一種阿維菌素產生菌及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種阿維菌素產生菌及其制備方法和應用。具體地，對野生型的阿維菌素產生菌中的aveD基因進行失活，可以獲得消除A組分，只產生B組分的菌株；對aveD基因和aveC基因同時失活，并在此基礎上回補aveC的同源基因（優選梅嶺霉素生物合成基因簇中的meiC基因），獲得的突變體發酵產物中95wt%以上都為阿維菌素B2a。將產物阿維菌素B2a作為前體，可以直接用于大量合成高純度的阿維菌素B1a和伊維菌素。
【專利說明】一種阿維菌素產生菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體地，本發明涉及一種阿維菌素產生菌及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]阿維菌素(Avermectin)是一種由革蘭氏陽性菌除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius)產生的一類十六元大環內酯類抗生素。阿維菌素是一種高效，無公害的生物農藥，具有廣譜的殺蟲抗螨活性，并且阿維菌素對人畜毒副作用低，體內殘留低，這些特點使得阿維菌素在家畜寄生蟲感染的治療和農業病蟲害防治方面均有廣泛的應用，是生產綠色食品的最佳用藥。
[0003]通常，在阿維菌素發酵過程中，產生A組分(A Ia和A 2a等)和B組分(Bla和B2a等)(見圖1)，以Bla組分為最有效成份，而B2a組份通常用作合成另外一種生物農藥伊維菌素的前體。以阿維菌素為前體半合成的衍生物依維菌素(Ivermectin)和多拉菌素(Doramectin)具有更高的應用價值，前者將Bla的22為和23位雙鍵換為單鍵，后者則將Bla的25位的側鏈基團換為環己基。
[0004]目前阿維菌素和伊維菌素生產上需要從天然發酵產物中加以提純，處理過程非常復雜，得率低，還需要使用甲苯等有毒溶劑。此外，尚沒有發酵產物只有B2a組分的菌株。
[0005]因此本領域迫切需要開發高產的發酵組份明確單一的阿維菌素產生菌。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是提供一種阿維菌素產生菌及其制備方法和應用。
[0007]在本發明的第一方面，提供了一種阿維菌素產生菌，所述的產生菌的發酵產物中，阿維菌素B2a組分的相對含量滿足式1:
[0008]B/A ≥35%
[0009]式I
[0010]其中，
[0011]B為發酵產物中阿維菌素B2a組分的質量；
[0012]A為發酵產物中所有阿維菌素組分總的質量。
[0013]在另一優選例中，B/A≥40%,更佳地≥50%,更佳地≥60%,更佳地≥70%,更佳地≥80%，更佳地≥ 90%，更佳地≥95%，最佳地≥ 99%。
[0014]在另一優選例中，所述的阿維菌素產生菌為鏈霉菌屬。
[0015]在另一優選例中，所述的阿維菌素產生菌為除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius)。
[0016]在另一優選例中，所述產生菌的基因組中的aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因、或不表達AveD蛋白、或表達的AveD蛋白無功能。
[0017]在另一優選例中，所述AveD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。[0018]在另一優選例中，所述產生菌的基因組中aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達aveC基因、或不表達AveC蛋白、或AveC蛋白無功能；并且，所述產生菌的基因組中含有或表達aveC的同源基因；或所述產生菌中表達AveC蛋白的同源蛋白。
[0019]在另一優選例中，所述AveC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0020]在另一優選例中，所述aveC的同源基因選自下組:美貝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克馬丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
[0021]在另一優選例中,所述的aveC的同源基因為梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
[0022]在另一優選例中，所述的milC基因來源于冰城鏈霉菌(Streptomycesbingchenggensis)。
[0023]在另一優選例中，所述的nemC基因來源于藍灰鏈霉菌(Streptomycescyaneogriseus)。
[0024]在另一優選例中，所述的meiC基因來源于南昌鏈霉菌Streptomycesnanchangensisο
[0025]在另一優選例中，梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC編碼的蛋白質序列如SEQ ID NO:3所示。
[0026]在另一優選例中，所述的阿維菌素產生菌是除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius) mVLlOO3,保藏編號為 GCMCC N0.6678。
[0027]在本發明的第二方面，提供了第一方面所述的阿維菌素產生菌的用途它被用做發酵生產阿維菌素B2a組分的工程菌。
[0028]在本發明的第三方面，提供了一種制備阿維菌素B2a組分的方法，包括步驟:
[0029](a)培養第一方面所述的阿維菌素產生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a的發酵產物；和
[0030](b)從發酵產物中分離出所述的阿維菌素B2a組分。
[0031]在本發明的第四方面，提供了一種生產阿維菌素Bla組分的方法，包括步驟:
[0032](a)培養第一方面所述的阿維菌素產生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發酵產物；
[0033](b)從發酵產物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和
[0034](c)將分離的阿維菌素B2a轉化為阿維菌素Bla組分。
[0035]在另一優選例中，步驟(C)所述轉化是將B2a組分高溫水解，從而獲得Bla組分。
[0036]在本發明的第五方面，提供了一種生產伊維菌素的方法，包括步驟:
[0037](a)培養第一方面所述的阿維菌素產生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發酵產物；
[0038](b)從發酵產物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和
[0039](c)將分離的阿維菌素B2a組分轉化為伊維菌素。
[0040]在另一優選例中，步驟(C)所述轉化是用三-正-丁基氫化錫對阿維菌素B2a進行還原和脫保護，獲得伊維菌素。[0041]在本發明的第六方面，提供了一種制備阿維菌素產生菌的方法，包括步驟:
[0042](I)對生產伊維菌素的出發菌進行aveD基因和或AveD蛋白的遺傳改造，從而獲得基因組中aveD基因失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因、或不表達AveD蛋白、或表達的AveD蛋白無功能的阿維菌素產生菌；
[0043]并且，在所述生產伊維菌素的出發菌的發酵產物中，阿維菌素B2a組分的相對含量滿足式II:
[0044]B/A < 35%
[0045]式II[0046]其中，
[0047]B為發酵產物中阿維菌素B2a組分的質量；
[0048]A為發酵產物中所有阿維菌素組分總的質量。
[0049]在另一優選例中，所述的方法還包括步驟:
[0050](2)對步驟(1)獲得的菌株，對aveC基因和或AveC蛋白進行進一步的遺傳改造，從而獲得基因組中aveC基因失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失、或不表達aveC基因、或不表達AveC蛋白、或表達的AveC蛋白無功能的阿維菌素產生菌；以及
[0051](3)對步驟⑵獲得的菌株，回補aveC的同源基因或AveC同源蛋白。
[0052]在本發明的第七方面，提供了一種基因組合，所述的基因組合與出發(或原始)的生產伊維菌素的基因組合相比，具有選自下組的一個或多個特征:
[0053](I)所述基因組合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因；或
[0054](2)所述基因組合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達aveC基因；并且，含有或表達aveC的同源基因。
[0055]在本發明的第七方面，提供了一種載體，所述的載體上整合有第六方面所述的基因組合。
[0056]在本發明的第八方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有第七方面所述的載體，或所述的宿主細胞整合有第六方面所述的基因組合。
[0057]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
[0059]圖1顯示了阿維菌素8個組分的化學結構。
[0060]圖2顯示了不同菌株發酵產物HPLC分析結果；1為出發菌株發酵產物HPLC分析結果；II為aveD失活的突變株mVLlOOl發酵產物HPLC分析結果，只產生阿維菌素B組分；III顯示，在mVLlOO I進行aveC失活后突變株mVL1002的發酵產物HPLC分析結果，完全不產阿維Bla組分，僅產生微量的B2a組分；IV顯示，在mVL1002中異源回補meiC得到的突變株mVL1003發酵產物HPLC分析結果，只產生阿維菌素B2a單一組分?！揪唧w實施方式】[0061]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次提供了一種高產阿維菌素B2a組分的阿維菌素產生菌及其制備和應用。具體地，對野生型的阿維菌素產生菌中的aveD基因進行失活，可以獲得消除A組分，只產生B組分的菌株，從而大幅度提高發酵產物中B2a組分的含量；aveD基因和aveC基因同時失活，并在此基礎上回補aveC的同源基因(梅嶺霉素生物合成基因簇中的meiC基因)，突變體發酵產物中95wt%以上都為阿維菌素B2a。將產物阿維菌素B2a作為合成前體，可以直接用于高純度阿維菌素Bla和伊維菌素的合成。在此基礎上完成了本發明。
[0062]術語
[0063]如本文所用，術語“以上”和“以下”包括本數，例如，“90%以上“指> 90%，“0.2%以下”指≤0.2%。
[0064]術語“不含/不產生阿維菌素A或Bla組分”或“基本上不含/不產生阿維菌素A或Bla組分”可互換使用，指發酵產物中阿維菌素A或Bla組分的含量< 0.lwt%，較佳地(0.01wt%,更佳地≤ 0.005wt%(如 0wt%)。
[0065]菌株
[0066]如本文所用，術語“本發明出發菌株”、“本發明野生菌株”或“本發明出發微生物”可以互換使用，都是指除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267。
[0067]本發明的出發菌株來自于美國模式培養物集存庫(American typeculturecollection, ATCC)，編號為 ATCC31267。
[0068]用于本發明的出發菌株不僅包括除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267，還包括其衍生菌株及其他生產阿維菌素的菌株。
[0069]菌種保藏
[0070]本發明的除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius) mVL1003,于 2012 年 10 月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCN0.6678。
[0071]引物
[0072]如本文所用，術語“引物”指的是在與模板配對，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點進行合成與模板互補的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。
[0073]引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引物必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補。t匕如，在一個3’端與模板互補的引物的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引物能與模板充分的結合，非完全互補的引物也可以與模板形成引物-模板復合物，從而進行擴增。
[0074]構建重組質粒
[0075]根據本文所述的基因簇及其外部兩端的核苷酸序列，本【技術領域】人員可方便地用各種已知方法制得本發明的同源重組序列。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。[0076]所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調節或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0077]本發明還提供了一種穿梭質粒載體。在本發明的一個優選例中，穿梭質粒載體可以為用作基因敲除的PKC1139和用作表達的PSET152質粒。根據已知載體的酶切圖譜，本領域技術人員可按照常規方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發明的序列插入合適的限制性位點，制得本發明的重組載體。
[0078]轉化
[0079]將含有所述編碼序列的載體導入宿主細胞，可采用本領域的多種已知技術，包括但不限于:磷酸鈣沉淀，原生質體融合，脂質體轉染，電穿孔，微注射，反轉錄法，噬菌體轉導法，堿金屬離子法。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。[0080]獲得的轉化子可以用常規方法培養，復制本發明的基因序列。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0081]本發明還提供了一種宿主細胞，其中含有本發明的編碼序列。所述的宿主細胞優選的是原核細胞，一個適用于本發明的宿主細胞為宿主甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coliET12567。
[0082]同源重組
[0083]同源重組(Homologus Recombination)是指發生在姐妹染色單體(non-sisterchromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質催化，如原核生物細胞內的RecA、RecB⑶、RecF,RecO, RecR等；以及真核生物細胞內的Rad51、Mrell-Rad50等。同源重組反應通常根據交叉分子或holiday結構(Holiday JunctureStructure)。同源重組反應嚴格依賴DNA分子之間的同源性。
[0084]同源重組可以用于基因敲除?；蚯贸募夹g路線如下:
[0085](I)構建重組基因載體；
[0086](2)將重組DNA轉入受體細胞核內；
[0087](3)用選擇培養基篩選已發生重組的細胞。
[0088]在哺乳動物中，還包括步驟(4):將已發生重組的細胞轉入胚胎使其生長成為轉基因動物，還可以對轉基因動物進行形態觀察及分子生物學檢測。
[0089]制備本發明的阿維菌素產生菌
[0090]本發明提供了一種制備阿維菌素產生菌的方法，包括步驟:
[0091 ] (I)對生產伊維菌素的出發菌進行aveD基因和或AveD蛋白的遺傳改造，從而獲得基因組中aveD基因失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因、或不表達AveD蛋白、或表達的AveD蛋白無功能的阿維菌素產生菌；并且，在所述生產伊維菌素的出發菌的發酵產物中，阿維菌素B2a組分的相對含量滿足式II:
[0092]B/A < 35%
[0093]式II[0094]其中，
[0095]B為發酵產物中阿維菌素B2a組分的質量；
[0096]A為發酵產物中所有阿維菌素組分總的質量。
[0097]在另一優選例中，所述的方法還包括步驟:
[0098](2)對步驟(1)犾得的囷株，對aveC基因和或AveC蛋白進打進一步的遺傳改造，從而獲得基因組中aveC基因失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失、或不表達aveC基因、或不表達AveC蛋白、或表達的AveC蛋白無功能的阿維菌素產生菌；以及
[0099](3)對步驟⑵獲得的菌株，回補aveC的同源基因或AveC同源蛋白。
[0100]在本發明的一個優選例中，具體地，所述方法包括步驟:
[0101](I)構建用于同源重組的載體，所述載體依次含有通過0_2000bp堿基相互連接的、分別含有位于aveD上游和下游的同源臂序列；
[0102](2)將步驟(1)的所述載體導入作為出發菌株，獲得導入載體的菌株，其中所述的出發菌株可發酵主要產生阿維菌素Ala，A2a，Bla，B2a組分；
[0103](3)從步驟(2)獲得的菌株中，篩選所述上游同源臂序列和下游同源臂序列與出發菌株的基因組發生了二次同源重組的菌株，從而獲得只產生Bla和B2a組分的阿維菌素產生菌；
[0104](4)構建用于同源重組的載體，所述載體依次含有通過0_2000bp堿基相互連接的、分別含有位于aveC上游和下游的同源臂序列；
[0105](5)將步驟(4)的所述載體導入步驟(3)獲得的菌株，其中所述的步驟(3)獲得的菌株可發酵產生阿維菌素Bla，B2a組分；
[0106](6)從步驟(5)獲得的菌株中，篩選所述上游同源臂序列和下游同源臂序列與出發菌株的基因組發生了二次同源重組的菌株；
[0107](7)構建用于表達aveC同源基因的載體，所述載體依次含有紅霉素啟動子、完整的aveC同源基因片段；
[0108](8)將步驟(7)的所述載體導入步驟(6)獲得的菌株；獲得只產生B2a組分的阿維
菌素產生菌。
[0109]在另一優選例中，步驟(7)所述aveC同源基因選自:美貝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克馬丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
[0110]在另一優選例中，步驟(3)之后還包括步驟:驗證阿維菌素產生菌aveD基因是否發生點突變。
[0111]在另一優選例中，步驟(6)之后還包括步驟:驗證阿維菌素產生菌aveC基因是否缺失。
[0112]在另一優選例中，步驟(1)、(4)所述同源臂序列是用PCR擴增的方法獲得的。
[0113]在另一優選例中，步驟(7)所述完整的aveC同源基因片段是用PCR擴增的方法獲得的。[0114]在另一優選例中，步驟(1)、(4)所述同源臂序列的長度沒有特別限制，較佳地≥ 15000bp。
[0115]在另一優選例中，步驟(1)、(4)、(7)所述載體為穿梭質粒，較佳地為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒。
[0116]在另一優選例中，步驟(1)、(4)、(7)所述載體還含有抗生素抗性基因，較佳地為阿伯拉霉素抗性基因。
[0117]在另一優選例中，步驟(2)、(5)、(8)所述的導入方法鏈霉菌DNA導入法，較佳的為接合轉移導入法。
[0118]在另一優選例中，步驟(2)所述的出發菌株為鏈霉菌屬，較佳地為除蟲鏈霉菌。
[0119]基因組合
[0120]本發明還提供了一種基因組合，所述的基因組合與出發(或原始)的生產伊維菌素的基因組合相比，具有選自下組的一個或多個特征:
[0121](I)所述基因組合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因；或
[0122](2)所述基因組合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達aveC基因；并且，含有或表達aveC的同源基因。
[0123]本發明還提供了一種載體，所述的載體上整合有上述的基因組合。
[0124]本發明還提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有上述載體，或所述的宿主細胞整合有上述基因組合。
[0125]在另一優選例中，所述宿主細胞為枯草芽孢桿菌或鏈霉菌，較佳地為鏈霉菌，最佳的為除蟲鏈霉囷。
[0126]發酵生產阿維菌素B2a
[0127]本發明的菌株可用于通過生物法制備阿維菌素B2a或其鹽或其衍生物。其中，所述的鹽包括(但并不限于):鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽、醋酸鹽，檸檬酸鹽、其他有機羧酸鹽
坐寸ο
[0128]所述的阿維菌素B2a衍生物包括(但并不限于):伊維菌素、多拉菌素等。
[0129]本發明的發酵生產阿維菌素B2a生產方法，除了生產菌不同之外，其他條件與現有技術中發酵生產的方法基本相同，例如對阿維菌素B粗品的純化工藝。本發明菌株的發酵條件與一般的鏈霉菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培養基中，在PH5.0-9.0 (較佳地PH7.0-7.5)和20-45°C (較佳地25_40°C )發酵。在本發明中，“菌絲體”、“發酵液”或“培養液”可通過在適合生長的條件下培養本發明菌株，使其生長至一定的菌絲體濃度來獲得。用于培養本發明菌株的培養基中的營養源沒有特別的限制。本領域技術人員可以根據公知的技術來選擇合適的碳源、氮源和其他營養源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黃豆餅粉、肉膏、蛋白粉、麥皮、米糖、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其他有機物或無機含氮化合物。另外，培養基中還可適當加入一些無機鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽(如磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等)、硫酸錳、硫酸銨、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通常可采用各種已知的常規培養基，如LB瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養基和牛肉浸汁瓊脂培養基等對本菌株進行斜面固體培養并4°C環境下進行初步保藏。在一個具體實施方案中，用于培養本發明菌株的培養基具有以下組成(％表示質量/體積):黃豆餅粉2%，D-甘露醇2%，瓊脂2%。
[0130]然而，本領域技術人員應當理解，本發明并不局限于本文中列舉的這些具體培養基配方。
[0131]培養本發明中的菌株的溫度、pH、氣液比、罐壓、轉速等條件沒有特別嚴格的限制，只要該條件適合該菌的生長即可。在一些較佳的實施方案中，pH宜控制在6.5~8.0之間，培養溫度宜在25~40°C之間。應理解，本發明的發酵可以是連續發酵，也可以是間歇式發酵。在本發明的一個較佳的實施方案中，通過以下方法培養得到發酵液和菌絲體:MS固體培養基(黃豆餅粉2%，D-甘露醇2%，瓊脂2%)上30°C培養7天。切下約Icm2的含孢子和菌絲的瓊脂塊接入一級發酵培養基(玉米淀粉3%、豆柏粉0.8%、花生餅粉1%、酵母浸提物0.4%、淀粉酶4 μ /g淀粉)，30°C、200rpm培養48小時。按10%體積的接種量將種子培養液接入發酵培養基(玉米淀粉14%，豆柏粉2%，酵母粉1%，鑰酸鈉0.22%，硫酸銨0.5%)，30°C、200rpm，培養8天。
[0132]本發明的主要優點包括:
[0133](I)用本發明方法進行遺傳改造的菌株性能重現性好，經改造的阿維菌素產生菌遺傳穩定，不易突變，發酵產物中不再產生阿維菌素A和Bla組分，95wt%以上產物為阿維菌素 B2a ；
[0134](2)將產物阿維菌素B2a作為前體，可以合成高純度阿維菌素Bla和伊維菌素，極大地簡化了伊維菌素的生產工藝，提高了生產效率，顯著降低了生產成本；
[0135](3)本發明經基因工程修飾后的基因工程菌發酵組份明確單一，后提取工藝中不再利用甲苯等有毒溶 劑，極大地改善了勞動條件和生產的安全性；減少了其他組份作為廢棄物被放棄導致的生物量的浪費和由此導致的環境污染；
[0136](4)由于阿維菌素組份的純化，由此生產出來的生物農藥含有低效結構類似雜質物的減少，施藥過程中能極大地延緩昆蟲耐藥性的產生。
[0137]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實驗室手冊(New York: ColdSpring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0138]實施例1
[0139]阿維菌素生物合成基因aveD失活(aveD點突變)菌株的構建
[0140]1.構建用于aveD點突變的重組質粒
[0141]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveD基因上游DNA片段的引物序列如下:
[0142]引物1:5’ -TAT GAA TTC CCT CGT CGA GGT GGC CGA G-3’(下劃線為 EcoRI 位點)(SEQ ID NO:4)
[0143]引物2:5’ -TTA AAG CTT ACC GCA GCC GAC GTC CAG G-3’(下劃線為 HindIII)(SEQ ID NO:5)
[0144]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveD基因下游DNA片段的引物序列如下:
[0145]引物3:5’ -TTA AAG CTT AAG CCG GCG GTG CGG CTC G-3’(下劃線為 HindIII)(SEQ ID NO:6)
[0146]引物4:5，-TTA TCT AGA TCC TCA CCC TTT CCC CCG GC-3，(下劃線為 XbaI) (SEQID NO:7)
[0147]以抽提的阿維菌素產生菌除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267的總DNA為模板，分別用上述兩組特異性引物對阿維菌素生物合成基因aveD的上下游序列進行PCR擴增，獲得基因簇上游的2.0kb的擴增片段與下游的1.Skb的擴增片段。將這兩個片段分別進行EcoR1-HindIII和HindII1-XbaI酶切后，連入市售的pKC1139 ( —種溫度敏感的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，US5，955，319)的EcoR1-XbaI位點，從而獲得aveD點突變的重組質粒pVLlOOl。將aveD保守DxGxGxG區域中的第79位甘氨酸(Gly)突變為亮氨酸(Leu)，同時將第78位的絲氨酸(Ser)突變為賴氨酸(Lys)，從而形成HindIII位點。
[0148]將重組質粒pVLlOOl轉化常規的大腸桿菌E.coli DH5 α，挑取單克隆菌落于LB培養液(含有阿伯拉霉素抗生素100 μ g/mi)中培養過夜，至菌液較濃。提取重組質粒，經酶切驗證后，進行商業測序，結果證明，重組穿梭質粒構建正確。
[0149]2.aveD點突變突變株mVLlOOl的構建和篩選 [0150]將驗證正確的質粒pVLlOOl轉化入常規的甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coli ET12567 (參見US7，326，782和US7，105,491)，通過接合轉移的方法，將質粒pVLlOOl導入阿維菌素產生菌 Streptomyces avermectiniusATCC31267 中。
[0151]選出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，將接合子置于37°C生長，使質粒pVLlOOl中的aveD基因上游或下游片段與染色體上的同源片段發生一次同源重組，然后將37°C生長良好的結合子接入不含任何抗生素的TSB液體培養基(培養基購自Sigma-Aldrich公司)中，在30°C下培養兩天后取少量菌液重新接種入無抗生素的TSB液體培養基中，如此重復2輪之后，將菌液在MS固體培養基上劃線，挑選喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落。
[0152]由于在無抗生素條件下培養，導入鏈霉菌的質粒中約3-5%會與基因組發生二次同源重組，從而喪失阿伯拉霉素抗性。對于選出的喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落，抽提DNA，用PCR產物進行酶切的方法確定基因型。
[0153]使用的引物為:
[0154]引物5:5，-CCC CGC CGT CCA TCC TCT G_3，(SEQ ID NO:8)；
[0155]引物6:5’ -TAC CGC GGC CGC ACT CAC G_3’ (SEQ ID NO:9)；
[0156]野生型的2.0lkb PCR產物不能被HindIII酶切，而正確的aveD點突變突變株的
2.0lkb PCR產物能被HindIII酶切成0.59kb和1.42kb，經PCR產物酶切和測序鑒定，發明人成功構建了正確aveD基因點突變的基因工程改造菌株，命名為mVLlOOl。
[0157]實施例2
[0158]阿維菌素生物合成基因aveC aveD雙突變菌株的構建
[0159]1.構建aveC同框敲除的質粒
[0160]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveC基因上游DNA片段的引物序列如下:
[0161]引物7:5’ -TTA GAA TTC CAT CAC GCT GCT GGA CTT CG-3’(下劃線為 EcoRI 位點)(SEQ ID NO:10)
[0162]引物8:5’ -ACG CCT GCA GGG CCA GAA ACA G-3’ (下劃線為 PstI) (SEQ ID NO:
11)
[0163]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveC基因下游DNA片段的引物序列如下:
[0164]引物9:5’-TAT CTG CAG GTG AAT GCC GTG ATG TTC CTC-3’(下劃線為 PstI)(SEQ ID NO:12)
[0165]引物10:5’-TAT TCT AGA TGC TCT CCT CCA CCA CAT CCT C_3’(下劃線為 XbaI)(SEQ ID NO:13)
[0166]以抽提的阿維菌素產生菌除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267的總DNA為模板，分別用上述兩組特異性引物對阿維菌素生物合成基因aveC的上下游序列進行PCR擴增，獲得基因簇上游的1.87kb的擴增片段與下游的1.9kb的擴增片段。將這兩個片段分別進行EcoR1-PstI和Pst1-XbaI酶切后，連入pKC1139 ( —種溫度敏感的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，US5，955，319)的EcoR1-XbaI位點，從而獲得aveC同框敲除的重組質粒pVL1002。其中aveC同框缺失756bp。
[0167]將重組質粒pVL1002轉化常規的大腸桿菌E.coli DH5 α，挑取單克隆菌落于LB培養液(含有阿伯拉霉素抗生素100 μ g/mi)中培養過夜，至菌液較濃。提取重組質粒，經酶切驗證后，進行商業測序，結果證明，重組穿梭質粒構建正確。
[0168]2.aveC同框敲除突變株mVL1002的構建和篩選
[0169]將驗證正確的質粒pVL1002轉化入常規的甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coliET12567 (可參見US7，326，782和US7,105,491)，通過接合轉移的方法，將質粒pVL1002導入按照實施例1構建的aveD點突變的菌株mVLlOOl中。選出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，將接合子置于37°C生長，使質粒PVL1002中的aveC基因上游或下游片段與染色體上的同源片段發生一次同源重組，然后將37°C生長良好的結合子接入不含任何抗生素的TSB液體培養基(購自Sigma-Aldrich公司)中，在30°C下培養兩天后取少量菌液重新接種入無抗生素的TSB液體培養基中，如此重復2輪之后，將菌液在MS固體培養基上劃線，挑選喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落。
[0170]由于在無抗生素條件下培養，導入鏈霉菌的質粒中約3-5%會與基因組發生二次同源重組，從而喪失阿伯拉霉素抗性。對于選出的喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落，抽提DNA，用PCR的方法確定基因型。
[0171]引物11:5’ -CCC CGC CGT CCA TCC TCT G_3’ (SEQ ID NO:14)；
[0172]引物12:5’ -TAC CGC GGC CGC ACT CAC G_3’ (SEQ ID NO:15)；
[0173]出發菌株aveD點突變的突變株得到1.19kb PCR產物，而正確的aveCaveD雙突變菌株得到0.43kb PCR產物。PCR產物經測序鑒定，發明人成功構建了正確aveCaveD基因雙突變的基因工程改造菌株，命名為mVL1002。
[0174]實施例3
[0175]meiC異源回補菌株的構建
[0176]1.構建meiC異源回補的質粒
[0177]PCR克隆梅嶺霉素生物合成基因meiC的引物序列如下:
[0178]引物13:5’-TAT GGA TCC CTG CGC AAT AGG CTC ACC AC-3’(下劃線為 BamHI 位點)(SEQ ID NO:16)
[0179]引物14:5’ -TAT TCT AGA CGG GAG GTG TCT ACA AGT GC-3’ (下劃線為 XbaI 位點)(SEQ ID NO:17)
[0180]以抽提的梅嶺霉素產生菌南昌鏈霉菌Streptomyces nanchangensis的總DNA為模板，用上述一對特異性引物對梅嶺霉素生物合成基因meiC的進行PCR擴增，獲得1.7kb包含完整meiC基因片段的PCR產物。將PCR產物進行BamH-XbaI酶切后，連入常規市售的含有紅霉素啟動的pSET152( —種整合型的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒，可參見USl，171，583)的BamH-XbaI位點，從而獲得用于meiC異源回補的重組質粒pVL1003。
[0181]將重組質粒pVL1003轉化常規的大腸桿菌E.coli DH5 α，挑取單克隆菌落于LB培養液(含有阿伯拉霉素抗生素100 μ g/mi)中培養過夜，至菌液較濃。提取重組質粒，經酶切驗證后，測序結果證明，重組穿梭質粒構建正確。
[0182]2.meiC異源回補菌株mVL1003的構建和篩選
[0183]將驗證正確的質粒pVL1003轉化入常規的甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coliET12567 (參見US7，326，782和US7，105,491)，通過接合轉移的方法，將質粒pVL1003導入按照實施例2構建的aveCaveD雙突變的菌株mVLlOOl中。選出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，將接合子置于30°C生長，即獲得meiC異源回補的基因工程菌株，命名為mVL1003。
[0184]除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius) mVL1003,于 2012 年 10 月 18 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國北京市)，保藏號為CGMCC N0.6678。
[0185]實施例4
[0186]重組菌株的發酵及檢測
[0187]1.種子活化及培養
[0188]將_80°C保存 的重組菌株mVLlOOl、mVL1002和mVL1003的孢子涂布在MS固體培養基(黃豆餅粉2%，D-甘露醇2%，瓊脂2%)上，30°C培養7天。切下約Icm2的含孢子和菌絲的瓊脂塊接入一級發酵培養基(玉米淀粉3%、豆柏粉0.8%、花生餅粉1%、酵母浸提物0.4%、淀粉酶4 μ /g淀粉)，30°C、200rpm培養48小時，獲得用于下一步實驗的種子培養液。
[0189]2.擴大培養
[0190]按10%體積的接種量將種子培養液接入發酵培養基(玉米淀粉14%，豆柏粉2%，酵母粉1%，鑰酸鈉0.22%，硫酸銨0.5%)，30°C、200rpm，培養8天。收獲發酵液，得到含有阿維菌素B2a的粗產物。低溫保存，用于產量檢測。
[0191]3.發酵產物檢測
[0192]檢測產物準備:發酵液加入4倍體積的甲醇浸泡，超聲15分鐘，離心取上清，將甲醇稀釋3倍以后用于HPLC和LC-MS檢測。
[0193]HPLC和LC-MS分析檢測條件:
[0194]儀器:Agilent1100HPLC 系統；
[0195]柱子=AgilentZORBAX SB-C18 柱(4.6x250mm)；
[0196]檢測波長:UV=245nm;
[0197]流速:lml/min;
[0198]流動相:Α=Η20;B=甲醇；
[0199]采用85%B/15% A恒梯度洗脫條件為，洗脫時間為20min。
[0200]結果:不同菌株發酵產物HPLC分析結果如圖2所示。
[0201]I為出發菌株發酵產物HPLC分析結果，產生阿維菌素8個組分，其中B2a組分約占總組分的30%。
[0202]II為aveD點突變的突變株mVLlOOl發酵產物HPLC分析結果，只產生阿維菌素B組分，其中B2a組分約占總組分的42%。
[0203]III為在mVLlOO I進行aveC敲除后突變株mVL1002的發酵產物HPLC分析結果，完全不產阿維Bla組分，僅產生微量的B2a組分。
[0204]IV為在mVL1002中異源回補meiC得到的突變株mVL1003發酵產物HPLC分析結果，只產生阿維菌素B2a單一組分，其中B2a組分約占總組分的95%以上。
[0205]結果表明，發明人通過對野生型除蟲鏈霉菌進行基因工程改造，獲得菌種的發酵產物95wt%以上為阿維菌素B2a組份，不再產生阿維菌素A組分和Bla組分。
[0206]實施例5
[0207]阿維菌素B2a組份活性檢測
[0208]測試方法:對棉蚜殺蟲活性實驗:取干凈新鮮的瓜葉I小片，用小號毛筆將大小、體色一致的棉姆蟲(A phis gossypii Glover)挑選30條于其上,將葉片連試蟲一起浸入藥液中2s后取出，立即用吸水紙將棉蚜蟲周圍多余的藥液吸凈，將葉片放入50ml的塑料杯中，杯口用紗布以橡皮筋套緊以防蚜蟲逃逸，將試蟲放入(27±1) 1:相對濕度85%的恢復室中，16h后檢查結果。死亡標準為，以小號毛筆輕輕觸動蟲體，試蟲不動且無任何反應者視為死亡，以死蟲數占總蟲數的百分數為死亡率。同時設清水對照，以清水對照按Abbott公式計算校正死亡率。每藥劑設0.50、1.50和2.50mg/L三個質量濃度，各質量濃度下重復2~3次。
[0209]結果表明:本發明制備的阿維菌素B2a具有良好的生物活性。
[0210]實施例6
[0211]阿維菌素B2a組份作為前體轉化為其他的化合物的實驗
[0212]阿維菌素B2a組分合成活性更優的Bla組分的方法:通過叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰氯對B2a 4”和5位-OH基進行選擇性的烷基化保護，用0_4_甲基苯基氯甲酸酯對23位-OH基進行烷基化，將得到的烷基化產物在1，2，4-三氯苯中200°C水解I小時，得到C22-C23位成雙鍵的化合物。用P-甲苯磺酸處理后得到4”和5位雙羥基乙?；揎椀难苌?，最后甲醇鈉-甲醇(0.2M，60分鐘，18°C)處理得到活性更優的Bla組分。
[0213]阿維菌素B2a組分合成伊維菌素的方法:通過叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰氯對B2a 4”和5位-OH基進行選擇性的烷基化保護，用0_4_甲基苯基氯甲酸酯對23位-OH基進行烷基化，將得到中間體以甲苯為溶劑，偶氮二異丁腈作為催化劑進行I小時回流反應，得到C23位脫氧的產物，通過薄層色譜分離后立即在甲醇中用P-TSOH X H20處理得到4”和5位雙羥基乙酸酯修飾的C23位脫氧衍生物，最后用甲醇鈉-甲醇(0.2M，60分鐘，18°C )處理得到伊維菌素。
[0214]結果表明:本發明制備的阿維菌素B2a可以成功進行后續的轉化合成。
[0215]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種阿維菌素產生菌，其特征在于，所述的產生菌的發酵產物中，阿維菌素B2a組分的相對含量滿足式1:
B/A ≥ 35% 式I 其中， B為發酵產物中阿維菌素B2a組分的質量； A為發酵產物中所有阿維菌素組分總的質量。
2.如權利要求1所述的阿維菌素產生菌，其特征在于，所述產生菌的基因組中的aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因、或不表達AveD蛋白、或表達的AveD蛋白無功能。
3.如權利要求2所述的阿維菌素產生菌，其特征在于，所述產生菌的基因組中aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達aveC基因、或不表達AveC蛋白、或AveC蛋白無功能；并且， 所述產生菌的基因組中含有或表達aveC的同源基因；或所述產生菌中表達AveC蛋白的同源蛋白。
4.如權利要求3所述的阿維菌素產生菌，其特征在于，所述aveC的同源基因選自下組:美貝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克馬丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
5.如權利要求1所述的阿維菌素產生菌，其特征在于，它是除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius)mVL1003，保藏編號為 CGMCC N0.6678。
6.權利要求1中所述的阿維菌素產生菌的用途，其特征在于，它被用做發酵生產阿維菌素B2a組分的工程菌。
7.一種制備阿維菌素B2a組分的方法，其特征在于，包括步驟: (a)培養權利要求1所述的阿維菌素產生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a的發酵產物；和 (b)從發酵產物中分離出所述的阿維菌素B2a組分。
8.—種生產阿維菌素Bla組分的方法，其特征在于，包括步驟: (a)培養權利要求1所述的阿維菌素產生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發酵產物； (b)從發酵產物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和 (C)將分離的阿維菌素B2a轉化為阿維菌素Bla組分。
9.一種生產伊維菌素的方法，其特征在于，包括步驟: (a)培養權利要求1所述的阿維菌素產生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發酵產物； (b)從發酵產物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和 (C)將分離的阿維菌素B2a組分轉化為伊維菌素。
10.一種制備阿維菌素產生菌的方法，其特征在于，包括步驟: (I)對生產伊維菌素的出發菌進行aveD基因和或AveD蛋白的遺傳改造，從而獲得基因組中aveD基因失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因、或不表達AveD蛋白、或表達的AveD蛋白無功能的阿維菌素產生菌； 并且，在所述生產伊維菌素的出發菌的發酵產物中，阿維菌素B2a組分的相對含量滿足式II:
B/A < 35% 式II 其中， B為發酵產物中阿維菌素B2a組分的質量； A為發酵產物中所有阿維菌素組分總的質量。
11.一種基因組合，其特征在于，所述的基因組合與出發(或原始)的生產伊維菌素的基因組合相比，具有選自下組的一個或多個特征: (1)所述基因組合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達aveD基因；或 (2)所述基因組合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達aveC基因；并且，含有或表達aveC的同源基因。
【文檔編號】C12R1/465GK103834605SQ201210477320
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月21日 優先權日:2012年11月21日
【發明者】劉 文, 趙群飛 申請人:中國科學院上海有機化學研究所, 中國科學院上海有機化學研究所湖州生物制造創新中心