專利名稱：蘋果抗逆相關基因MdSIMYB2的克隆及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蘋果抗逆相關基因MdSMYB2的克隆及其應用，屬于分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
植物一生中經常遭受各種不良環境和病蟲害的侵襲，在長期的適應與進化過程中，植物形成了一系列防御反應機制，用來抵抗不良環境的傷害。其中，環境脅迫主要包括各種生物脅迫和非生物脅迫。生物脅迫主要來自昆蟲、食草動物、植物病菌等；非生物脅迫種類眾多，包括干旱、鹽潰、極端溫度、化學污染和氧損傷等脅迫。為了適應繁雜多變的環境，減少不利環境對機體的傷害，植物體內演化出了涉及多基因、多信號途徑、多基因產物的復雜過程。其中，MdSIMYB2基因對非生物脅迫具有抵抗能力。
蘋果是世界性果品，是溫帶地區的主要栽培樹種。其適應能力較強，果品營養價值較高，耐貯性好，供應周期長，世界上很多國家都將其列為主要消費果品而大力支持。但是在蘋果的生長發育過程中，許多非生物脅迫是影響蘋果地理分布和產量提高的主要限制因子，尤其是高鹽、干旱和低溫等，世界蘋果生產國都把選育抗鹽、抗旱、抗寒等優質蘋果新品種作為主要育種目標。由于蘋果是多年生木本植物，遺傳背景復雜、雜和度高、童期長、自交親和性差等諸多問題給遺傳育種帶來了很大障礙，常規育種進展緩慢。近年來，蘋果基因組的測序(Velasco等，2010)的完成、以及迅速發展的現代生物技術為解決這些問題開辟了新途徑，通過基因工程技術有目的提高果樹抗鹽、抗旱、抗寒能力，成為果樹遺傳改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分離和鑒定則為基因工程遺傳改良提供了目的基因。MYB轉錄因子在植物防衛反應和逆境脅迫應答過程中扮演著非常重要的角色(劉蕾等，2008)。MYB基因在植株中的過量表達能夠顯著提高植物的抗非生物脅迫能力，在植物抗逆反應過程中，當植物收到外界環境脅迫時植物通過信號轉導途徑調控體內相關基因的表達，進而引發一系列生理、生化反應，降低或消除給植株帶來的傷害。目前對MYB的研究主要集中在擬南芥、水稻，大豆上等少數模式植物上，而在果樹方面研究較少。由于諸多方面的原因，可耕土地面積越來越少，再加上低溫、干旱、土壤鹽潰化和病、蟲害導致果樹的種植面積和范圍受到嚴重影響。因此挖掘蘋果MYB基因并進行功能研究，為果樹抗逆轉基因育種提供潛在的有效候選基因，不但具有重要的理論意義，而且具有廣泛的應用價值。蘋果轉基因育種多在蘋果砧木上進行，而蘋果砧木主要生活在地下，不開花坐果，減少了基因工程在果樹應用上的爭議。隨著人們對蘋果品質的要求越來越高，品種的改良問題成為科研工作者的一項重要任務，因此蘋果育種在世界各國果樹研究工作中不斷得到加強。但是，蘋果為多年生木本植物，通過常規育種選育抗性品種周期長。
三、發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種蘋果抗逆相關基因MdSMYB2的克隆方法及核苷酸序列，同時提供了該基因在獲得抗逆，尤其是在抗旱、抗鹽、抗低溫的轉基因番茄和蘋果中的應用，并可應用于生產改良其他糧食作物或經濟作物。本發明利用同源克隆和RACE技術從蘋果嘎啦中獲得了蘋果新型抗逆境相關基因MdSMYB2，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示，蛋白質氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。具體方法如下經NaCl處理24h的嘎啦蘋果組培苗提取總RNA，反轉錄得到cDNA。根據國際基因庫中已發布的擬南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，設計兼并引物，進行常規聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)。將所得PCR產物與pMD18_T載體連接，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，篩選重組子，并進行測序分析確認；再通過5' -RACE和3' -RACE技術分別獲得5'和3'端序列，拼接成完整的cDNA序列。根據cDNA的3'和5'端序列設計特異引物，以嘎啦蘋果組培苗的cDNA為模板進行PCR擴增，得到cDNA全長 序列。利用RACE方法克隆該基因得到1401bp,其開放閱讀框(open readingframe, 0RF)為1095bp。該基因編碼364個氨基酸，預測分子量約為39. IOkDa,等電點PI為8.17。將其氨基酸序列在NCBI中檢索，發現與已公布的AtMYB5 (擬南芥，NM_112200. 2)、AtMYB17 (擬南芥，NM_115989. 3)、AtMYB25 (擬南芥，NM_129546. I)、PhPH4 (矮牽牛，AY973324. I)有較高的同源性，其氨基酸同源性分別為69. 23%,66. 35%,65. 38%,64. 42%。由此表明，經過上述克隆步驟得到了一個蘋果中MYB基因，該基因與鹽脅迫有關，又因我們已鑒定出MdSMYBl參與響應非生物脅迫(見專利201210197919. 5)，所以將該基因命名為MdSIMYB20該基因序列如下序列表(l)SEQ. ID. NO. I 的信息(a)序列特征長度140Ibp類型核酸拓撲結構線性(b)分析類型cDNA(C)假設否(d)反義否(e)最初來源蘋果(Malus domestica)(f)序列描述SEQ. ID. NO. ITTTTTTTTTG AACACTGAAA AAGCTTTACA 固 AGGMCC CATCGTCTTC GTCGAAAGCA 60GCAGCAGCAG CAAGTGCTAA GATGCAAA0G A0GATAACAG CGCOGTCCTC GT0GAGCAAG 120GCGGCTGGGG TTGCTGGAGG GACCAAGA0G C0GTGTTG0G CAAAGGTGGG TTTGAAGAGA 180GGGCCTTGGA CTCCCGAAGA GGACGAGCTG CTGGCAAATT ACATCAAGAA AGAAGGGGAG 240GGACGGTGGC GGACCCTTCC CAAGOGGGCT GGGTTGCTCC GCTGCGGTAA GAGCTGCCGC 300CTCCGCTGGA TGAACTATCT CCGCCCTTCT GTCAAG0G0G GCCAGATOGC CCCCGATGAA 360
GAAGATCTTA TCCTTOGCCT CCATOGCCTT CTGGGCAATC GGTGGTCTTT GATAGCTGGG 420AGGATTCCAG GCCGTACGGA CAATGAGATA AAGAACTACT GGAACACACA CCTGAGCAAG 480AAGCTGATAA GCCAAGGCAT AGATCCCAGA ACCCACAAGC CTCTCAATTC AGATCATCAC 540TCTGCTGCTG ATGATGCTGA OGTGGACAAC ACAAACAAAT CAACTGCTGT TGCTTCTTCT 600TCCAAAGCCA ATGATOGGTT CTTAAACCCT AACCCTAGTC CCCCTTCTGA TCGTCTTGTC 660CATAAAGAAG GGGATCCAAA TAACAGCCGT AATGATGGAA ACATCGCAAT TGCTGATCAT 720GATCTGGGCA CTATAGTCCA TGGCTTTGCA AATATGATCA CGTCCATCAA CAATCCOGAT 780GCTTCTTCTT CGGCCGCGGC AAOGGGTACT TTGAGTTTGA GGAGCAACAA CAGCCAOGGT 840 GGAGTACTAC TTGGGGGAGG AGGAAATGAA GAGGACGAOG TCTTCTCTTC GTTTCTGAAT 900TCGTTGATCA ATGAGGATCC ATTTCCTGGA CAACACCAAT TGCAACAAGT ACTGCAGAAT 960GGGAATGTTA GTGCACAOGC AGCTGCTGCT CGTTCCGAGA ACCTTCCTTT GATTACTATG 1020ACTAGTACTA CGGOGCCATC AACATTTGGC TGGGAGTCTG COGTGCTCAT GTCTTCTGCT 1080TTCATCCAAA ATGATCACCA GAGCGTTAAT GAT CAAACGG AGj~n CAGCT AGCCACCTGT 1140TTGATTGATC AGTOGCACTG TGCATGTTGA ACAAGCAATG CGGTTGCTTA ATTAGTTAAT 1200TTATATGTAG AAATTAGTCC TAGCTAGGGT TTGAAATATC ATATGAAATG TGATTTTGTG 1260TGCTATCTCT ATTCTTAATT ATTCGACTAC CCCAACATOG CTCTAOGAAT GGGGGCGTAT 1320ATCAATGTAT TGTOGATCAC GTTTGTAATA TCATCTATCT ATCTATATAT GTTACCGGTA 1380TTGTAAAACA AACATAAAAA A1401說明透明方框中的M表示起始密碼子，而黃色方框內的畫I表示終止密碼子。(2 ) SEQ. ID. NO. 2 的信息(a)序列特征編碼區長度364個氨基酸類型氨基酸拓撲結構線性(b)分析類型蛋白質(c)序列描述SEQ. ID. NO. 2MET Arg Asn Pro Ser Ser Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ser51015Ala Lys MET Gln Thr Thr lie Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Lys202530Ala Ala Gly Val Ala Gly Gly Thr Lys Thr Pro Cys Cys Ala Lys354045Val Gly Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Leu505560Leu Ala Asn Tyr lie Lys Lys Glu Gly Glu Gly Arg Trp Arg Thr657075Leu Pro Lys Arg Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg
80 8590Leu Arg Trp MET AsnTyr Leu Arg Pro Ser ValLys Arg Gly Gln95 100105He Ala Pro Asp GluGlu Asp Leu He Leu ArgLeu His Arg Leu110 115120Leu Gly Asn Arg TrpSer Leu He Ala Gly ArgHe Pro Gly Arg125 130135Thr Asp Asn Glu HeLys Asn Tyr Trp Asn ThrHis Leu Ser Lys 140 145150Lys Leu He Ser GlnGly He Asp Pro Arg ThrHis Lys Pro Leu155 160165Asn Ser Asp His HisSer Ala Ala Asp Asp AlaAsp Val Asp Asn170 175180Thr Asn Lys Ser ThrAla Val Ala Ser Ser SerLys Ala Asn Asp185 190195Arg Phe Leu Asn ProAsn Pro Ser Pro Pro SerAsp Arg Leu Val200 205210His Lys Glu Gly AspPro Asn Asn Ser Arg AsnAsp Gly Asn He215 220225Ala He Ala Asp HisAsp Leu Gly Thr He ValHis Gly Phe Ala230 235240Asn MET He Thr SerHe Asn Asn Pro Asp AlaSer Ser Ser Ala245 250255Ala Ala Thr Gly ThrLeu Ser Leu Arg Ser AsnAsn Ser His Gly260 265270Gly Val Leu Leu GlyGly Gly Gly Asn Glu GluAsp Asp Val Phe275 280285Ser Ser Phe Leu AsnSer Leu He Asn Glu AspPro Phe Pro Gly290 295300Gln His Gln Leu GlnGln Val Leu Gln Asn GlyAsn Val Ser Ala305 310315His Ala Ala Ala AlaArg Ser Glu Asn Leu ProLeu He Thr MET320 325330Thr Ser Thr Thr AlaPro Ser Thr Phe Gly TrpGlu Ser Ala Val335 340345Leu MET Ser Ser AlaPhe He Gln Asn Asp HisGln Ser Val Asn350 355360Asp Gln Thr Glu364
本發明提供了蘋果非生物逆境相關基因MdSMYB2在番茄、蘋果和其它植物中應用的方法，能夠提高轉基因植物抵抗干旱、低溫和鹽等逆境的能力。步驟為(a)利用如上所述的MdSMYB2基因，將cDNA序列置于花椰菜病毒CaMV35S啟動子之下，構建植物過量表達載體。(b)用農桿菌(LBA4404)介導法將構建好的表達載體導入植物細胞，獲得轉基因植株。本發明涉及一種植物表達載體，包含核苷酸序列SEQ. ID. NO. I，用于提高植物抗逆境能力，尤其是抗干旱、低溫和鹽的能力。本發明涉及將上述植物表達載體導入植物細胞中，導入方法是本領域人員熟知的 農桿菌(LBA4404)介導法，得到抗干旱、鹽和低溫的轉基因植物。草本植物番茄SNl是基因工程研究的模式植物之一，具有生活周期短、再生能力強、遺傳轉化效率高的特點，而木本植物蘋果生活周期長，遺傳轉化效率低，因而在下述實施例中以番茄和蘋果兩類植物為例對本發明進行詳細說明，但本發明中MdSIMYB2基因及含有該基因的植物表達載體也可以用于生產其它提高抗逆境能力的轉基因植物。本發明采用離體葉片接種法對獲得的轉基因番茄純合體和蘋果進行抗逆能力分析發現，轉基因番茄和蘋果中MdSIMYB2的過量表達株系，均能顯著提高其抗干旱、低溫和鹽的能力。可把該基因轉入桃樹、梨樹、楊樹等木本植物、或小麥、玉米、水稻等農作物上，從而提高轉基因植株的抗逆境能力，產生重大的經濟效益和社會價值。本發明從蘋果中分離到一個R2R3類型的MYB家族基因MdSMYB2，通過轉基因功能驗證表明它能夠抵抗高鹽，低溫，干旱等非生物逆境；并提供了一種新的、快速的育種途徑，尤其是在轉基因蘋果砧木中，MdSIMYB2基因的發掘不僅能為蘋果抗逆基因工程提供新的候選基因，豐富植物抗逆基因工程理論體系，而且對于培育其它植物的抗逆種質材料(包括一年生植物和多年生木本植物)也具有重要的現實意義。四

圖I :蘋果中MdSIMYB2蛋白結構保守域示意圖及不同R2R3類型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比較。A.蘋果的MdSIMYB2蛋白結構保守域示意圖；B.不同R2R3類型的MYB家族植物的氨基酸序列的同源性比較。其中，AtMYB5(NM_l 12200. 2)、AtMYB17 (NM_115989. 3) ,AtMYB108(NM_111525. 3)、PhPH4 (AY973324. I), R2、R3分別表示MYB家族基因的特征結構域。圖2 :蘋果中MdSMYB2蛋白的進化樹分析。其中，白花紫露草TfMYB6 (AY456184. I)，棉花 GhMYBl (L04497. I),毛果楊PtMYB180(XM_002327312. I) ,PtMYBlll (XM_002302716. I),擬南芥 AtMYB5 (NM_112200. 2)、AtMYB17 (NM_115989. 3)、AtMYB108(NM_111525. 3)，矮牽牛 PhPH4 (AY973324. I),大豆 GmW2 (AB597932. I)，水稻 0sMYB4 (D88620. I)，車前草 CpMYBlO (AF510112. I)，百脈根 LjTT2a (AB300033. 2)，大麥 HvMYB2 (X70876. I)，紅皮云杉 PgMYB5 (EF601068. I)，大豆GmMYB54 (DQ822881. I)，蛇麻草 HlMYBl (AB292244. I)。圖3 :嘎啦組培苗中MdSMYB2基因對非生物逆境的響應。BI B4.分別用干旱(2%PEG) ,NaCl (200mM)、低溫(4°C ) >ABA (100 u M)處理嘎啦蘋果組培苗0h、6h、12h、24h、48h后，MdSIMYB2基因的相對表達量。
圖4 :逆境處理后的MdSMYB2轉基因番茄苗生長狀況。A、野生型番茄和轉基因番茄株系的半定量RT-PCR檢測；B1、正常管理條件下培養6周番茄生長情況；B2.生長量一致的6周番茄苗，連續IOd不澆水做干旱處理的生長情況；B3.生長量一致的6周番茄苗，經300mM NaCl處理12d后的生長情況；B4.生長量一致的6周番茄苗，4°C低溫處理4d后的生長情況。其中，WT :對照；0E-1，0E-3，0E-4 :過量表達的轉基因株系。圖5 :逆境處理后的MdSMYB2轉基因蘋果幼苗生長情況。A、野生型蘋果和轉基因蘋果株系(MdSMYB2基因過量表達)的半定量RT-PCR檢測；其中，WT :對照；T1-T4 :過量表達的轉基因株系。B、生長6個月且長勢一致的嘎啦蘋果生根苗和MdSMYB2過量表達生根苗，經不同逆境處理后的生長情況。BI :連續15d不澆水進行干旱處理的情況；B2 :干旱處理后復水處理3d后生長情況；C1 :經300mM NaCl處理，生長至14d的生長情況；C2 :經300mM NaCl處理后，恢復生長至16d的生長情況；D1:4°C低溫條件培養16d后的生長情況；D2 :4°C低溫條件培養后置正常環境25d后的生長情況。其中，WT :對照；T-1，Τ-2，Τ-4 :過量表達的轉基因株系。五、具體實例方式以下結合具體實例，對本發明進行詳細說明。實例I :蘋果MdSIMYB2基因的克隆。一、RNA的提取及反轉錄取經200mM NaCl鹽處理24h的嘎啦蘋果組培苗葉片，提取其RNA并反轉錄一)利用天根試劑盒RNAplant Plus Reagment提取總RNA,具體方法如下I)取Ig冷凍的研磨過的蘋果葉片，加入5ml提取試劑(4°C )，振蕩混勻。2)室溫放置5分鐘。3) 40C 12，OOOrpm離心I分鐘，上清轉入新的無RNase離心管。4)每IOml上清加2ml5M NaCl,溫和混勻。5)每IOml上清加6ml氯仿，上下顛倒混勻。6)40C 10, 000離心15分鐘，取上層水相轉入新的無RNase離心管。7)加入異丙醇(與所得水相等體積)，混勻，室溫放置10分鐘。8)4。。10，000 離心 15 分鐘。棄上清，加 5_10ml75% 乙醇。9) 40C 5, OOOrpm離心5分鐘。棄上清，室溫晾干3-5分鐘。10)加入100 μ I無RNase水，混勻，充分溶解RNA。得到RNA, _80°C保存備用，或立即進行以下反轉錄實驗。二)反轉錄cDNA第一鏈的合成I)在O. 2ml的微量離心管中配制下列混合液(其RNA為實例I步驟一)提取獲得的；如用_80°C儲藏RNA，須在冰上緩慢融解)
權利要求
1.一種蘋果MdSMYB2基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.根據權利要求I所述的一種蘋果MdSIMYB2基因，其特征在于該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3.如權利要求I所述的一種蘋果MdSIMYB2基因在轉基因番茄中的應用，能提高轉基因番茄抗干旱、抗鹽和抗低溫能力。
4.如權利要求I所述的蘋果MdSIMYB2基因在蘋果中的應用，能提高轉基因蘋果抗干旱、抗鹽和抗低溫的能力。
全文摘要
本發明涉及一種蘋果抗逆相關基因MdSIMYB2的克隆及其應用；本發明利用同源克隆和RACE技術從蘋果嘎啦中獲得了蘋果新型抗逆境相關基因MdSIMYB2，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白質氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。將該基因轉入番茄，轉基因番茄株系抗旱、抗鹽和抗冷等逆境能力提高；該MdSIMYB2基因在蘋果中過量表達能提高轉基因蘋果的表達水平，同時增強轉基因蘋果株系的抗旱、抗鹽和抗冷等逆境能力。
文檔編號C12N15/29GK102978218SQ20121057925
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者郝玉金, 由春香, 曹忠慧, 王榮凱 申請人:山東農業大學