本發(fā)明涉及組織皮膚敷料領(lǐng)域，還涉及一種皮膚敷料的制備方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體面積最大的器官，是重要的保護(hù)屏障，還具有感覺、保護(hù)、調(diào)解體溫等重要生理功能。當(dāng)正常皮膚組織在外界致傷因素(燒傷、創(chuàng)傷等)及機(jī)體內(nèi)在因素(營養(yǎng)不良、缺氧和感染等)作用導(dǎo)致的損害形成創(chuàng)面，表現(xiàn)為皮膚完整性的破壞、正常組織的缺失和皮膚功能的喪失。
臨床上常見創(chuàng)面有燒傷、創(chuàng)傷等重大疾病，瘢痕、皮膚色素性疾病、良性惡性腫瘤等手術(shù)切除后形成的皮膚缺損等急性創(chuàng)面，還有如糖尿病性潰瘍、血管性潰瘍、壓力性潰瘍、放射性潰瘍、腫瘤性潰瘍、瘢痕性潰瘍、神經(jīng)性潰瘍等慢性創(chuàng)面。
手術(shù)修復(fù)是目前治療創(chuàng)面的主要方法，但是，無論是傳統(tǒng)的皮片移植、皮瓣移植、郵票皮移植、微粒皮移植、網(wǎng)狀皮移植、復(fù)合皮移植等，還是目前的組織工程皮膚，目前都未能有效的解決創(chuàng)面修復(fù)的難題。尤其是重大疾病燒傷患者康復(fù)后往往瘢痕增生，汗腺缺失，皮膚失去原有的功能，生活質(zhì)量低下；慢性創(chuàng)面則遷延不愈，輕者極大消耗醫(yī)療資源，重者并發(fā)感染、膿毒血癥等嚴(yán)重危害生命。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種組織工程皮膚，以解決上述技術(shù)問題的至少一個(gè)，也即是解決上述提及的創(chuàng)面修復(fù)難的問題。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述組織工程皮膚的制備方法，以解決上述技術(shù)問題的至少一個(gè)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種海藻酸鈉水凝膠支架構(gòu)建的組織工程皮膚，自上而下由表皮層和真皮層組成，
表皮層是位于真皮層上方的一層種子細(xì)胞，
真皮層包括種子細(xì)胞和海藻酸鈉水凝膠支架，種子細(xì)胞位于海藻酸鈉水凝膠支架的表面和支架中，以形成皮膚附屬器。
在一些具體的實(shí)施方式中，上述種子細(xì)胞可以是表皮干細(xì)胞或通過人工培養(yǎng)得到的表皮基底層細(xì)胞懸液。
在一些具體的實(shí)施方式中，上述表皮基底層細(xì)胞懸液可以通過以下方法制備得到：取人工皮片，將皮片放置于消化酶溶液中消化15～25分鐘，再將自體皮片取出，并放入至乳酸鈉林格氏液中，中和酶反應(yīng)，撕下皮片的表皮，在皮片基底層上刮削基底層細(xì)胞，用乳酸鈉林格氏液沖洗收集掛下的基底層細(xì)胞，制得表皮基底層細(xì)胞懸液。
在一些具體的實(shí)施方式中，海藻酸鈉水凝膠支架可以通過以下方式制備得到：
(1)如下式所示，將4～6g的BLG-NCA單體溶解于80～100mL的苯-二氧六環(huán)混合溶劑中，以ω-端氨基聚乙二醇為引發(fā)劑，室溫反應(yīng)60～72小時(shí)，將反應(yīng)液倒入無水乙醇中沉淀，過濾，真空干燥得淡黃色半透明狀固體，得PEG-PBLG(PEG即聚乙二醇，PBLG即聚γ-芐基L-谷氨酸)嵌段共聚物，
苯-二氧六環(huán)混合溶劑中苯與二氧六環(huán)的體積比為4:1，BLG-NCA單體與ω-端氨基聚乙二醇的摩爾比為70～80:1，反應(yīng)液與無水乙醇的體積比為1:20～30；
(2)將步驟(1)所得的PEG-PBLG嵌段共聚物溶于水中，使其濃度大于1g/20ml，攪拌下加入EGF(表皮生長因子)原液至溶液中的EGF達(dá)到最大容量為止，靜置4～12小時(shí)，使EGF包埋于PEG-PBLG形成的球形納米粒中；
親水的PEG和疏水的PBLG復(fù)合形成兩親性聚合物，在水介質(zhì)中自動(dòng)發(fā)生定向排列，當(dāng)高于一定濃度(1g/20ml)時(shí)，PBLG之間緊密聚集于內(nèi)，而PEG則舒展于外，自組裝形成納米級大小的球形納米粒。在形成納米粒的過程中，EGF在親水介質(zhì)和PBLG疏水微區(qū)之間發(fā)生分配，大部分包埋在納米粒的核內(nèi)，生成載有EGF的PEG-PBLG納米粒。
(3)往步驟(2)所得溶液中加入EGF原液至溶液中的EGF達(dá)到最大容量為止，按0.02～0.04g海藻酸鈉/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入海藻酸鈉，攪拌使其完全溶解，然后按0.04～0.1g乙二胺/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入乙二胺，40℃下攪拌至完全溶解，2℃-6℃靜止過夜，得到海藻酸鈉水凝膠支架。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了上述海藻酸鈉水凝膠支架構(gòu)建的組織工程皮膚的制備方法，包括以下步驟：
(1)將4～6g的BLG-NCA單體溶解于80～100mL的苯-二氧六環(huán)混合溶劑中，以ω-端氨基聚乙二醇為引發(fā)劑，室溫反應(yīng)60～72小時(shí)，將反應(yīng)液倒入無水乙醇中沉淀，過濾，真空干燥得淡黃色半透明狀固體，得PEG-PBLG嵌段共聚物，
苯-二氧六環(huán)混合溶劑中苯與二氧六環(huán)的體積比為4:1，BLG-NCA單體與ω-端氨基聚乙二醇的摩爾比為70～80:1，反應(yīng)液與無水乙醇的體積比為1:20～30；
(2)將步驟(1)所得的PEG-PBLG嵌段共聚物溶于水中，使其濃度大于1g/20ml，攪拌下加入EGF原液至溶液中的EGF達(dá)到最大容量為止，靜置4～12小時(shí)，使EGF包埋于PEG-PBLG形成的球形納米粒中；
(3)往步驟(2)所得溶液中加入EGF原液至溶液中的EGF達(dá)到最大容量為止，按0.02～0.04g海藻酸鈉/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入海藻酸鈉，攪拌使其完全溶解，然后按0.04～0.1g乙二胺/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入乙二胺，40℃下攪拌至完全溶解，2℃-6℃靜止過夜，得到海藻酸鈉水凝膠支架；
(4)按105個(gè)細(xì)胞/cm3海藻酸鈉水凝膠支架的比例往步驟(3)中得到的海藻酸鈉水凝膠支架中加入表皮干細(xì)胞或淋灑表皮基底層細(xì)胞懸液。
相較于現(xiàn)有的組織工程皮膚或者傳統(tǒng)的自體植皮相比，本發(fā)明的組織工程皮膚具有下列優(yōu)點(diǎn)：
1.本發(fā)明將種子細(xì)胞(表皮干細(xì)胞或表皮基底層細(xì)胞)置于海藻酸鈉水凝膠支架中或支架上，構(gòu)建具有生物活性的組織工程皮膚替代物。由于種子細(xì)胞與海藻酸鈉水凝膠支架形成皮膚附屬器，將本發(fā)明敷在創(chuàng)面上時(shí)，可以幫助創(chuàng)面恢復(fù)正常的組織結(jié)構(gòu)。
2.由于水凝膠支架交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中含有大量水分，可以很好地供給細(xì)胞養(yǎng)分，同時(shí)交聯(lián)了EGF，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，因此水凝膠支架可以更好地模擬細(xì)胞生長所需的類組織樣物理和空間結(jié)構(gòu)，也就是提供了細(xì)胞的三維培養(yǎng)空間，更有利于表皮基底層細(xì)胞的培養(yǎng)和功能維持，并且可塑性高、制作工藝相對簡單、臨床應(yīng)用方便。
3.本發(fā)明的組織工程皮膚，制作快速，工藝簡單，可批量生產(chǎn)，能有效緩解臨床中皮源不足的問題。
附圖說明
圖1是組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
(1)如下式所示，將4～6g的BLG-NCA單體溶解于80～100mL的苯-二氧六環(huán)混合溶劑中，以ω-端氨基聚乙二醇為引發(fā)劑，室溫反應(yīng)60～72小時(shí)，將反應(yīng)液倒入無水乙醇中沉淀，過濾，真空干燥得淡黃色半透明狀固體，得PEG-PBLG(PEG即聚乙二醇，PBLG即聚γ-芐基L-谷氨酸)嵌段共聚物，
苯-二氧六環(huán)混合溶劑中苯與二氧六環(huán)的體積比為4:1，BLG-NCA單體與ω-端氨基聚乙二醇的摩爾比為70～80:1，反應(yīng)液與無水乙醇的體積比為1:20～30；
(2)將步驟(1)所得的PEG-PBLG嵌段共聚物溶于水中，使其濃度大于1g/20ml，攪拌下加入EGF(表皮生長因子)原液至溶液中的EGF達(dá)到最大容量為止，靜置4～12小時(shí)，使EGF包埋于PEG-PBLG形成的球形納米粒中；
親水的PEG和疏水的PBLG復(fù)合形成兩親性聚合物，在水介質(zhì)中自動(dòng)發(fā)生定向排列，當(dāng)高于一定濃度(1g/20ml)時(shí)，PBLG之間緊密聚集于內(nèi)，而PEG則舒展于外，自組裝形成納米級大小的球形納米粒。在形成納米粒的過程中，EGF在親水介質(zhì)和PBLG疏水微區(qū)之間發(fā)生分配，大部分包埋在納米粒的核內(nèi)，生成載有EGF的PEG-PBLG納米粒。
(3)往步驟(2)所得溶液中加入EGF原液至溶液中的EGF達(dá)到最大容量為止，按0.02～0.04g海藻酸鈉/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入海藻酸鈉，攪拌使其完全溶解，然后按0.04～0.1g乙二胺/mL溶液的比例往步驟(2)所得溶液中加入乙二胺，40℃下攪拌至完全溶解，2℃-6℃靜止過夜，得到海藻酸鈉水凝膠支架。
(4)按105個(gè)細(xì)胞/cm3海藻酸鈉水凝膠支架的比例往步驟(3)中得到的海藻酸鈉水凝膠支架中加入表皮干細(xì)胞或淋灑表皮基底層細(xì)胞懸液。
由此，細(xì)胞經(jīng)過生長后，形成如圖1所示的組織工程皮膚，自上而下由表皮層1和真皮層2組成。海藻酸鈉水凝膠支架的表面和支架中，形成有皮膚附屬器3。
由于水凝膠支架交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中含有大量水分，可以很好地供給細(xì)胞養(yǎng)分，同時(shí)交聯(lián)了EGF，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化，因此水凝膠支架可以更好地模擬細(xì)胞生長所需的類組織樣物理和空間結(jié)構(gòu)，也就是提供了細(xì)胞的三維培養(yǎng)空間，更有利于表皮基底層細(xì)胞的培養(yǎng)和功能維持，構(gòu)建具有生物活性的組織工程皮膚替代物。將本發(fā)明敷在創(chuàng)面上時(shí)，可以幫助創(chuàng)面恢復(fù)正常的組織結(jié)構(gòu)。
以上的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。