酶粗酶液；

(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
權利要求
1.一種微生物發酵生產乳酸脫氫酶的方法，其包括以下步驟 (1)將產生乳酸脫氫酶的微生物進行6 10次活化，再經過產物定向馴化4 6次，使其在26 32°C環境條件下生長良好； (2)按常規方法將產物定向馴化后的乳酸脫氫酶產生菌在26 32°C逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子； (3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的4 10%接種量接入液體發酵培養基中，在26 32°C培養60 114h時，即微生物發酵生產乳酸脫氫酶結束； (4)將(3)的發酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀； (5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm離心,收集到的上清為乳酸脫氫酶粗酶液； (6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據權利要求I所述的方法，在步驟(6)之后進一步包括將步驟(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中菌種定向馴化培養基、液體種子培養基、產酶培養基分別為 (1)菌株產物定向馴化培養基葡萄糖2.5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. 0 .6. Og,丙酮酸0. 2 0. ImL,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(2)液體種子培養基蛋白胨8 12g，酵母膏I.5 3. 5g，葡萄糖2. 5 8. 0g, KH2PO4I. 5 2. 5g，K2HPO4 0.5 I. 5g,自來水I. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發酵產酶培養基葡萄糖6.5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. 0 6. 5g,玉米漿 12. 5 16. 5mL, KH2PO4 2. 5 6. Og,乙酸銨 I. 5 5. Og,丙酮酸 0. 2 0. 6mL,吐溫 80I. 5 4. 5mL,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產乳酸脫氫酶的方法是將產生乳酸脫氫酶的微生物進行6～10次活化，再經過產物定向馴化4～6次，使其在26～32℃環境條件下生長良好；按常規方法將產物定向馴化后的乳酸脫氫酶產生菌在26～32℃逐級擴大培養，按發酵液體積的4～10％接種量接入液體發酵培養基中，在26～32℃培養60～114h時，即微生物發酵生產乳酸脫氫酶結束；發酵液在6,000～8,000rpm離心收集菌體，數次洗滌后收集沉淀，懸浮于緩沖液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm離心收集上清即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/04GK102653734SQ20121010689
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者張慶芳, 石淑鈺, 遲乃玉 申請人:大連大學