本發明涉及腫瘤診斷放射性藥物，特別涉及一種isoDGR多肽放射性藥物及其制備方法和應用。

背景技術：

整合素是一類異二聚體跨膜受體，由α和β兩個亞單位構成，組成至少24中具有不同功能和配體結合活性的異二聚體。它們做為雙向信號分子調節細胞內部和外部的信號從而調控各種重要的細胞功能，如粘附、極性、分化、遷移和細胞分裂。在病理狀態下，不正常的整合素信號導致異常的細胞分裂、遷移和黏附，這些是腫瘤及其轉移的標志。其中，整合素α_vβ₆的獨特性在于，它專一的表達在上皮細胞，并且β₆僅與α_v組成單一的異二聚體。整合素α_vβ₆在胚胎發育過程中，高表達在發育中的肺、皮膚和腎的上皮細胞，在健康的成人中它的表達下調。整合素α_vβ₆在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、口腔和皮膚鱗狀細胞癌（SCC）、結腸癌、胃癌和子宮內膜癌中表達上調。而整合素α₅β₁是類似于整合素α_vβ₃的重要的細胞粘附分子，是纖連蛋白的主要受體，主要作用是引起纖連蛋白細胞外基質聚集，也是整合素家族的重要組成成員。近期研究發現整合素α₅β₁在腫瘤血管新生中的作用同樣非常重要，在新生血管生成過程中調控內皮細胞的增殖和遷移。此外，整合素α₅β₁在成熟的正常細胞和血管不表達或者低表達，而在腫瘤新生血管中高表達，目前已經發現其在諸如結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和神經腦膠質瘤等很多種腫瘤中高表達。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種isoDGR多肽放射性藥物及其制備方法和應用，所述isoDGR多肽放射性藥物是一種新型的用于整合素α₅β₁和α_vβ₆陽性腫瘤早期診斷的多肽放射性藥物，該藥物通過雙功能螯合劑HYNIC(hydrazinonicotinamide，聯肼尼克酰胺)將放射性核素^99mTc標記到新型isoDGR多肽分子上，在體內標記藥物通過isoDGR多肽的靶向作用濃聚到腫瘤部位，利用核醫學的單光子斷層顯像技術，對多種腫瘤進行顯像診斷。

本發明的目的是通過如下技術方案實現：

一種isoDGR多肽放射性藥物，包括isoDGR多肽和放射性核素^99mTc，所述isoDGR多肽是D-苯基甘氨酸-異型天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸-D-型精氨酸五元環肽序列，所述放射性核素^99mTc通過雙功能螯合劑HYNIC標記所述isoDGR多肽，即得到所述isoDGR多肽放射性藥物——^99mTc-HisoDGR，所述isoDGR多肽放射性藥物為無色透明液體針劑。

所述的isoDGR多肽放射性藥物的制備方法，包括以下步驟：

1）HYNIC-c(phg-isoDGRk)的制備

將c(phg-isoDGRk)溶于pH為9.0的混合液中得到混合液A，所述混合液為0.1 M NaHCO₃與0.1 M Na₂CO₃按9:1混合所得，再將HYNIC-NHS溶于DMF中得到混合液B；將混合液A和混合液B混合，置于30 ℃振蕩器上反應24小時，產品經YMC-Pack ODS-A C18 半制備柱HPLC分離純化，收集目標物的餾分，合并收集液并凍干，即得到所述HYNIC-c(phg-isoDGRk)；

2）^99mTc-HYNIC- c(phg-isoDGRk)的制備

配制含三苯基膦三磺酸鈉、三羥甲基甘氨酸、琥珀酸二鈉、琥珀酸和HYNIC- c(phg-isoDGRk) 的混合液500 mL于10 mL西林瓶中，加入1.0-1.5 mL的Na^99mTcO₄溶液，100℃水浴加熱西林瓶反應20-25分鐘，待反應結束后室溫冷卻10分鐘，即制成isoDGR多肽放射性藥物，經放射性HPLC質控分析放化純。

進一步的，所述步驟2）中所述含三苯基膦三磺酸鈉、三羥甲基甘氨酸、琥珀酸二鈉、琥珀酸和HYNIC- c(phg-isoDGRk)的混合液中，各物質的含量為：

三苯基膦三磺酸鈉 5.0 mg

三羥甲基甘氨酸 6.5 mg

琥珀酸二鈉 38.5 mg

琥珀酸 12.7 mg

HYNIC- c(phg-isoDGRk) 20 μg。

進一步的，步驟1）所述半制備柱HPLC分離純化方法為：使用安捷倫1260 Infinity HPLC系統配備YMC-Pack ODS-A C18半制備柱，梯度淋洗35分鐘，流速4 mL/min，其中流動相A為含0.05% TFA的去離子水，B為含0.05% TFA的乙腈，淋洗梯度設定為起始時100% A和0% B，25分鐘時50% A和50% B，30分鐘時0% A和100% B，35分鐘時100% A和0% B。

進一步的，步驟1）所述半制備柱HPLC分離純化方法為：使用安捷倫1260 Infinity HPLC系統配備YMC-Pack ODS-A C18半制備柱（250 mm × 10 mm, 5 μm，12 nm），梯度淋洗35分鐘，流速4 mL/min，其中流動相A為含0.05% TFA的去離子水，B為含0.05% TFA的乙腈，淋洗梯度設定為起始時100% A和0% B，25分鐘時50% A和50% B，30分鐘時0% A和100% B，35分鐘時100% A和0% B。

進一步的，步驟2）所述放射性HPLC質控分析的方法為：放射性HPLC質控使用Angilent Techologies 1260 Infinity HPLC操作系統，配有Raytest Gabi放射性檢測器，以及Agilent Zorbax SB-C18 column（4.6 mm × 250 mm, 5 μm），流動相A為0.05% TFA水溶液，流動相B為0.05% TFA乙腈，對^99mTc-HYNIC-isoDGR4#進行梯度洗脫30分鐘，流速1.0 mL/min，淋洗梯度設定為起始時100% A和0% B，5分鐘時保持起始梯度不變，10分鐘時90% A和10% B，20分鐘時40% A和60% B，30分鐘時回到基線梯度100% A和0% B。

所述的isoDGR多肽放射性藥物的應用，所述isoDGR多肽放射性藥物可用于制備整合素a_vb₆與整合素a₅b₁雙陽性、以及整合素a_vb₆或整合素a₅b₁單陽性的腫瘤顯像診斷的放射性藥物。

進一步的，所述整合素a_vb₆與整合素a₅b₁雙陽性、以及整合素a_vb₆或整合素a₅b₁單陽性的腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、腦膠質瘤、胰腺癌、結腸癌、肺癌。

所述isoDGR多肽為c(phg-isoDGRk) (cyclo(D-ph-Gly- isoAsp-Gly-Arg-D-Lys) (c表示環肽， phg代表D型-苯基甘氨酸，isoD代表異型天冬氨酸，G代表甘氨酸，R代表精氨酸，k代表D型-精氨酸) (圖1-左上)。在本發明中設計的^99mTc-HisoDGR分子探針首先將雙功能螯合劑HYNIC與isoDGR多肽連接，然后在協同配體存在下進行^99mTc標記，即合成^99mTc-HisoDGR (圖1-右)。

本發明相比現有技術的有益效果為：

1、本發明中使用HYNIC作為雙功能螯合劑，同時使用tricine(三羥甲基甘氨酸)和TPPTS (trisodium triphenylphosphine- 3,3',3''-trisulfonate，三苯基膦三磺酸鈉)作為協同配體從而使“^99mTc-HYNIC核”具有更加良好的體內外穩定性；

2、本發明中異天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（isoDGR）序列是不同于RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列的靶向整合素家族的新的氨基酸序列，新型isoDGR五元環肽c(phg-isoDGRk)是在isoDGR三個氨基酸序列上通過在分子對接結合模型上分別模擬了c(X-isoDGR-X)與整合素α₅β₁、α_vβ₆和α_vβ₃結合的構象，篩選得到的高親和力的配體。研究結果表明，c(phg-isoDGRk)多肽能與整合素α₅β₁和α_vβ₆高親和力結合，基于該序列設計的放射性分子探針能有效地用于整合素α₅β₁和α_vβ₆陽性腫瘤的診斷。

附圖說明

圖1為isoDGR多肽與HYNIC的偶聯物（A）及其^99mTc標記物結構示意圖（B）與HPLC（高效液相色譜）譜圖（C）；

圖2為流式細胞術檢測BxPC-3、U87MG和HT-29整合素（Integrin）α_vβ₆和α₅β₁的表達情況,（A-B）BxPC-3細胞為整合素α_vβ₆和α₅β₁雙陽性表達，（C-D）U87MG細胞為整合素α₅β₁單陽性表達，（E-F）HT-29細胞為整合素α_vβ₆單陽性表達；

圖3為 ^99mTc-HisoDGR在整合素α₅β₁和α_vβ₆雙陽性Bx-PC3人胰腺癌腫瘤模型0.5、1和2 h (A)和對照組封閉實驗0.5 h的生物分布結果(B)；

圖4為整合素α₅β₁和α_vβ₆雙陽性BxPC-3人胰腺癌腫瘤模型注射^99mTc-HisoDGR（A）以及用過量冷肽封閉的對照組（B）于注射后0.5、1和2 h的nanoSPECT/CT顯像圖；

圖5為整合素α₅β₁陽性U87MG人腦膠質瘤裸鼠注射^99mTc-isoDGR后0.5、1和2 h（A）以及用過量冷肽封閉的對照組0.5 h（B）的nanoSPECT/CT顯像圖，箭頭代表腫瘤部位；

圖6為整合素α_vβ₆陽性HT-29人結腸癌腫瘤裸鼠注射^99mTc-isoDGR后0.5、1和2 h（A）以及用過量冷肽封閉的對照組0.5 h（B）的nanoSPECT/CT顯像圖。

具體實施方式

以下結合附圖及實施例對本發明作進一步說明。

1.材料

Dicyclcohexylcarbodiimide (DCC,N,N'-二環己基碳二亞胺)，N-hydroxysuccinimide (NHS，N-羥基琥珀酰亞胺)，succinic acid (琥珀酸)，trisodium triphenylphosphine-3,3',3''-trisulfonate (TPPTS，三苯基膦三磺酸鈉)，tricine(三羥甲基甘氨酸)均購自美國Sigma-Aldrich公司。HYNIC-NHS購自美國Noca-biochem公司。isoDGR多肽c(phg-isoDGRk) (cyclo(D-ph-Gly- isoAsp-Gly-Arg-D-Lys)委托希施生物科技(上海)有限公司(美國希施生物(CSBio)海外第一個分公司)訂單合成。Na^99mTcO₄洗脫液購自北京原子高科股份有限公司

2 方法與結果

2.1 HPLC方法

HPLC方法1：使用安捷倫1260 Infinity HPLC系統配備YMC-Pack ODS-A C18分析柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，12 nm），梯度淋洗35分鐘，流速1 mL/min，其中流動相A為去離子水（含0.05% TFA），B為乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度設定為起始時100% A和0% B，25分鐘時50% A和50% B，30分鐘時0% A和100% B，35分鐘時100% A和0% B。

HPLC方法2：使用安捷倫1260 Infinity HPLC系統配備YMC-Pack ODS-A C18半制備柱（250 mm × 10 mm, 5 μm，12 nm），梯度淋洗35分鐘，流速4 mL/min，其中流動相A為去離子水（含0.05% TFA），B為乙腈（含0.05% TFA）。淋洗梯度設定為起始時100% A和0% B，25分鐘時50% A和50% B，30分鐘時0% A和100% B，35分鐘時100% A和0% B。

HPLC方法3：放射性HPLC質控使用Angilent Techologies 1260 Infinity HPLC操作系統，配有Raytest Gabi放射性檢測器，以及Agilent Zorbax SB-C18 column（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）。流動相A為0.05% TFA水溶液，流動相B為0.05% TFA乙腈，對^99mTc-HYNIC-isoDGR4#進行梯度洗脫30分鐘，流速1.0 mL/min，淋洗梯度設定為起始時100% A和0% B，5分鐘時保持起始梯度不變，10分鐘時90% A和10% B，20分鐘時40% A和60% B，30分鐘時回到基線梯度100% A和0% B。

2.2 HYNIC-c(phg-isoDGRk) (HisoDGR)的制備

準確稱取多肽isoDGR多肽 4.25 mg（7.3 μmol），溶于600 μL pH為9.0（0.1 M NaHCO₃與0.1 M Na₂CO₃按9:1混合）的水溶液中，再稱取HYNIC-NHS 6.4 mg（14.5 μmol），溶于100 μL DMF中。將兩種反應物的溶液混合，呈淡黃色透明液體。將反應液置于30 ℃振蕩器上反應24小時。反應過程中通過HPLC（YMC-Pack ODS-A C18分析柱，HPLC方法1）檢測反應進程。當反應物多肽isoDGR多肽反應完全后，將產物用HPLC（YMC-Pack ODS-A C18半制備柱，HPLC方法2）進行分離純化，收集合并HPLC方法2保留時間21.5 min的產物。冷凍干燥后得到白色粉末狀固體產物HisoDGR 5 mg。產物經HPLC分析柱檢測分析純度，純度大于95%。再經MALDI-TOF質譜分析確證，質譜分析結果: m/z =893.19 ( [M+H]⁺)，C₃₉H₄₉N₁₂O₁₁S]⁺理論值為893.33。

2.3 ^99mTc-HisoDGR的制備

配制含TPPTS 5.0 mg，tricine 6.5 mg，琥珀酸二鈉（disodium succinate hexahydrate） 38.5mg，琥珀酸 12.7 mg和20 μg的HisoDGR（1 μg/μL，溶于超純水）的混合液500 mL于10 mL西林瓶中，加入1.0 - 1.5 mL的Na^99mTcO₄溶液(10 - 50 mCi)，100℃水浴加熱西林瓶反應20 - 25分鐘，待反應結束后室溫冷卻10分鐘，取樣于放射性HPLC分析 (HPLC方法3)，^99mTc-HisoDGR標記率>95%，經Sep-Pak C18柱純化后放射化學純度>98%。

2.4 ^99mTc-HisoDGR在荷瘤裸鼠生物分布

圖2為流式細胞術檢測BxPC-3、U87MG和HT-29整合素（Integrin）α_vβ₆和α₅β₁的表達情況。結果表明BxPC-3細胞為整合素α_vβ₆和α₅β₁雙陽性表達（圖2A-B），U87MG細胞為整合素α₅β₁單陽性表達（圖2C-D），HT-29細胞為整合素α_vβ₆單陽性表達（圖2E-F）。

將BALB/c荷BxPC-3人胰腺癌腫瘤裸鼠隨機分成若干組，每組4只。各組實驗裸鼠分別經尾靜脈注射100 mL (~74 kBq)的^99mTc標記的HisoDGR多肽，于注射后30分鐘、60分鐘和120分鐘按組分別處死實驗裸鼠，取血及主要臟器，稱重并測量放射性計數，經衰變校正后計算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。受體封閉對照組在注射^99mTc-HisoDGR時共同注射過量isoDGR冷肽(~400 μg/只)，于注射后30 分鐘、60分鐘和120分鐘按以上同樣方法進行生物分布實驗。

在荷BxPC-3人胰腺癌腫瘤裸鼠模型中，在所觀察的時間內^99mTc-HisoDGR的腫瘤攝取僅低于腎的攝取，幾乎高于所有其它臟器腫瘤攝取 (圖3A)，受體封閉實驗結果顯示注射后0.5 h腫瘤的攝取收到顯著性抑制(圖3B)，這說明^99mTc-HisoDGR在腫瘤的攝取是受體介導的特異性攝取。

2.4 ^99mTc-HisoDGR在荷瘤裸鼠的nanoSPECT/CT顯像

將BALB/c荷BxPC-3人胰腺癌、U87MG人腦膠質瘤、HT-29人結腸癌腫瘤裸鼠隨機分成若干組，每組4只。各組實驗裸鼠分別經尾靜脈注射100 mL (~37 MBq)的^99mTc-HisoDGR，于注射后30分鐘、60分鐘和120分鐘按組分別在nanoSPECT/CT顯像系統中進行顯像。受體封閉對照組在注射^99mTc-HisoDGR時共同注射過量isoDGR冷肽(~400 μg/只)，于注射后30 分鐘、60分鐘和120分鐘按以上同樣方法進行顯像實驗。

圖4 顯示了^99mTc-HisoDGR能清晰地高對比度地顯像BxPC-3人胰腺癌腫瘤，顯像結果除了腎有較高攝取外，其它臟器背景較低。受體封閉實驗顯像結果顯示腫瘤攝取能被有效抑制，說明腫瘤顯像是受體特異性介導的攝取。也表明^99mTc-HisoDGR具有用于整合素α₅β₁和α_vβ₆雙陽性腫瘤早期診斷的應用潛力。同時，注射^99mTc-HisoDGR后30分鐘、60分鐘和120分鐘整合素α₅β₁陽性腦膠質瘤（U87MG）腫瘤與整合素α_vβ₆陽性人結腸癌（HT29）的nanoSPECT/CT顯像圖（圖5和圖6）也能高對比度清晰顯像腫瘤，并在受體封閉實驗中腫瘤攝取表現出明顯抑制，表明^99mTc-HisoDGR在整合素α₅β₁或α_vβ₆單陽性的腫瘤的顯像都是受體特異性介導的。^99mTc-HisoDGR具有用于整合素α₅β₁或α_vβ₆單陽性的腫瘤早期診斷的應用潛力。

綜上所述，基于新型isoDGR多肽放射性標記探針^99mTc-HisoDGR具有用于整合素α₅β₁和α_vβ₆雙陽性以及整合素α₅β₁或α_vβ₆單陽性的多種腫瘤早期診斷的應用潛力。