人工誘導的mle轉座子試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種人工誘導Mariner-LikeElement(MLE)轉座子轉座的試劑盒及其在植物基因突變中的應用。本發明的MLE轉座子，轉座酶由可誘導啟動子調控，人為調節轉座酶表達，控制轉座子跳躍和再跳躍，一方面解決了突變穩定性問題，回復突變也成為可控，可以在植物生長發育的任何時期，對植物的不同組織器官進行有目的的誘導轉座突變，真正實現了對誘變在時空量上的全面調控。另外，利用綠色熒光蛋白基因來報告MLE轉座子的轉座情況，可以簡便、有效的對轉座發生的植株進行篩選和轉座子插入位點進行跟蹤。
【專利說明】人工誘導的MLE轉座子試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體而言，涉及一種人工誘導的Mariner-LikeElement (MLE)轉座子試劑盒及其在植物基因突變中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著新技術新方法的不斷發展，分析鑒定基因功能的方法越來越多，大規模研究基因功能主要依賴于構建突變體庫，但最直接最有效的方法是構建飽和的基因突變群體，通過突變體分析鑒定基因功能。因此突變群體的構建是功能基因組學的基礎。隨著農桿菌介導的植物轉基因技術的不斷完善，通過創造大量的T-DNA獨立轉化子來建立T-DNA突變體庫的方法已成為快速構建插入突變體庫的主要方法。T-DNA插入突變具有插入穩定、操作簡單，但是易產生直接的串聯，反向重復和在邊界產生缺失，影響隨后的分子分析。
[0003]轉座子是指在基因組上能從同一條染色體的一個位置轉移到另一個位置或者從一條染色體轉移到另一條染色體上的一段DNA序列，具有分布廣泛、拷貝數高、插入位點專一、產生突變穩定、不受植物種類差異的影響、異源轉座率高、組織培養誘導激活等優勢。可以在不了解基因產物的生化性質和表達模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉座子標簽(transposontagging)。其原理是利用植物轉座子的插入造成基因突變，以轉座子序列為基礎，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉座子的克隆，它必定含有與轉座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因組中獲得完整的基因。
[0004]以轉座子作標簽分離基因有以下優點:(1)轉座子插入引起的突變會由于轉座子的切離而回復。(2)由于轉座子總是沿其鄰近的位點轉座，因此只要轉座子在染色體上定位后，就很容易確定與其連鎖的突變基因的相對位置。(3)由于轉座子的不斷跳躍，一旦把轉座子導入目標植物，通過自交、雜交、回交等手段便可得到一個較大的含不同插入位點的轉座子群體。(4)把轉座子導入異源植物`不受轉化條件的限制。目前利用轉座子標簽法成功克隆植物基因目前僅限于Ac/Ds和Spm/dSpm這兩類轉座子，這兩類轉座子均存在著轉座活性不高，突變效率不理想和優先轉座到與之相臨近位置的問題，是目前利用轉座子構建隨機飽和突變體群的主要障礙。因此進一步研究、挖掘新的轉座子，改進試劑盒，達到最佳標簽條件，是當前轉座子標簽法研究的主要任務。
[0005]Mariner-Like 轉座子(Mariner-LikeElements, MLE)是 DNA 轉座兀件中一個重要家族，最早是在研究毛里塔尼亞果蜆(Dr ο soph i 1 amaur i s t i ana)白眼基因的一個不穩定突變時發現的。此后在其他動物以及植物基因組中也發現了大量MLE轉座子的存在。MLE轉座子通過DNA的切除/粘貼機制來實現轉座。與其它轉座子相比較，MLE轉座子有以下三個顯著特點:(1)結構簡單，由兩端反向重復序列(TerminallnvertedRepeats, TIRs)和編碼轉座酶的基因組成，反向重復序列長度一般為10-40bp。轉座酶編碼序列長度一般為1000-1500bp,由DNA結合域和轉座催化域組成。既能催化短至200bp，僅包括TIRs及側翼序列的DNA片段轉座，也能催化攜帶有目的基因(如抗性基因)，長至6000bpDNA片段的轉座，因此MLE轉座子既可以開發成基因誘變的突變工具，也可以開發成轉運基因的轉基因工具。(2)MLE轉座子在基因組插入位點接近隨機，靶向序列為TA，統計結果表明，MLE轉座子80%插入位點位于基因5 ‘端UTR的下游和基因編碼序列，這一特點使MLE轉座子在應用于基因標簽上更優越于其他類型的轉座子。(3)異源轉座率高，絕大部分MLE轉座子轉座不依賴于宿主因子，只要有活性轉座酶和能被轉座酶識別的TIRs存在，就能實現轉座，因此從宿主克隆的轉座子導入非宿主基因組后，依然能夠保持轉座活性。因此開發出基于超活性MLE轉座子的高效試劑盒，將為大規模構建植物突變體庫和研究基因功能提供新的工具，使植物基因的分離和鑒定更加簡單易行。查詢以往專利，尚未有利用植物MLE轉座子構建轉座子試劑盒的報道。

【發明內容】

[0006]目前利用轉座子標簽法成功克隆植物基因目前僅限于Ac/Ds和Spm/dSpm這兩類轉座子，這兩類轉座子均存在著轉座活性不高，突變效率不理想和優先轉座到與之相臨近位置的問 題，是目前利用轉座子構建隨機飽和突變體群的主要障礙。因此進一步研究、挖掘新的轉座子，改進試劑盒，達到最佳標簽條件，是當前轉座子標簽法研究的主要任務。
[0007]本發明一方面涉及一種MLE轉座子試劑盒，其特征在于包括含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體以及含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉座酶序列的載體。
[0008]在本發明的一個優選實施方式中，其中含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體是將miniPpMLE21轉座子構建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉座子供體載體 pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21。
[0009]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉座酶序列的載體是轉座酶序列構建到PCAMBIA1301載體上。
[0010]本發明另一方面還涉及上述MLE轉座子試劑盒在誘變轉基因植物中的應用。
[0011]在一個優選實施方式中，所述的應用包括如下步驟:
[0012](1)將miniPpMLE21轉座子構建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉座子供體載體pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21，轉化擬南芥，通過卡那霉素篩選陽性植株；
[0013](2)轉座酶序列(SEQIDN0.3)構建到pCAMBIA1301載體，獲得轉座酶表達載體pCAMBIA1301-Tp，轉化攜帶有PpMLE21轉座子的擬南芥，通過卡那霉素和潮霉素共同篩選陽性植株；
[0014](3)通過提高培養環境的溫度，誘導轉座酶表達和轉座發生。
[0015]本發明的MLE轉座子，轉座酶由可誘導啟動子調控，人為調節轉座酶表達，控制轉座子跳躍和再跳躍，一方面解決了突變穩定性問題，回復突變也成為可控，可以在植物生長發育的任何時期，對植物的不同組織器官進行有目的的誘導轉座突變，真正實現了對誘變在時空量上的全面調控。另外，利用綠色熒光蛋白基因來報告MLE轉座子的轉座情況，可以簡便、有效的對轉座發生的植株進行篩選和轉座子插入位點進行跟蹤。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:綠色熒光指示轉座發生，其中a，b，c為不同轉基因株系綠色熒光觀察。WT為野生型。【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施步驟進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。除非特別指出，下列實例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如Sambrook.等主編的《分子克隆實驗指南》中所述條件，或按照試劑盒陳述的步驟進行操作。
[0018]一、毛竹MLE轉座子的獲得
[0019]根據MLE轉座子兩端反向重復序列，利用引物MLE21(引物詳情見表1)，從毛竹基因組擴增出轉座子PpMLE21的全長序列，序列為SEQIDN0.11。
[0020]二、擬南芥轉化載體構建
[0021]1.轉座子供體載體 pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21 的構建
[0022](1)用BseRI (識別的序列為GAGGAG (N) 10 )切除毛竹PpMLE21轉座子全長序列中轉座酶的大部分序列，再用連接酶將PPMLE21轉座子兩側的序列重新連上，命名為miniPpMLE21,(序列為 SEQIDN0.2)；
[0023](2) Xbal 酶切 pBINm-gfp5_ER 載體，將 pBINm-gfp5_ER 載體線性化；
[0024](3)通過in-fusion技術將miniPpMLE21轉座子插入到pBINm-gfp5_ER載體(商購可得)的Xbal酶切位點，獲得重組載體pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21。當miniPpMLE21轉座子轉座離開，后面的綠色熒光蛋白基因可以正常表達，可通過綠色熒光蛋白基因表達與否方便分析轉座情況。
[0025]2.轉座酶表達載體pCAMBIA1301_hspTp的構建
[0026](1)將PART7載體上的基因表達單元通過sacl和PstI從載體切下來；同時利用sad和PstI將pCAMBIA1301載體(商購可得)線性化；通過連接酶將來源于PART7載體的基因表達單元插入到PCAMBIA1301載體sacl和PstI兩個酶切位點之間獲得重組載體pCAMBIA1301-ex ；
[0027](2)利用引物MLE21-TP-5和MLE21-TP-3通過PCR技術將PpMLE21轉座酶序列(序列為SEQIDN0.3)兩端添加Sma I和BamH I酶切位點，PCR擴增后，用Sma I和BamH I雙酶切PCR產物，同時利用Smal和BamHI酶切pCAMBIA1301_ex載體，通過連接酶將PpMLE21轉座酶的cDNA序列引入pCAMBIA1301-ex載體Smal和BamHI兩個酶切位點間，獲得重組載體 pCAMBIA1301-Tp ；
[0028](3)通過PCR技術將大豆熱激啟動子一Gmhspl7.5C啟動子(序列SEQIDN0.4)從大豆的基因組擴增出來(引物為Gmhsp-5和Gmhsp-3)，并引入sacl和ΚρηΙ兩個酶切位點，經測序驗證后，將Gmhspl7.5C啟動子序列和pCAMBIA1301_Tp載體通過sacl和ΚρηΙ雙酶切，用Gmhspl7.5C啟動子替換pCAMBIA1301_Tp載體轉座酶前的35S啟動子，獲得重組載體pCAMBIA1301-hspTp。轉座酶的表達可以通過環境溫度來調控。
[0029]三、擬南芥的轉化
[0030]擬南芥種子在8%NaC10乙醇溶液中消毒6_8min，用無水乙醇洗滌待播種種子5次以上，用無棉紙吸干無水乙醇，在超凈工作臺上吹干，將種子均勻播撒在1/2MS培養基上，4°C沉積3天，然后放在擬南芥栽培室光下正常培養(栽培室條件:溫度23°C，濕度60-70%，光強150umol.s-1.m_2)。待一周后長出1對真葉，將擬南芥幼苗移至基質中培養3周左右抽薹開花，去掉主薹，大約一周后，抽出的蓮座葉側枝大量開花，剪掉已經結莢的果莢，準備轉化。
[0031]取5mL農桿菌(EHA105)加入100mL含50 μ g/mL利福平(Rif )+50 μ g/mL卡納青霉素(Kan )液體 YEP (配方:酵母提取物，10g/L ;蛋白胨，10g/L ;NaCl，5g/L)中，28 °C，180rpm,搖菌過夜使其0D600達到L 0-1.2,4000rpm,離心15min，棄上清，加入lOOmL浸潤法培養基(l/2MS+5%蔗糖)，并加入表面活性劑Silwet-77，使其終濃度達0.02%。將重懸的農桿菌菌液置于培養皿中，將擬南芥花序完全浸沒在溶液中，保持30s-60s。用保鮮膜保濕，向周轉柜中加水，暗室培養24h后，光下正常培養。隔5天左右可對已浸染植株再次浸染，提高轉化率。種子成熟后適當減少澆水次數，待種莢發黃開裂時收獲種子，用于下一代的篩選。
[0032]四、轉基因陽性植株篩選和鑒定
[0033]導入轉座子供體載體pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21的擬南芥種子播撒到含50mg/L卡那霉素的1/2MS培養基中篩選，抗性植株通過PCR驗證(引物為MLE21)，能擴增出1.2kb左右的目的條帶為陽性植株
[0034]以上述陽性擬南芥植株為受體，繼續轉化轉座酶表達載體pCAMBIA1301_hspTp，將收獲的擬南芥種子播撒到含50mg/L卡那霉素+50mg/L潮霉素的1/2MS培養基中篩選，轉基因抗性植株通過PCR驗證(引物為MLETP21-5和MLE21TP-3)，能擴增出1.5kb左右的目的條帶為陽性植株，該陽性轉基因植株命名為雙陽性植株。
[0035]五、轉座誘導和轉座事件的鑒定
[0036]( 1)雙陽性植株的轉座誘導
[0037]42°C連續熱激兩次雙陽性植株的幼苗，每次2小時可以誘導最高的轉座活性。然后放在21°C恢復培養，同時增加 培養環境的濕度，兩天后在突光顯微鏡下觀察突光。
[0038](2)綠色熒光觀察
[0039]取擬南芥新鮮的葉片，手工撕成0.1-1.0mm薄片，將熒光顯微鏡的光源波長調到477nm處，觀察綠色熒光的位置。有綠色熒光點的細胞表明有轉座發生。從圖1中可以看出和野生型相比，經過高溫誘導后，可看到大量發生轉座的細胞(綠色熒光的部分)。這說明，構建的Mariner-LikeElement (MLE)轉座子試劑盒可以在人工誘導下轉座，并保持較高的轉座效率。
[0040]表1引物表
[0041]
【權利要求】
1.一種MLE轉座子試劑盒，其特征在于包括含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體以及含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉座酶序列的載體。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中含有核苷酸序列為SEQIDN0.2的miniPpMLE21的載體是將miniPpMLE21轉座子構建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉座子供體載體pBINm-gfp5_ER-miniPpMLE21ο
3.根據權利要求1所述的試劑盒，所述的含有核苷酸序列為SEQIDN0.3的轉座酶序列的載體是轉座酶序列構建到PCAMBIA1301載體上。
4.上述MLE轉座子試劑盒在誘變轉基因植物中的應用。
5.根據權利要求1所述的應用，所述的應用包括如下步驟:(1)將miniPpMLE21轉座子構建到pBINm-gfp5_ER載體上，獲得轉座子供體載體pBINm-gfp5-ER-miniPpMLE21，轉化擬南芥，通過卡那霉素篩選陽性植株；(2)轉座酶序列(SEQIDN0.3)構建到pCAMBIA1301載體，獲得轉座酶表達載體pCAMBIA1301-Tp，轉化攜帶有PpMLE21轉座子的擬南芥，通過卡那霉素和潮霉素共同篩選陽性植株；(3 )通過提高培養環境的溫·度，誘導轉座酶表達和轉座發生。
【文檔編號】C12N15/11GK103710342SQ201310698907
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】周明兵, 湯定欽, 楊萍, 鄭麗娜 申請人:浙江農林大學