植物耐逆性相關(guān)蛋白TaPK及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaPK及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因TaPK在低溫、高鹽和高溫的誘導(dǎo)下表達，且將TaPK基因?qū)霐M南芥中得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其對以上三種逆境的抗性高于野生型擬南芥，本發(fā)明提供的蛋白和基因為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物中發(fā)揮重要的作用。
【專利說明】植物耐逆性相關(guān)蛋白TaPK及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaPK及其編碼基因和應(yīng)用。【背景技術(shù)】
[0002]干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應(yīng)答與信號傳導(dǎo)機制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務(wù)之一。
[0003]在逆境脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對逆境的反應(yīng)機制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應(yīng)能力。
[0004]在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平上做出相應(yīng)的調(diào)整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導(dǎo)表達，這些基因的產(chǎn)物不僅能夠直接參與植物的脅迫應(yīng)答，而且能夠調(diào)節(jié)其它相關(guān)基因的表達或參與信號傳導(dǎo)途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關(guān)的基因產(chǎn)物可以分為兩大類:第一類基因編碼的產(chǎn)物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應(yīng)答的基因產(chǎn)物;第二類基因編碼的產(chǎn)物包括參與脅迫相關(guān)的信號傳遞和基因表達調(diào)節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等。其中，蛋白激酶在植物脅迫信號的感知、傳遞的調(diào)控中起著重要作用。
[0005]到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶約有300種左右，分子內(nèi)都存在一個同源的由約270氨基酸殘基構(gòu)成的催化結(jié)構(gòu)區(qū)。在細胞信號傳導(dǎo)、細胞周期調(diào)控等系統(tǒng)中，蛋白激酶形成了縱橫交錯的網(wǎng)絡(luò)。這類酶催化從ATP轉(zhuǎn)移出磷酸并共價結(jié)合到特定蛋白質(zhì)分子中某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性。
[0006]目前，在植物中已知的與脅迫相關(guān)的蛋白激酶主要有:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶如 MAPK (mitogen-activated protein kinase), CDPK (calcium-dependent proteinkinase);酪氨酸蛋白激酶如Src家族、Tec家族、ZAP70、家族、JAK家族；還有一種絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸雙特異性蛋白激酶，如DYRK相關(guān)的蛋白激酶，CDC25等。這三類蛋白激酶均有文獻報道參與植物相應(yīng)外界環(huán)境脅迫的信號傳導(dǎo)過程，提高植物對外界逆境的適應(yīng)能力。
[0007]根據(jù)蛋白激酶的磷酸化氨基酸殘基的種類，蛋白激酶可以分為Ser/Thr蛋白激酶，Tyr蛋白激酶以及雙特異性Ser/Thr/Tyr蛋白激酶。Ser/Thr蛋白激酶主要包括MAPK，CDPK，JNK等。這種類型的蛋白激酶目前研究的較多，并且在信號傳導(dǎo)途徑中起重要作用。而酪氨酸蛋白激酶分為兩類，一類是非受體型酪氨酸蛋白激酶，以src基因產(chǎn)物為代表，此外還有Yes、Fyn、Lck、Fgr、Lyn、Fps/Fes及Abl等；另一類是受體型酪氨酸蛋白激酶,根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)不同，受體型酪氨酸激酶可以分為9種類型。在動物細胞中，酪氨酸蛋白激酶往往參與程序性細胞死亡、癌變等重要細胞行為。植物中酪氨酸蛋白激酶研究較晚。Maya Mayrose等人的工作表明，西紅柿中的雙特異性激酶LeMPK3能夠提高植物對病原體的抵抗。文獻提出，在受到病原體的侵害后，LeMPK3激酶的活性首先提高，然后LeMPK3的mRNA的表達量也短暫的提高。2002年，Parvathi Rudrabhatla等人從花生cDNA文庫中得到一個雙特異性蛋白激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性。并且發(fā)現(xiàn)，該激酶的mRNA表達水平以及激酶活性受到低溫和高鹽脅迫的誘導(dǎo)。但是其蛋白表達水平卻沒有明顯的變化。在250mM濃度的NaCl處理24h下，STY的mRNA表達水平提高了 20倍，在4°C條件下處理24h，其mRNA表達水平提高了 50倍左右。在IOOmMABA處理下，STY表達量沒有變化。
[0008]目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)蛋白激酶參與抗病，抗逆境等信號傳遞過程(ParvathiRudrabhatla, 2002 ；Lizhong Xiong, 2003)。Parvathi Rudrabhatla 等認為，花生中的一種STY激酶參與了花生對非生物脅迫的起始相應(yīng)，證明了一種非MAPK途徑的蛋白激酶級聯(lián)信號傳遞過程在非生物脅迫中起重要作用。Lizhong Xiong等人認為,水稻蛋白激酶0sMAPK5能夠提高水稻對低溫，干旱，高鹽以及病害等的抗性。而Jen Sheen認為，鈣離子依賴的蛋白激酶⑶PK (⑶PKl and⑶PKla)能夠激活與植物抗逆境相關(guān)基因的啟動子，參與植物逆境信號傳導(dǎo)過程。Riichiro Yoshida等報道，在擬南芥中ABA誘導(dǎo)的蛋白激酶SnRK2在植物響應(yīng)脫水脅迫的信號傳導(dǎo)過程中起到重要的作用。由于植物的逆境耐性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜性狀，依靠導(dǎo)入單個功能性蛋白基因很難實現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已經(jīng)成為植物抗逆基因工程的研究熱點。
[0009]綜合目前的研究結(jié)果，蛋白激酶在植物響應(yīng)逆境脅迫的信號傳導(dǎo)途徑中占有重要的地位。蛋白激酶通過自身的磷酸化提高或者降低自身的激酶活性，通過磷酸化底物提高或者降低底物蛋白的酶活 性，然后底物蛋白又調(diào)控下游基因的酶活，形成一個級聯(lián)調(diào)控途徑。如RAS信號調(diào)控途徑，在細胞受體酪氨酸蛋白激酶感受到配體的信號后，形成二聚體并發(fā)生自身磷酸化，激活RAS，然后由活化的RAS激活引起蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)。這種級聯(lián)調(diào)控是一種很精密很復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，蛋白激酶可能在上游作為一種開關(guān)在行使其功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的一個目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaPK及其編碼基因。
[0011]本發(fā)明提供的一種蛋白，來源于小麥屬小麥(Triticum aestivum L.),是如下(a)或(b):
[0012](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0013](b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0014]上述蛋白中，一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015]上述序列表中序列I的氨基酸殘基序列由601個氨基酸殘基組成。
[0016]編碼上述蛋白的基因也是本發(fā)明保護的范圍。
[0017]上述基因為如下I) -3)中任一一種的DNA分子:
[0018]I)序列表中序列2所示的DNA分子；[0019]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;
[0020]3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0021]上述嚴格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用
2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0022]上述序列2由1806個核苷酸組成，開放閱讀框架為自5'端第I至1806位。
[0023]含有上述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。
[0024]上述重組表達載體為將上述基因插入pBI121中得到的重組載體，具體為將序列表的序列2自5’端第1-1806位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的SmaI和SpeI酶切識別位點之間得到的重組質(zhì)粒。
[0025]擴增上述基因的全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍，上述引物對由序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子組成。
[0026]上述的蛋白或上述基因或上述的重組表達載體在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0027]上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物耐逆性具體為提高植物耐逆性；所述耐逆具體為耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
[0028]本發(fā)明的另一個目 的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0029]本發(fā)明提供的方法，是將上述基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物耐逆性高于所述目的植物。
[0030]上述基因通過上述重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物中。
[0031]上述方法中，所述耐逆為耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
[0032]上述方法中，所述高溫為42度，所述低溫為3度；
[0033]所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
[0034]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的基因TaPK在低溫、高鹽和高溫的誘導(dǎo)下表達，且將TaPK基因?qū)霐M南芥中得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥，其對以上三種逆境的抗性高于野生型擬南芥，本發(fā)明提供的蛋白和基因為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物中發(fā)揮重要的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為轉(zhuǎn)基因擬南芥高溫脅迫處理萌發(fā)實驗及后期生長的結(jié)果
[0036]圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥低溫脅迫處理萌發(fā)實驗及后期生長的結(jié)果
[0037]圖3為轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫處理萌發(fā)實驗及后期生長的結(jié)果
[0038]圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥高溫脅迫處理存活率結(jié)果
【具體實施方式】
[0039]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0041]下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0042]實施例1、TaPK的克隆
[0043]一、TaPK 的克隆
[0044]將水培生長10天左右的普通小麥(Triticum aestivum L.)品種小白麥(Triticum aestivum cv.Xiaobaimai,公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，公眾也可從國家種質(zhì)資源庫獲得(編號為ZM242);提及小白麥的文獻為:孫海桃等，小麥TaDREB6轉(zhuǎn)錄因子互作蛋白的篩選，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44 (22):4740-4747.;提及小白麥的文獻為:Isolation and molecular characterization of the Triticumaestivum L.ethylene-responsive factor I(TaERF I)that increases multiple stresstolerance, Plant Mol Biol(2007)65:719-732，Zhao Shi Xu, Lan Qin Xia, Ming Chen, XianGuo Cheng, Rui Yue Zhang, Lian Cheng Li, Yun Xing Zhao, Yan Lu,Zhi Yong Ni, LiLiu, Zhi Gang Qiu, You Zhi Ma)三葉期幼苗NaCl處理2小時，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045]采用Trizol法(TianGen)提取小白麥葉片總RNA,第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)。采用SMART法合成ds cDNA, PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0046]通過5’ RACE和3’ RACE的方法獲得序列表中的序列2。
[0047]該序列表中序列2所示的基因命名為TaPK基因，其開放閱讀框架為自序列表的序列2的5'端第1-1806位核苷酸，將該基因編碼的蛋白命名為TaPK蛋白，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1，由601個氨基酸殘基組成。
[0048]上述序列2也可以通過人工合成。
[0049]實施例2、TaPK對植 物耐逆性的影響
[0050]一、重組表達載體的構(gòu)建
[0051]1、TaPK基因的克隆
[0052]根據(jù)TaPK基因的序列設(shè)計引物對(TaPK_121F和TaPK_121R)，引物末端分別引入SmaI和SpeI酶切識別位點，
[0053]TaPK-121F:5，-TTACCCGGGATGGACGAGGACGAGTACTCT-3’(序列 3)；
[0054]TaPK-12IR:5’ -AGAACTAGTCGATCACAGCAGCTTCGG-3 (序列 4)。
[0055]提取小白麥葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，用上述引物進行擴增，得到的PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，其大小為1.8Kb。將該PCR產(chǎn)物送去測序，該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列2，即為TaPK基因。
[0056]米用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 (TaKaRa 公司，CodeN0.:DV807A)回收純化1.8Kb大小的PCR產(chǎn)物。
[0057]2、重組表達載體的構(gòu)建
[0058]①用限制性內(nèi)切酶SmaI和SpeI (Promega，R6121，R6591)酶切步驟I回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；
[0059]②用限制性內(nèi)切酶SmaI和SpeI酶切植物真核表達載體pBI121 (購自Clontech公司)，回收載體骨架；
[0060]③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物；
[0061]④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化T0P10菌株(Tiangen，CB104-03)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒進行測序。
[0062]測序結(jié)果表明，該質(zhì)粒為將序列表中的序列2所示的DNA片段插入pBI121載體的SmaI和SpeI酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pBI121_TaPK。
[0063]二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得
[0064]1、用上述重組質(zhì)粒pBI121_TaPK轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58(購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司)，得到重組農(nóng)桿菌。
[0065]提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒送去測序，結(jié)果該質(zhì)粒為pBI121_TaPK，證明該重組菌為陽性重組農(nóng)桿菌，將其命名為C58/pB1121-TaPK。
[0066]2、將重組農(nóng)桿菌C58/pBI121-TaPK接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、3000rpm培養(yǎng)約30小時；
[0067]3、將步驟2的菌液轉(zhuǎn)至YEP液體培養(yǎng)基(含50 μ g/ml利福平)中，28°C、300rpm培養(yǎng)約14小時(菌液0D600達到1.5-3.0)；
[0068]4、收集菌體，4°C、4000g 離心 IOmin,用 10% 鹿糖(含 0.02%silwet)稀釋至 0D600約為1.0 ；
[0069]5、將擬南芥哥倫比亞生態(tài)型Col-O(美國擬南芥信息資源網(wǎng)，以下簡稱為野生型擬南芥，購自SALK公司)整株與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開塑料布，直立放置花盆，進行正常的光照培養(yǎng)，混收Ttl代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥種子。將Ttl代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥種子播種到含有50mg/ml卡那霉素的MS培養(yǎng)基上后得到7株T1代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥幼苗。
[0070]采用同樣的方法將空載體pBI 121轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，得到T1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。
[0071]分別將T1代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥和T1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥播種、自交，直到得到T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥和T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。
[0072]提取T3代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥植株的DNA，以TaPK_121F和TaPK_121R為引物進行PCR檢測，得到條帶為1.8Kb的陽性T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥植株。
[0073]提取T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的基因組DNA，用TaPK_121F和TaPK_121R為引物進行PCR擴增，沒有得到1.8Kb的目的片段，說明T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥構(gòu)建成功。
[0074]三、轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性鑒定
[0075]A、種子萌發(fā)實驗
[0076]1、高溫逆境脅迫種子萌發(fā)實驗
[0077]分別將編號為PK1-1、PK1-2和PK1-3的陽性T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子、T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子和野生型擬南芥種子(WT)經(jīng)42度高溫處理0h、lh、2h和4h，再種在普通MS培養(yǎng)基上，然后移植盆栽培養(yǎng)，每個株系30個，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值:
[0078]在播種后第7天觀察普通MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)結(jié)果如圖1A所示，可以看出，編號為PKl-1、PK1-2和PK1-3的陽性T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子和野生型擬南芥種子(WT)隨著處理時間的加長，萌發(fā)率均有所下降，但轉(zhuǎn)基因株系仍表現(xiàn)一定的優(yōu)勢。統(tǒng)計萌發(fā)率結(jié)果如圖1B所示，編號為PKl-1的T3R轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子經(jīng)42度高溫處理Oh、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為78%、70%、68%和65% ；
[0079]編號為PK1-2的T3代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥(TaPK)種子經(jīng)42度高溫處理Oh、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為89%、84%、81%和76% ；[0080]編號為PK1-3的T3代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥(TaPK)種子經(jīng)42度高溫處理Oh、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為73%、68%、59%和59% ；
[0081]野生型擬南芥種子(WT)種子經(jīng)42度高溫處理0h、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為51%、46%、41% 和 35% ；
[0082]在播種后第20天觀察在花盆中各株系生長情況，結(jié)果如圖1C所示，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)在各個時間段均優(yōu)于野生型擬南芥(WT)。
[0083]T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無顯著差異。
[0084]從上述結(jié)果顯示，三個轉(zhuǎn)基因株系在4個不同時間段的處理下萌發(fā)率均高于野生型，三個株系的均值在67%以上，而野生型植株在51%以下。且后期的生長轉(zhuǎn)基因植株也優(yōu)于野生型。
[0085]2、低溫逆境脅迫種子萌發(fā)實驗
[0086]分別將編號為PK1-1、PK1-2和PK1-3的陽性T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子、T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子和野生型擬南芥種子(WT)經(jīng)3度低溫處理0h、lh、2h和4h，再種在普通MS培養(yǎng)基上，然后移植盆栽培養(yǎng)，每個株系30個，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0087]在播種后第7天觀察普通MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)結(jié)果如圖2A所示，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子和野生型擬南芥種子(WT)隨著處理時間的加長，萌發(fā)率均有所下降，但轉(zhuǎn)基因株系仍表現(xiàn)一定 的優(yōu)勢。統(tǒng)計萌發(fā)率，結(jié)果如圖2B所示，編號為PKl-1的1~3代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥(TaPK)種子經(jīng)3度低溫處理0h、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為70%、68%、64%和 58% ；
[0088]編號為PK1-2的T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子經(jīng)3度低溫處理0h、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為89%、81%、81%和76% ；
[0089]編號為PK1-3的T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子經(jīng)3度低溫處理0h、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為73%、70%、59%和57% ；
[0090]野生型擬南芥種子(WT)種子經(jīng)3度低溫處理0h、lh、2h和4h的萌發(fā)率分別為53%、49%、46% 和 37% ；
[0091]在播種后第20天觀察在花盆中各株系生長情況，結(jié)果如圖2C所示，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥在各個時間段均優(yōu)于野生型擬南芥(WT)。
[0092]T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無顯著差異。
[0093]從上述結(jié)果顯示，三個轉(zhuǎn)基因株系在4個不同時間段的處理下萌發(fā)率均高于野生型，三個株系的均值在64%以上，而野生型植株在53%以下。且后期的生長也優(yōu)于野生型。
[0094]3、高鹽逆境脅迫種子萌發(fā)實驗
[0095]分別將編號為PK1-1、PK1-2和PK1-3的陽性T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子、T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子和野生型擬南芥種子(WT)播種在分別含有OmM和50mMNaCl的MS培養(yǎng)基中，然后移植盆栽培養(yǎng)，每個株系30個，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0096]在播種后第7天觀察MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)結(jié)果如圖3A所示，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaPK擬南芥(TaPK)種子和野生型擬南芥種子(WT)在OmM和50mMNaCl處理下，萌發(fā)率均有下降，但轉(zhuǎn)基因株系仍表現(xiàn)一定的優(yōu)勢。統(tǒng)計萌發(fā)率，結(jié)果如圖3B所示，
[0097]編號為PKl-1的T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子在含有OmM和50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為89%和78% ；[0098]編號為PK1-2的T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子在含有OmM和50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為70%和59% ；
[0099]編號為PK1-3的T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(TaPK)種子在含有OmM和50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為73%和70% ；
[0100]野生型擬南芥種子(WT)種子在含有OmM和50mMNaCl的MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率分別為 51% 和 46% ；
[0101]在播種后第20天觀察在花盆中各株系生長情況，結(jié)果如圖3C所示，可以看出，T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥在OmM和50mMNaCl處理下均優(yōu)于野生型擬南芥(WT)。
[0102]T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無顯著差異。
[0103]結(jié)果顯示，三個轉(zhuǎn)基因株系在2個不同鹽濃度的處理下萌發(fā)率均高于野生型，三個株系的均值在69%以上，而野生型植株在51%以下。且后期的生長也優(yōu)于野生型。[0104]4、存活率實驗
[0105]高溫逆境脅迫處理表型鑒定:分別將編號為PKl-1的T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(PK)種子、T3R轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子和野生型擬南芥種子(WT)播種，生長20天后，在42度高溫處理6h、12h，然后復(fù)水一周，觀察生長狀態(tài)。每個株系10個，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0106]結(jié)果如圖4所示，可以看出，編號為PKl-1的T3代轉(zhuǎn)TaPk擬南芥(PK)在處理前、42度高溫處理6h、42度高溫處理12h下耐高溫性均高于野生型，6h處理后基本無明顯變化，12h后與野生型的差異明顯，且復(fù)水一周后成活率為80%，而野生型的成活率僅為30%。
[0107]T3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無顯著差異。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列I衍生氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因為如下I)-3)中任一一種的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； 3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體為將權(quán)利要求2或3所述基因插入PBI121中得到的重組載體。
6.擴增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或其任意片段的引物對。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4或5所述的重組表達載體在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用；所述調(diào)控植物耐逆性具體為提高植物耐逆性；所述耐逆具體為耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物耐逆性高于所述目的植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求4或5所述的重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物中； 所述耐逆為耐鹽、耐高溫和/或耐低溫。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述高溫為42度，所述低溫為3度；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。
【文檔編號】C12N15/63GK103509766SQ201210202610
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】徐兆師, 馬有志, 劉沛, 裴麗麗, 李連城, 陳明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所