本發(fā)明屬于納米藥物載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種載藥多孔納米粒子制備方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis, UC）是炎癥性腸病中最重要的一種，主要的臨床癥狀為腹瀉、便血、體重下降、腹痛、疲勞以及發(fā)燒等。據(jù)資料顯示，潰瘍性結(jié)腸炎在歐美國家發(fā)病率較高，以美國為例，發(fā)病率高達2‰。UC通常隨著時間推移，癥狀逐漸惡化。傳統(tǒng)的治療藥物主要包括氨基水楊酸類藥物（如 5-氨基水楊酸）、免疫抑制劑類藥物（如氨甲嘌呤）和糖皮質(zhì)激素類藥物（如布地奈德）等。

近幾年，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Polylactic-co-glycolic acid，PLGA）為基礎(chǔ)的微、 納米粒子得到了廣泛的研究，其具有良好的生物相容性、無刺激性、無免疫原性和藥物控釋等優(yōu)點。姜黃素（Curcumin, CUR）是從姜科姜黃屬姜黃、郁金等植物的根莖中提取的一種活性物質(zhì)，它對于人類相對安全，但是在中性和堿性環(huán)境中易分解，穩(wěn)定性差，這些缺陷導致其尚未大規(guī)模應(yīng)用于臨床。

因此，為了給UC治療提供一個切實可行的治療方案，我們用PLGA包裹CUR制備成納米粒子，同時在粒子中形成一些納米級別孔洞。相比較傳統(tǒng)的實心納米粒子，多孔納米粒子藥物釋放更快，藥物的累積釋放量更多，成為一種有潛力的UC治療策略。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明在于提供一種載藥多孔納米粒子的制備方法，它具有良好的生物相容性，穩(wěn)定性，可用于潰瘍型結(jié)腸炎的治療。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為：

一種載藥多孔納米粒子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和姜黃素（CUR）溶于二氯甲烷中，制成溶液；

2)將少量碳酸氫銨水溶液邊渦旋邊逐滴加入到步驟1)中的有機溶液中，形成混合溶液；

3)將步驟2)的混合溶液逐滴加入到聚乙烯醇水溶液中，形成乳濁液；

4)將步驟3)中所得的乳濁液立即放入冰浴中，并進行超聲；

5)超聲完畢后，將上述乳濁液迅速倒入到聚乙烯醇水溶液中；

6)在室溫條件下，將上述乳濁液中的有機溶劑揮發(fā)之后，再離心收集得到的納米粒子，并用去離子水洗滌3次；

7)將上述納米粒子重新分散在1 mL含海藻糖的水溶液中，得到懸濁液；

8)將步驟7)的懸濁液在-80攝氏度冷凍過夜后置于凍干機中凍干12～36 小時，得到的納米粒子存于-20攝氏度冰箱備用。

優(yōu)選的，所述步驟1)中,PLGA的質(zhì)量為50~200 mg，CUR的質(zhì)量為4~16 mg，二氯甲烷的體積為1~5mL；所述步驟2)中,碳酸氫銨的濃度為2~8%，體積為100~200 μL；所述步驟3)中,聚乙烯醇溶液的體積為2~6 mL，聚乙烯醇濃度為1~5% 。

優(yōu)選的，所述步驟4)中，超聲的參數(shù)為超聲振幅20~50%，每次5~20 s，間隔1~5s，超聲時間為0.5~3 min；所述步驟5)中，聚乙烯醇溶液的體積為20~200 mL， 濃度為0~0.5% ；所述步驟6)中,離心速率為8000~15000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為8~30 min。

優(yōu)選的，所述步驟7)中，海藻糖溶液中海藻糖濃度為3~10% 。

相對于現(xiàn)有的技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1. 本發(fā)明以PLGA為藥物載體材料，并用碳酸氫銨作為致孔劑，制備方法為水包油的溶劑揮發(fā)法，整個制備過程簡單快捷，制備周期短，產(chǎn)率高；

2. 本發(fā)明通過PLGA包裹CUR制備載藥納米粒子，改善CUR水溶性不佳、不穩(wěn)定、易分解等，更好的把CUR遞送到病患部位發(fā)揮作用，增加療效；

3. 本發(fā)明引入了碳酸氫銨作為致孔劑，它可以很容易地分解成氨和二氧化碳（酸性條件或升高的溫度），氣體的釋放使粒子表面生成了多個小孔，使粒子不僅可以有效地持續(xù)性釋放藥物，而且相比較傳統(tǒng)的實心納米粒子，多孔納米粒子藥物釋放更快，藥物的累積釋放量更多；

4. 本發(fā)明提出改變納米粒子結(jié)構(gòu)，形成多孔結(jié)構(gòu)可以改善實心納米粒子在藥物釋放方面的不足，是對現(xiàn)有的納米藥物的一個突破和重要創(chuàng)新；

5. 本發(fā)明提出、制備并開展載藥多孔納米粒子，這將有助于我們更好揭示納米粒子遞送至病變部位的機理和規(guī)律，同時為在分子水平上設(shè)計具有更優(yōu)異效果的載藥納米粒子提供理論依據(jù)。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

圖1a和b分別為無孔納米粒子和載藥多孔納米粒子的場發(fā)射掃描電鏡圖。

圖2為無孔納米粒子（用方塊表示）和載藥多孔納米粒子（用圓形表示）的CUR體外釋放曲線。

圖3為口服無孔納米粒子和載藥多孔納米粒子的治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果圖。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

實施例1

實施例1為載CUR多孔納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

1)將100mg PLGA和6mg CUR溶于2mL二氯甲烷中，制成溶液；

2)將3%碳酸氫銨水溶液邊渦旋邊逐滴加入到步驟1)中的有機溶液中，形成混合溶液；

3)將步驟2)的混合溶液逐滴加入到4mL 5%聚乙烯醇水溶液中，形成乳濁液；

4)將步驟3)中所得的乳濁液立即放入冰浴中，并進行超聲, 采用超聲振幅50%，每次10 s，間隔1s，超聲時間為1 min；

5)超聲完畢后，將上述乳濁液迅速倒入到50 mL 0.05%聚乙烯醇水溶液中；

6)在室溫條件下，將上述乳濁液中的有機溶劑揮發(fā)之后，再離心收集得到的納米粒子，并用去離子水洗滌3次，其中離心速率為12000g，離心時間為20 min；；

7)將上述納米粒子重新分散在1 mL含5%海藻糖的水溶液中，得到懸濁液；

8)將懸濁液在-80攝氏度冷凍過夜后置于凍干機中凍干12～36 小時，將得到的納米粒子存于-20攝氏度冰箱備用。

作為對比，我們采用了類似的制備方法來合成載CUR無孔納米粒子。包括以下步驟：

1)將100mg PLGA和6mg CUR溶于2mL二氯甲烷中，制成溶液；

2)將溶液逐滴加入到4mL 5%聚乙烯醇水溶液中，形成乳濁液；

3)將所得的乳濁液立即放入冰浴中，并進行超聲, 采用超聲振幅50%，每次10 s，間隔1s，超聲時間為1 min；

4)超聲完畢后，將上述乳濁液迅速倒入到50 mL 0.05%聚乙烯醇水溶液中；

5)在室溫條件下，將上述乳濁液中的有機溶劑揮發(fā)之后，再離心收集得到的納米粒子，并用去離子水洗滌3次，其中離心速率為12000g，離心時間為20 min；；

6)將上述納米粒子重新分散在1 mL含5%海藻糖的水溶液中，得到懸濁液；

7)將懸濁液在-80攝氏度冷凍過夜后置于凍干機中凍干12～36 小時，將得到的納米粒子存于-20攝氏度冰箱備用。

圖1為納米粒子的場發(fā)射掃描電鏡圖。（a）圖為未加致孔劑制得的無孔納米粒子；（b）圖為致孔劑濃度為3%時的多孔納米粒子。從得到的電鏡照片可以看出，未加致孔劑制得的納米粒子呈球狀，表面光滑平整；碳酸氫銨濃度為3%時制得的納米粒子小孔致密，且孔徑大小較為均勻。

為了模擬藥物的體內(nèi)釋放情況，釋放液選用 pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液。

圖2為CUR的體外釋放曲線。CUR在兩種粒子中的釋放均呈現(xiàn)兩段式的增長趨勢。累計釋放12 h之前，多孔納米粒子累積釋放35.9%，占總釋放量的47.2%；而無孔納米粒子共計釋放27.9%，占總釋放量的48.0%。之后的84個小時，CUR的釋放速度逐步放緩，最終趨于停止。到96 h 時，多孔納米粒子和無孔納米粒子的累計釋放率分別為76.17%和58.21%。兩種納米粒子的釋放趨勢相似，都能達到較為緩慢的釋放，同時多孔納米粒子的最終累計釋放率更高，表明對納米粒子造孔后，有利于CUR的釋放，提高CUR利用率，從而提高治療效果。

另外又進行了小鼠實驗來驗證藥物在體內(nèi)釋放情況。將小鼠分為4組，分別為健康組、葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）處理組、無孔納米粒子處理組和多孔納米粒子處理組。健康組飲用飲用水，DSS處理組、無孔納米粒子處理組和多孔納米粒子處理組自由飲用 3.5% DSS 溶液。在第三天開始，無孔納米粒子處理組和多孔納米粒子處理組每天分別用無孔納米粒子和有空納米粒子灌胃，其中CUR濃度為50 μM，健康組和DSS處理組用飲用水灌胃，作為對照。

圖3a所示，小鼠自由飲用 DSS 第 5 天開始，體重開始下降，而健康組小鼠體重一直呈現(xiàn)上升趨勢。總體來說，無孔納米粒子處理組和多孔納米粒子處理組小鼠體重下降較為緩慢，而DSS處理組的小鼠體重下降較為明顯。這說明，無孔納米粒子和多孔納米粒子對小鼠的病情有所緩解，而多孔納米粒子處理組的小鼠體重最接近健康組。這說明多孔納米粒子的治療效果較好。

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）值的變化是判斷潰瘍性結(jié)腸炎的一個因素，MPO值越高說明炎癥越嚴重。如圖3b所示，無孔納米粒子處理組和多孔納米粒子處理組MPO值明顯小于DSS處理組，而且多孔納米粒子處理組的MPO值最接近健康組，這說明兩組納米粒子均有一定的治療效果，但是多孔納米粒子的治療效果更佳。

最后說明的是，以上實施例僅用來說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。