濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物，將蕎麥蛋白、糖、水按1:1:1000～1:7:1000的質量比混合，調pH到10～12，50～70℃水浴90～120min，冰浴5～10min，-15～-25℃冷凍6-12h后進行冷凍干燥。本發明還公開了由以上方法得到的蕎麥蛋白-糖接枝物及其在功能性食品的應用。本發明還提供了一種產量較高的蕎麥蛋白的提取方法，經處理，得到了蕎麥蛋白，是一種優質的植物蛋白。本發明制備方法簡單，效果良好。測定上述蕎麥蛋白-糖接枝物的抗氧化效果，并用相同量的糖類、蕎麥蛋白、抗壞血酸作對照，結果顯示，蕎麥蛋白-糖接枝物表現出良好的抗氧化性。
【專利說明】濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物蛋白領域，具體涉及濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物及其應用。
【背景技術】
[0002]植物蛋白具有資源豐富、價格低廉、能量轉化效率高、幾乎不含膽固醇和飽和脂肪酸等優點，逐漸成為人類主要的蛋白質來源。蕎麥屬于寥科蕎麥屬雙子葉植物，具有較高的營養價值和藥用價值，被現代營養學家譽為21世紀有前途的最風行的綠色食品。蕎麥蛋白是蕎麥中的主要生物活性成分，它不同于谷類作物蛋白，蕎麥蛋白質主要是谷蛋白、水溶性清蛋白和鹽溶性球蛋白等。這類蛋白質的粘性差，無面筋性，近似于豆類植物蛋白，其蛋白質質量優于大米、小麥和玉米蛋白。從氨基酸組成來看，蕎麥蛋白含有19種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸，且氨基酸配比適宜，符合或超過聯合國糧農組織和世界衛生組織對食物蛋白質中必需氨基酸含量規定的指標，與雞蛋蛋白質的營養相似。蕎麥蛋白還具有降低液膽固醇、抑制脂肪蓄積、改善便秘、抗衰老、抑制有害物的吸收等生理功能。蕎麥蛋白具有較高的持水性、乳化性、起泡性和咀嚼性及良好的生理生化性質。這為蕎麥蛋白在食品工業的廣泛應用提供了基礎。這正是本發明的出發點。
[0003]美拉德反應，又稱羰氨反應，是指含有氨基的化合物和含有羰基的化合物之間經縮合、聚合，最終生成類黑精的反應。由于其產物是棕色的，也被稱為褐變反應。反應物中羰基化合物包括還原糖、醛、酮；氨基化合物包括氨基酸、肽、蛋白質、胺。MRPs中含有類黑精、還原酮及一系列含1、H的雜環化合物，它們有一定的抗氧化性能。通常美拉德反應所需要的氨基化合物和羰基化合物的選擇范圍非常廣泛，但是接枝物的抗氧化性各有差異。選擇適當的氨基化合物和羰基化合物，可以顯著提高接枝物的抗氧化性。
[0004]濕熱法是以液相為反應體系，一般用于蛋白質與單糖或雙糖的接枝反應中。其反應的初始步驟與干熱法類似，將蛋白質和糖按照一定的糖配比混合，并用特定PH值的緩沖溶液將其溶解，攪拌均勻后，利用水浴或者油浴進行反應，反應結束后立即冰浴。濕熱法的反應時間相對于干熱法來說要短，通常適用于蛋白質-單糖(或雙糖)接枝物的制備。
[0005]冷凍干燥是將待干燥物快速凍結后，再在高真空條件下將其中的冰升華為水蒸氣而去除的干燥方法。由于冰的升華帶走熱量使凍干整個過程保持低溫凍結狀態，有利于保留一些生物樣品的活性。因此用冷凍干燥法制備一種蕎麥蛋白-木糖接枝物。
[0006]與很多化學和酶法對蛋白質改性的方法相比，美拉德反應的方法具有很好的安全性；此外，該法還能極大的改善蛋白乳化性，改善不溶的面筋蛋白溶解性。這種以美拉德反應制備的蕎麥蛋白-糖接枝物可用作乳化劑、抗氧化劑和抑菌劑，可應用于食品、藥品和化妝品中。蕎麥蛋白被糖類接枝后，其消化率增加，利于人體吸收，本身的很多功能性質也會有所提高。因此，本發明以蕎麥蛋白為氨基化合物，以糖類為羰基化合物，利用濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物。以羥基自由基(.0Η)的清除率，二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)的清除率和超氧陰離子((V.)的清除率為考察指標，利用單因素試驗，確定制備蕎麥蛋白-糖接枝物各因素的最佳參數。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于由濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物，制備方法簡單、效果良好、易于生產。
[0008]本發明的目的是通過如下技術方案實現的:
[0009]濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物，蕎麥蛋白、糖、水按1:1:1000?1:7:1000的質量比混合，調pH到10?12，50?70 °C水浴90?120min，冰浴5?IOmin, -15?_25°C冷凍6?12h后冷凍干燥。
[0010]優選地，所述糖為單糖。
[0011]優選地，所述蕎麥蛋白由蕎麥粉經堿溶酸沉法的提取方法制備。
[0012]優選地，所述提取方法的操作步驟如下:
[0013]第一步、取質量比為1:6?1:14的蕎麥粉和水混合，調節pH到10?12，攪拌，離心得到上清液；調節所述上清液的pH到4.5，離心獲得沉淀物；
[0014]第二步、將第一步所得的沉淀物經透析、冷凍干燥得蕎麥蛋白。
[0015]優選地，第一步中，所述攪拌是在2(TC磁力攪拌30?120min ；
[0016]所述離心是10 ?30°C下，4000 ?5000r/min 離心 10 ?20min。
[0017]優選地，所述第二步具體操作為所得的沉淀物用流動水透析18?24h，用去離子水透析18?24h后，低溫靜置18?24h，經冷凍干燥獲得蕎麥蛋白粉末。
[0018]本發明還提供所述濕熱法制備的蕎麥蛋白-糖接枝物。
[0019]本發明還提供所述蕎麥蛋白-糖接枝物在功能性食品中的應用。
[0020]本發明提供了一種蕎麥蛋白的制備方法，經處理，得到了蕎麥蛋白，是一種優質的植物蛋白。這種蛋白與糖經過濕熱法美拉德反應，制備了蕎麥蛋白-糖接枝物。本發明制備方法簡單，效果良好。測定上述蕎麥蛋白-糖接枝物的抗氧化效果，并用相同量的糖、蕎麥蛋白、抗壞血酸作對照，結果顯示，蕎麥蛋白-糖接枝物表現出良好的抗氧化性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]本發明附圖4幅，
[0022]圖1、蕎麥蛋白-糖接枝物對羥自由基(.0H)的清除；
[0023]圖2、蕎麥蛋白-糖接枝物對二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)的清除；
[0024]圖3、蕎麥蛋白-糖接枝物對超氧陰離子(02_.)的清除；
[0025]圖4、蕎麥蛋白-糖接枝物的溶解率。
【具體實施方式】
[0026]下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0027]以下結合具體的實例對本發明的技術方案做進一步說明:
[0028]本發明所用蕎麥粉為市售普通蕎麥粉。
[0029]實施例1[0030]蕎麥蛋白的制備
[0031]蕎麥蛋白的提取方法如下:
[0032]第一步、取蕎麥粉與水按1:10的質量比混合，用Imol/LNaOH調pH到10后，20°C磁力攪拌30min ；20°C >5000r/min離心20min得到上清液；再用lmol/LHCl調pH到4.5,產生沉淀后2(TC、4000r/min離心15min,離心獲得沉淀物；
[0033]第二步、所得的沉淀物用流動水透析18?24h，用去離子水透析18?24h后，低溫靜置18?24h，經冷凍干燥獲得米白色蕎麥蛋白粉末。
[0034]實施例2
[0035]蕎麥蛋白-木糖接枝物的制備及抗氧化性的研究
[0036]—、將所得米白色蕎麥蛋白粉末與木糖制備成蕎麥蛋白-木糖接枝物，接枝物的的原材料是以蕎麥蛋白為氨基化合物，以木糖為羰基化合物:將蕎麥蛋白、木糖、水按1:5:1000的質量比混合，用Imol/LNaOH調pH到12，在溫度50°C的條件下水浴120min，反應結束后立即冰浴5min，然后-20°C冷凍6?12h，冷凍干燥成粉末得到蕎麥蛋白-木糖接枝物粗產品，4 V條件下保存。
[0037]二、將所得蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物進行抗氧化性比對
[0038]1、蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物對羥基自由基(.0H)清除率的測定
[0039]取磷酸鹽緩沖液(0.15mol/L，pH7.4) 1.5mL, 1.10-菲咯啉(0.75mmol/L) 1.0mL,新配制的硫酸亞鐵溶液(0.75mmol/L) ImL,再加入濃度為1.2mg/mL的蕎麥蛋白水溶液或蕎麥蛋白-木糖接枝物水溶液lmL，最后再加入0.01 %的過氧化氫1.0mL,混勻后于37°C恒溫水浴中保溫30min，冷卻后在530nm處測吸光度值。以蒸餾水調零，空白組以等體積去離子水代替樣品溶液，對照組以等體積去離子水代替樣品溶液和過氧化氫溶液，以同一濃度的抗壞血酸水溶液代替樣品作對比實驗。結果按下式計算:
[0040]清除率(％ ) = [A對照-A樣品/A對照-A空白]X 100
[0041]測定蕎麥蛋白、蕎麥蛋白-木糖接枝物和抗壞血酸對羥基自由基(.0H)清除率，蕎麥蛋白-木糖接枝物的清除率較蕎麥蛋白的清除率提高了很多，結果表明蕎麥蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力強于蕎麥蛋白(見表4、圖1)。
[0042]2、蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物對二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)清除率的測定
[0043]取濃度為1.2mg/mL的蕎麥蛋白水溶液或蕎麥蛋白-木糖接枝物水溶液2.0mL,分別加入0.2mmol/L的DPPH溶液2.0mL,混勻后避光反應靜置30min。以無水乙醇調零，在517nm處測定吸光度值A#s，無水乙醇代替DPPH溶液的吸光度值為AWM，無水乙醇代替樣品溶液的吸光度值為Ase,以同一濃度抗壞血酸水溶液代替樣品作對比實驗。結果按下式計算:
[0044]清除率(％ ) = [1_(A樣品-A對照)/A空白]X 100
[0045]測定蕎麥蛋白、蕎麥蛋白-木糖接枝物和抗壞血酸對二苯基苦基苯肼自由基(DPPH.)清除率，蕎麥蛋白-木糖接枝物的清除率較蕎麥蛋白的清除率有所提高，結果表明蕎麥蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力強于蕎麥蛋白(見表5、圖2)。
[0046]3、蕎麥蛋白和蕎麥蛋白-木糖接枝物對超氧陰離子((V.)清除率的測定
[0047]取4.5mL的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L, ρΗ8.2)于比色管中，置于25°C恒溫水浴中預熱20min，加入濃度為1.2mg/mL的蕎麥蛋白水溶液或蕎麥蛋白-木糖接枝物水溶液
0.1mL,再加入0.4mL在25°C恒溫水浴中早已預熱好的鄰苯三酹溶液(7mmol/L),搖勻后與25°C恒溫水浴準確反應4min，然后加入2滴濃鹽酸(10mol/L)終止反應，于320nm處測其吸光度值。以同一濃度的抗壞血酸水溶液代替樣品作對比實驗。結果按下式計算:
[0048]清除率(%) = [1-(Ab-Ac)/AJ X 100%
[0049]其中:
[0050]Aa:不加樣品，加鄰苯三酚
[0051]Ab:加樣品，加鄰苯三酚
[0052]Ac:加樣品，不加鄰苯三酚(見表6、圖3)。
[0053]測定蕎麥蛋白、蕎麥蛋白-木糖接枝物和抗壞血酸對超氧陰離子(02_.)清除率，蕎麥蛋白-木糖接枝物的清除率較蕎麥蛋白的清除率有所提高，結果表明蕎麥蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力強于蕎麥蛋白。
[0054]三、將所得蕎麥蛋白與蕎麥蛋白-木糖接枝物做體內抗氧化性評價，測定超氧化物歧化酶(SOD)的活力、過氧化氫酶(CAT)的活力及丙二醛(MDA)的含量。
[0055]選取健康昆明種小鼠72只，體重20±2g，用普通飼料喂養7天以適應環境；之后隨機分為6組，每組12只，雌雄各半。空白對照組小鼠每天灌胃生理鹽水，陽性對照組小鼠每天灌胃抗壞血酸水溶液，正常對照組小鼠每天灌胃蕎麥蛋白水溶液，三劑量組每日分別按10mg/kg.d、20mg/kg.d、50mg/kg.d劑量灌胃蕎麥蛋白-木糖接枝物,各組自由飲水，自由攝食，飼喂40天后，禁食12h，摘除眼球進行眼眶采血，并解剖取肝臟，冷凍備用。
[0056](I)超氧化物歧化酶(SOD)活力測定
[0057]按照試劑盒(生產廠商:南京建成)說明書要求采用黃嘌呤氧化酶法。
[0058]測定原理:通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計在550nm處測定其吸光度。
[0059]
【權利要求】
1.濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于蕎麥蛋白、糖、水按1:1:1000?1:7:1000的質量比混合，調pH到10?12，50?70°C水浴90?120min，冰浴5?lOmin，-15?_25°C冷凍6?12h后進行冷凍干燥。
2.根據權利要求1所述的濕熱法美拉德反應制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于所述糖為單糖。
3.根據權利要求1所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于所述蕎麥蛋白由蕎麥粉經堿溶酸沉的提取方法制備。
4.根據權利要求3所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于所述提取方法的操作步驟如下: 第一步、取質量比為1:6?1:14的蕎麥粉和水混合，調節pH到10?12，攪拌，離心得到上清液；調節所述上清液的PH到4.5，離心獲得沉淀物； 第二步、將第一步所得的沉淀物經透析、冷凍干燥得蕎麥蛋白。
5.根據權利要求4所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于: 第一步中，所述攪拌是在20°C磁力攪拌30?120min ;所述離心是10?30°C下,4000?5000r/min 離心 10 ?20min。
6.根據權利要求4所述的濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物，其特征在于: 所述第二步具體操作為所得的沉淀物用流動水透析18?24h，用去離子水透析18?24h后，低溫靜置18?24h，經冷凍干燥獲得蕎麥蛋白粉末。
7.權利要求1?6任意一項所述濕熱法制備蕎麥蛋白-糖接枝物得到的蕎麥蛋白-糖接枝物。
8.權利要求7所述蕎麥蛋白-糖接枝物在功能性食品中的應用。
【文檔編號】A23J1/12GK104000003SQ201410251060
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】葉淑紅, 王心宇, 王際輝 申請人:大連工業大學