一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，將經過熱處理的大豆蛋白在高速攪拌條件下利用氧化海藻酸鈉交聯后，冷凍干燥制得基于大豆蛋白的生物活性組織工程支架，該方法制備的多孔支架具有較大的孔徑和孔隙率及良好的生物相容性，并具有一定的生物活性，能夠促進細胞基質的分泌和干細胞的定向分化，可作為細胞的理想載體應用于組織工程領域。
【專利說明】一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及組織工程學【技術領域】，尤其涉及一種以大豆蛋白為主要原料的具有生 物活性的組織工程支架的制備方法。

【背景技術】
[0002] 組織工程支架是能與組織活體細胞結合并能植入生物體的材料，在一定程度上是 細胞外基質的暫時替代物，是組織工程化組織的最基本構架。以膠原蛋白、絲素蛋白、角蛋 白等為代表的動物性來源蛋白以其優異的生物相容性和生物可降解性等優點，在組織工程 中得到廣泛應用。然而，動物性蛋白作為支架材料也存在著明顯的缺陷，包括不同來源的蛋 白性質存在較大差異、較差的濕態強度以及一定的免疫原性，尤其是其可能攜帶有動物病 毒的風險，例如由牛組織提取的膠原蛋白可能攜帶有瘋牛病病毒和口蹄疫病毒等，在植入 體內后是否帶來危害仍沒有明確的科學定論。
[0003] 大豆蛋白是一種在材料領域被廣泛應用的植物性蛋白，與膠原等動物性蛋白一樣 具有優異的細胞親和性，且其不含有動物病毒，作為支架材料使用更為安全。此外，提取的 大豆蛋白中仍含有微量的異黃酮組分，這種植物雌激素已被證實能夠促進細胞基質的分泌 及誘導干細胞的定向分化，因此具有一定的生物活性。但未經改性的大豆蛋白是一類球狀 蛋白，其水溶性及力學性能等均不理想，這極大的限制了其在組織工程領域的應用。大豆蛋 白的改性方法有很多，其中熱處理被認為是最簡單而又有效的方式，研宄顯示一定條件下 的熱處理能夠破壞大豆蛋白間的非共價鍵，形成可溶性聚集體，從而提高大豆蛋白的溶解 度，同時能夠提高大豆蛋白基材的機械強度。
[0004] 英文文獻《Novel soy protein scaffolds for tissue regeneration ：Material characterization and interaction with human mesenchymal stem cells〉〉公開了以經 過熱處理的大豆蛋白為主要原料，通過轉谷氨酰胺酶的交聯作用并冷凍干燥后得到的一種 多孔組織工程支架，支架的降解速率可通過酶用量進行調控。但利用此方法制備的支架的 孔徑偏小，普遍分布在1〇~125 μ m之內，不利于細胞的進入與增殖。
[0005] 申請號為201310641686. 8的中國專利《軟骨組織工程支架材料及其制備方法》則 公開了一種以海藻酸鈉和殼聚糖為基材，通過活化海藻酸鈉的羧基，與殼聚糖氨基發生交 聯反應形成凝膠，將凝膠凍干后形成的三維多孔支架。其不足之處在于：活化羧基所使用的 碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-琥珀酰亞胺（NHS)有一定的細胞毒性，若不能完全去除將對支 架的生物相容性造成影響；制備的支架缺乏生物活性，無法對細胞行為進行調控，此外這個 方法并沒有對支架的具體性能進行詳細的說明。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種具有生物活性的組織工程支架 的制備方法，該組織工程支架具有較好的孔徑孔隙率及良好的生物相容性。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明采用如下方案實現： 一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，將熱處理后的大豆蛋白在高速攪拌條 件下利用氧化海藻酸鈉交聯后，冷凍干燥制得基于大豆蛋白的生物活性組織工程支架。
[0008] 具體的，所述的熱處理步驟如下：將大豆蛋白分散于水中配成質量濃度為1~5%的 懸濁液，在80~120°C恒溫下攪拌0. 5~2h后過濾除去不溶組分，濾液經冷凍干燥后得到熱處 理后的大豆蛋白。
[0009] 熱處理的目的是使大豆蛋白在經過一定時間的處理后變性形成可溶性聚集結構， 從而在一定程度上增強大豆蛋白的溶解性，發明中需用到的大豆蛋白要為均勻濃溶液，不 溶物的存在會降低制備的支架的強度，而未經此熱處理步驟的大豆蛋白溶解性不理想。
[0010] 具體的，所述的在高速攪拌狀態下利用氧化海藻酸鈉交聯的步驟如下： 521 :將熱處理后的大豆蛋白溶于濃度為0. 2~1%的氯化鈣溶液中配制成濃度為8~15% 的溶液； 522 :將S21中配制的溶液進行高速攪拌處理使溶液充分起泡，在保持同等攪拌速率 下，滴加濃度為〇. 5~2%的氧化海藻酸鈉溶液并繼續反應l~2h，通過交聯作用形成多孔凝 膠。
[0011] 一定濃度的氯化鈣溶液能夠促進大豆蛋白的溶解并能增強制備的支架的機械強 度；通過大豆蛋白的氨基與氧化海藻酸鈉上的醛基發生席夫堿反應，隨著反應的進行，交聯 度逐漸增加，反應液逐漸形成一種不流動的凝膠狀態，這時反應液中由于高速攪拌而形成 的氣泡就會被固定，反應液會形成一種富含氣泡的凝膠，而這些氣泡在隨后的制備條件中 被凍干后會形成支架的多孔結構。
[0012] 所述的交聯后的冷凍干燥條件為先于_4~ -20°C冷凍12~24h，后在凍干機中冷凍 干燥 12~24h。
[0013] 將交聯后的多孔凝膠冷結成冰，然后置于凍干機中冷凍干燥，其目的是為了制備 多孔支架，冷凍溫度對孔徑和孔隙率雖有一定的影響，但是在實際實驗中發現其影響是極 小的，本發明中支架的孔結構主要來源于多孔凝膠中的氣泡，所以冷凍溫度、時間、凍干機 的溫度、凍干時間等對支架中的孔徑及孔隙率影響不是很大，本發明并沒有采用定向冷凍 技術，由于其只是在冷凍時采取了一些特殊的措施，為了滿足一些組織工程的一些特殊的 需要，而本發明并不必要采用這個技術就能達到目的。
[0014] 所述的過濾為抽濾，因溶液粘度較高，抽濾方式能有效的除去不溶組分。
[0015] 所述的熱處理步驟中的冷凍干燥為將濾液置于_4~ -20°C冷凍12~24h，后在凍干 機中冷凍干燥12~24h。
[0016] 首先將熱處理并過濾后的大豆蛋白溶液進行冷凍處理，優選地，可以將大豆蛋白 溶液放進冰箱中凍結成冰，然后再置于冷干機中冷凍干燥，這一步驟能將溶液中的水分除 去，以獲得具有可溶性結構的大豆蛋白原料，此時的冰箱的冷凍溫度、冷凍時間、凍干機的 溫度和凍干時間等參數對形成的大豆蛋白原料質量是沒有多大影響的。
[0017] 所述的高速攪拌的速率為1000~3000rpm。
[0018] 不經過高速攪拌，單純將溶液交聯后形成的凝膠凍干后也可以形成多孔結構，但 僅利用凍干方法形成的孔徑較小且不規則，而結合高速攪拌，大豆蛋白溶液形成的氣泡直 徑大且規則，最終制備的支架的孔徑大，孔隙率高。
[0019] 所述的大豆蛋白與氧化海藻酸鈉的質量比為10~100:1。
[0020] 氧化海藻酸鈉是通過強氧化劑對海藻酸鈉進行氧化，使海藻酸鈉部分醛糖單元的 羥基轉變成醛基而得到的一種生物交聯劑，與其它交聯劑相比，其生物毒性較低。
[0021] 所述的氧化海藻酸鈉的氧化度為20~80%。不同的氧化度對交聯反應及制備的支 架的強度有一定影響。
[0022] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果： 1、本方法以植物來源的大豆蛋白為制備支架的主要原料，與傳統的膠原、絲素蛋白、白 蛋白等動物性蛋白作為原料相比，其蛋白性質更為均一，并且不會攜帶有動物性病毒，使用 更為安全。
[0023] 2、本方法操作簡單，反應在水溶液中進行，所采用試劑均無毒無害，不會污染環 境，也可避免支架植入體內后由于有毒化學物質殘留而帶來的生物危害。
[0024] 3、本方法制備的大豆蛋白支架孔隙率在80%以上，孔徑大小為200~400 μ m并分布 均勻，支架具有良好的細胞親和性并具有一定促進干細胞定向分化的生物活性。

【具體實施方式】
[0025] 為了讓本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面對本發明作進一步 闡述。
[0026] 實施例1 : 一種基于大豆蛋白的生物活性組織工程支架的制備方法，包括如下制備步驟： 51. 熱處理：將大豆蛋白分散于水中配成質量濃度為1%的懸濁液，在80°C恒溫下攪拌 0. 5h后抽濾除去不溶組分，濾液置于-20°C冷凍12h，后在凍干機中冷凍干燥12h得到熱處 理后的大?蛋白； 52. 氧化海藻酸鈉交聯：將熱處理后的大豆蛋白溶于濃度為0. 2%的氯化鈣溶液中配 制成濃度為8%的溶液，后將配制的溶液以IOOOrpm的攪拌速率進行攪拌以使其充分起泡， 在保持同等攪拌速率下，滴加濃度為〇. 5%的氧化海藻酸鈉溶液并繼續反應lh，通過交聯作 用形成多孔凝膠，所述氧化海藻酸鈉氧化度為20%，大豆蛋白與氧化海藻酸鈉的質量比為 10:1 ； 53. 冷凍干燥：將S2中的多孔凝膠先于-20°C冷凍12h，后在凍干機中冷凍干燥12h即 得多孔支架。
[0027] 實施例2 : 一種基于大豆蛋白的生物活性組織工程支架的制備方法，包括如下制備步驟： 51. 熱處理：將大豆蛋白分散于水中配成質量濃度為5%的懸濁液，在120°C恒溫下攪 拌2h后抽濾除去不溶組分，濾液置于-4°C冷凍24h，后在凍干機中冷凍干燥24h得到熱處 理后的大?蛋白； 52. 氧化海藻酸鈉交聯：將熱處理后的大豆蛋白溶于濃度為1%的氯化鈣溶液中配制成 濃度為15%的溶液，后將配制的溶液以3000rpm的攪拌速率進行攪拌以使其充分起泡，在保 持同等攪拌速率下，滴加濃度為2%的氧化海藻酸鈉溶液并繼續反應2h，通過交聯作用形成 多孔凝膠，所述氧化海藻酸鈉氧化度為80%，大豆蛋白與氧化海藻酸鈉的質量比為100:1 ; 53. 冷凍干燥：將S2中的多孔凝膠先于-4°C冷凍24h，后在凍干機中冷凍干燥24h即 得多孔支架。
[0028] 對比例I 除氯化鈣濃度為0. 05%外，其它條件同實施例1。
[0029] 對比例2 除氯化鈣濃度為5%外，其它條件同實施例2。
[0030] 對比例3 除S2中大豆蛋白與氧化海藻酸鈉的質量比為5:1外，其它條件同實施例1。
[0031] 對比例4 除S2中大豆蛋白與氧化海藻酸鈉的質量比為300:1外，其它條件同實施例2。
[0032] 對比例5 除S2中攪拌速率為500rpm外，其它條件同實施例1。
[0033] 對比例6 除S2中攪拌速率為5000rpm外，其它條件同實施例2。
[0034] 對賣施例1~2和對比例〗~6講行忡能測試，所得結里如下：

【權利要求】
1. 一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在于，將經過熱處理的大豆 蛋白在高速攪拌條件下利用氧化海藻酸鈉交聯后，冷凍干燥制得基于大豆蛋白的生物活性 組織工程支架。
2. 根據權利要求1所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在 于，所述的熱處理步驟如下：將大豆蛋白分散于水中配成質量濃度為1~5%的懸濁液，在 80~120°C恒溫下攪拌0. 5~2h后過濾除去不溶組分，濾液經冷凍干燥后得到熱處理后的大 ii蛋白。
3. 根據權利要求1所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在 于，所述的在高速攪拌條件下利用氧化海藻酸鈉交聯的步驟如下： 521 :將熱處理后的大豆蛋白溶于質量濃度為0. 2~1%的氯化鈣溶液中配制成質量濃度 為8~ 15%的溶液； 522 :將S21中配制的溶液進行高速攪拌處理使溶液充分起泡，在保持同等攪拌速率 下，滴加質量濃度為〇. 5~2%的氧化海藻酸鈉溶液并繼續反應l~2h，通過交聯形成多孔凝 膠。
4. 根據權利要求1所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在 于，所述的交聯后的冷凍干燥條件為先于_20~ _4°C冷凍12~24h，后在凍干機中冷凍干燥 12?24h〇
5. 根據權利要求2所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在 于，所述的過濾為抽濾。
6. 根據權利要求2所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在 于，所述熱處理步驟中的冷凍干燥為將濾液置于_20~ _4°C冷凍12~24h，后在凍干機中冷凍 干燥 12~24h。
7. 根據權利要求1或3所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征 在于，所述的高速攪拌的速率為l〇〇〇~3000rpm。
8. 根據權利要求3所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在 于，所述的大豆蛋白與氧化海藻酸鈉的質量比為1〇~1〇〇:1。
9. 根據權利要求1所述的一種具有生物活性的組織工程支架的制備方法，其特征在 于，所述的氧化海藻酸鈉的氧化度為20~80%。
【文檔編號】A61L27/56GK104491926SQ201410833234
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月29日 優先權日:2014年12月29日
【發明者】徐紅蕾, 田冶, 何曉帆 申請人:廣東省醫療器械質量監督檢驗所