專利名稱：一株糞腸球菌及其廣譜抑菌作用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一株糞腸球菌及其廣譜抑菌作用。
背景技術：
我國是一個畜牧業大國，也是畜產品消費大國?？股卦陬A防或治療動物感染寄生蟲和細菌性疾病中被廣泛大量使用，人們已經認識到濫用抗生素的危害，作為動物生長促進劑正在被限制或禁用，抗生素使用造成的藥物殘留問題已成為畜牧業發展的嚴重障礙。動物源食品抗生素超標而導致的出口損失以及公共衛生安全問題引起了廣泛的關注。人們迫切需要尋找可能的替代品，更希望找到與人類抗生素關聯很少的物質進行疾病的預防和治療，以消除抗生素的耐藥性對人類健康的威脅。細菌素無疑是一類天然的具有巨大潛力的抗菌物質，因此細菌素成為了近年來研究的熱點。細菌素(Bacteriocins)是某些細菌在代謝過程中,通過核糖體合成機制產生的一類具有抗菌活性的多肽、蛋白質或蛋白質復合物，具有高效、無毒、耐高溫、無殘留、無抗藥性等優點。而傳統的青霉素等抗生素是由細胞多酶復合體催化形成的代謝產物，不存在結構基因；而細菌素由基因編碼，可以通過基因工程的手段加以改造。乳酸鏈球菌肽Nisin是世界上公認安全的防腐劑，已有52個國家和地區使用Nisin作為食品保鮮劑，從而促進了其它種類細菌素的研究及其在食品防腐劑之外領域的開發和應用。近年來，細菌素因其具有無毒、高效、耐高溫、無殘留、無抗藥性等優點，已被廣泛用作食品添加劑和微生態制劑。隨著飼料工業的快速發展和規?；酿B殖模式上的推廣，人們對動物源食品的安全水平更加關注。如果將產細菌素的菌株制備成益生素活菌制劑或開發出細菌素飼料添加劑，以減少抗生素添加劑在飼料中的濫用，那么細菌素在畜牧業中的應用潛能將非常巨大。

發明內容
本發明提供了一株幾腸球菌(Enterococcusfaecalis) E15-CUI。本發明提供的幾腸球菌(Enterococcus faecalis) E15-QJI,其保藏號為CGMCCN0. 6130。上述的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130 或其發酵產物在制備抑菌和/或殺菌產品中的應用也是本發明保護的范圍。上述應用中，所述抑菌為抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌、單核細胞增生李氏桿菌、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌中的至少一種；也可以抑制耐藥性雞傷寒沙門氏菌、耐藥性腸炎沙門氏菌、普通變形桿菌或豬鏈球菌。所述殺菌為殺滅大腸埃希氏菌；所述殺滅大腸埃希氏菌具體為殺滅大腸埃希氏菌CVCC C83707。
上述應用中，所述發酵產物按照包括如下步驟的方法制備將上述的糞腸球菌(Enterococcus faecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130進行液體發酵，收集產物，即為發酵產物。上述應用中，所述液體發酵的溫度為37°C，所述液體發酵的時間為24h，所述液體發酵的轉速為200r/min，所述液體發酵的培養基為MRS液體培養基。上述應用中，所述發酵產物制備方法中還包括如下步驟將所述產物在4°C、9100 X g離心lOmin，收集上清液，得到發酵產物。本發明的另一個目的是提供一種抑菌產品。本發明提供的抑菌產品，其活性成分為上述的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)E15-⑶I CGMCC NO. 6130或上述應用中的發酵產物；上述抑菌具體為抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌、單核細胞增 生李氏桿菌、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌中的至少一種。本發明的第三個目的是提供一種殺菌產品。本發明提供的殺菌產品，其活性成分為上述的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)E15-⑶I CGMCC NO. 6130或上述應用中的發酵產物；所述殺菌為殺滅大腸埃希氏菌；所述殺滅大腸埃希氏菌具體為殺滅大腸埃希氏菌CVCC C83707。本發明的第四個目的是提供一種制備抑菌產品或殺菌產品的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟將上述的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)E15-⑶I CGMCC NO. 6130進行液體發酵，收集產物，即得到抑菌產品或殺菌產品。上述方法中，所述液體發酵的溫度為37°C，所述液體發酵的時間為24h，所述液體發酵的轉速為200r/min，所述液體發酵的培養基為MRS液體培養基。上述方法還包括如下步驟在所述收集產物后還包括如下步驟將所述產物在4°C、9100Xg離心lOmin，收集上清液，得到抑菌產品；上述抑菌為抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌、單核細胞增生李氏桿菌、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌中的至少一種；所述殺菌為殺滅大腸埃希氏菌；所述殺滅大腸埃希氏菌具體為殺滅大腸埃希氏菌CVCC C83707。菌株E15-⑶I于2012年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 6130，分類命名為糞腸球菌Enterococcus faecalis。本發明的實驗證明，本發明從動物胃腸道快速篩選出糞腸球菌E15-CUI，將該菌株進行發酵培養，發酵產物可以抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通變形桿菌、多殺性巴氏桿菌、馬腺疫鏈球菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌等多種菌，且抑菌效果大于同類的糞腸球菌，經過初步判斷抑菌是由于細菌發酵產生了一種具有蛋白性質的細菌素物質引起。因此本發明的菌株及其發酵產物在畜牧業中的應用潛能將非常巨大。


圖I為E15-CUI的形態觀察圖2為E15-CUI培養特性圖3為透射電鏡觀察E15-CUI發酵液對大腸桿菌CVCC C83707形態的影響
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、E15-⑶I的分離及鑒定
1、E15-CUI 的分離(I)動物胃腸道的處理無菌取健康豬的整個消化道包括胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸，分別取各部位黏膜組織lg，置于滅菌的平皿中、剪碎，用5mL的無菌生理鹽水制成懸液，取100 u L懸液接種乳酸菌增菌培養基中，置在37°C溫箱中燭缸法培養48h，得到增菌培養后的菌液。(2)分離純化取增菌培養后的菌液在腸球菌選擇培養基(購自杭州天和試劑有限公司)上進行劃線分離培養，37°C培養24h。挑取典型菌落、鏡檢，無雜菌進行移植、純化培養，保存于4°C冰箱中備用。(3)抑菌實驗MRS液體培養基胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，蔗糖5g，枸櫞酸銨2g，醋酸鈉 15g, KH2P046g, MnSO4 4H20MgS04 7H20 0. 58g, 0. 25g, FeSO4 7H20,0. 03g,吐溫 _801g，蒸餾水 1000ml, pH7. 0。PYG 培養基大豆蛋白胨 0. 5g，酵母浸粉 0. 5g，KH2PO4O. lg, MgSO4 7H200. 02g,MnSO4 4H20 0. 002g,葡萄糖 0. lg，蒸懼水 100ml, pH6. 5。發酵將上述(2)得到的已分離純化的細菌接種至MRS液體培養基中，37°C、200r/min振蕩發酵培養24h，得到發酵產物；將發酵產物在4°C、9100 X g離心lOmin，取上清液備用；指示菌(見下表I)的培養分別將指示菌培養到對數生長期，用滅菌生理鹽水稀釋到107CFU/mL，取IOOul涂布PYG培養基平板；采用瓊脂打孔雙層平板擴散法，加樣(上述上清液)后置4°C冰箱中擴散lh，37°C培養24h觀察抑菌活性，結果見表I :表I為抑菌試驗結果
權利要求
1.糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) E15-CUI，其保藏號為 CGMCC NO. 6130。
2.權利要求I 所述的糞腸球菌(Enterococcus faecal is )E15_CUI CGMCC NO. 6130 或其發酵產物在制備抑菌和/或殺菌產品中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于 所述抑菌為抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌、單核細胞增生李氏桿菌、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌中的至少一種； 所述殺菌為殺滅大腸埃希氏菌。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于 所述發酵產物按照包括如下步驟的方法制備將權利要求I所述的糞腸球菌 (Enterococcus faecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130進行液體發酵，收集產物，即為發酵產物。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于 所述液體發酵的溫度為37°C，所述液體發酵的時間為24h，所述液體發酵的轉速為200r/min，所述液體發酵的培養基為MRS液體培養基。
6.根據權利要求4或5所述的應用，其特征在于所述發酵產物制備方法中還包括如下步驟將所述產物在4°C、9100Xg離心lOmin，收集上清液，得到發酵產物。
7.—種抑菌產品，其活性成分為權利要求I所述的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)E15-CUI CGMCC NO. 6130或權利要求2_6中任一所述應用中的發酵產物；所述抑菌具體為抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌、單核細胞增生李氏桿菌、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌中的至少一種。
8.一種殺菌產品，其活性成分為權利要求I所述的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)E15-CUI CGMCC NO. 6130或權利要求2_6中任一所述應用中的發酵產物；所述殺菌為殺滅大腸埃希氏菌。
9.一種制備抑菌產品或殺菌產品的方法，包括如下步驟將權利要求I所述的糞腸球菌(Enterococcus faecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130進行液體發酵，收集產物，即得到抑菌廣品或殺菌廣品。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于 所述液體發酵的溫度為37°C，所述液體發酵的時間為24h，所述液體發酵的轉速為200r/min，所述液體發酵的培養基為MRS液體培養基； 所述方法還包括如下步驟在所述收集產物后還具體包括如下步驟將所述產物在4°C、9100Xg離心lOmin，收集上清液，得到抑菌產品； 所述抑菌為抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌、單核細胞增生李氏桿菌、馬腺疫鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌、炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌中的至少一種； 所述殺菌為殺滅大腸埃希氏菌。
全文摘要
本發明公開了一株糞腸球菌及其廣譜抑菌作用的應用。本發明提供了一株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)E15-CUI，其保藏號為CGMCC NO.6130。本發明還提供了所述的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)E15-CUI CGMCC NO.6130或其發酵產物在制備抑菌產品中的應用。本發明的實驗證明，本發明從動物胃腸道快速篩選出糞腸球菌E15-CUI，將該菌株進行發酵培養，發酵產物可以抑制大腸埃希氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯、變形桿菌、多殺性巴氏桿菌、馬腺疫鏈球菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌等多種菌。
文檔編號C12N1/20GK102732468SQ201210234030
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者劉鳳華, 崔德鳳, 張永紅, 李煥榮, 阮文科 申請人:北京農學院