本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及一種用于治療骨質疏松癥的骨靶向脂質體及其制備方法。

背景技術：

脂質體(liposomes)是一種類似于生物膜組織的雙分子層微小囊泡，可以作為一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統(targetingdrugdeliverysystem)的一種新技術。利用脂質體作為藥物載體不僅可使藥物制劑具有高度的靶向性，而且可以增加藥物的溶解性，提高藥物的生物利用度，減少藥物的治療劑量。中藥脂質體系指將中藥的有效成分包封于類脂質雙分子層而制成的一種超微型球狀藥物載體制劑。作為中藥的一種新型劑型，它制備簡單，應用方便，可多用途給藥。它作為藥物載體有其獨特的優勢，包括可保護藥物免受降解、達到靶向部位和減少毒副作用。其作用原理是脂質體和靶細胞之間可通過內吞、融合、接觸釋放、吸附、脂質交換等方式起作用而改變藥物在體內的分布，達到靶向釋藥。并且脂質體有包封脂溶性藥物或水溶性藥物的特性，脂溶性藥物被脂質體包封后，在體內呈現出與藥物本身不同的特點。當藥物包封于脂質體中由于脂質體的包裹作用或磷脂與藥物之間的氫鍵等作用，使藥物緩慢釋放出來，從而延長了藥物的作用時間，表現出一定的緩釋性；因脂質體是類似于生物膜結構的囊泡，對正常細胞和組織無損害和抑制作用，可長時間吸附于靶細胞周圍，使藥物能充分向靶細胞靶組織滲透，表現出細胞親和性和組織相容性。

近年來，脂質體作為藥物載體的研究已成為熱點之一。加之其適合體內降解、無毒性和無免疫原性，特別是它作為藥物載體可提高藥物治療指數、降低藥物毒性和減少藥物毒副作用等優點，使它作為藥物載體的研究愈來愈受到重視。如黃芩有效成分黃芩素是有效的抗菌、抗病毒藥物，但他們都易氧化，受熱不穩定，且不溶于水，限制了他們在實際中的應用，而脂質體制劑正好改變了這種缺點，又有其獨特的優勢。因此開發這類藥物不僅有重要的臨床意義，也具有廣闊的市場前景。但是目前治療骨質疏松癥的脂質體的物理化學性質，如粒徑、包封率和載藥量等，并不是很理想，嚴重降低了脂質體藥物的療效。對于該技術問題，尚缺乏有效的解決方案。

技術實現要素：

針對現有技術，本發明的目的是提供一種用于治療骨質疏松癥的脂質體及其制備方法，制成一種含異補骨脂素的脂質體骨靶向制劑，可以改善傳統中藥的治療效果，提高其有效成分的利用率和生物利用度，減少用藥量，節約有限的中藥資源。

為實現以上目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明的第一個目的是提供一種骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體，是由以下重量份的原料制成的：

卵磷脂4～6份、膽固醇4～6份、異補骨脂素0.2～0.4份、維生素e0.4～0.6份、膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸4～6份、葡萄糖0.08～0.12份。

本發明中的骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體，本發明從脂質體的粒徑、包封率和載藥量等因素出發，經過篩選優化實驗得到了一組較佳的脂質體配方，各原料組分是一個有機整體，缺一不可。發明人在研究過程中發現，改變上述配方中的配比量，則脂質體的整體作用效果顯著降低。

最優選的，從脂質體的粒徑、包封率和載藥量來講，所述骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體，是由以下質量濃度原料制成的：

卵磷脂5mg·ml^-1、膽固醇5mg·ml^-1、異補骨脂素0.3mg·ml^-1、維生素e0.5mg·ml^-1、膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸5mg·ml^-1、葡萄糖0.1mg·ml^-1。

其中，卵磷脂5mg·ml^-1是指每毫升脂質體混懸液中使用5mg卵磷脂，其他原料具有與此相同的含義。

本發明的第二個目的是提供所述骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體的制備方法，包括以下步驟：

(1)按照設定比例稱取卵磷脂、膽固醇、異補骨脂素和維生素e溶于氯仿溶液中，然后采用薄膜分散法得到均勻的薄膜；

(2)再向薄膜中加入pbs緩沖液和膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸，在20～30℃超聲混勻，過濾膜，即得到脂質體混懸液，再加入葡萄糖調節所述脂質體混懸液的滲透壓，得到骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體。

本發明嘗試了多種制備方法，如高壓均乳法、薄膜分散法和反相蒸發法，從得到的脂質體的粒徑、包封率和載藥量考慮，本發明篩選優化得到采用薄膜-超聲分散法，其制備骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體的粒徑符合要求，包封率和載藥量均較高。

步驟(1)中，為使得卵磷脂、膽固醇、異補骨脂素和維生素e能夠良好溶解以便能夠更好地形成均勻的薄膜，經過試驗驗證，本發明選擇氯仿溶液。

所述薄膜分散法的旋轉溫度為30～45℃，本發明考慮得到藥物的熱敏性和卵磷脂相轉變溫度，優選溫度為30℃。低于30℃時，脂質體包封的異補骨脂素容易泄露；高于30℃時，脂質體的物理穩定性不好，不容易形成球形的脂質體。

步驟(2)中，從提高影響脂質體的均一穩定性的效果來講，經過試驗驗證，本發明的超聲溫度選擇在20～30℃。

本發明的pbs緩沖液的用量與最終形成的脂質體的穩定性有關，經過試驗驗證，本發明選擇用量比例為pbs緩沖液與卵磷脂＝5ml：4～6mg，優選的為1ml：1mg。

本發明的超聲功率和時間對形成的脂質體的形態、粒徑和包封率均有重要的影響，經過試驗驗證，本發明的超聲功率為100～200w(優選150w)，超聲時間選擇在15-20min，以使得脂質體的粒徑均勻，滿足粒徑大小為200～300nm，并且使其包封率較高。若是超聲功率過大，超聲時間過長，會引起脂質體的氧化受損，包封的異補骨脂素滲漏。超聲功率小，超聲時間長，脂質體的穩定性欠佳，形成的脂質體的粒徑不符合要求，粒徑較小，在體內容易被淋巴系統清除掉，失去療效。

本發明中所述膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸(bp-peg-chol)為現有技術中可以常規制備得到的物質，例如：首先合成中間體膽固醇甲基磺酸酯，合成中間體膽固醇-聚乙二醇(chol-peg)，合成聚乙二醇末端氨基化的衍生物(chol-peg-nh2)，最終合成膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸(chol-peg-bp)。具體的，本發明采用以下方法制備得到，膽固醇溶解在二氯甲烷中，加三乙胺做縛酸劑，冷卻到-10℃，緩慢滴加甲基磺酰氯攪拌反應，反應完畢后處理用水洗過濾得白色粉末狀固體。將peg2000充分干燥并抽真空之后，氬氣保護下，加入干燥的二甲基亞砜(dmso)和四氫呋喃(thf)，隨后迅速加入氫化鈉，室溫活化后，將溶解于thf的膽固醇甲基磺酸酯滴加入上述溶液中反應，將反應液傾人到冰水中，二氯甲烷提取，旋干，經快速柱層析分離得chol-peg。將上述產物與甲基磺酰氯反應制備甲基磺酸酯的中間體，溶于二甲基甲酰胺(dmf)中，加入的疊氮鈉于50-80℃反應還原生成伯胺。將雙磷酸衍生物溶于無水thf中，攪拌下加入chol-peg-nh2，加入二環己基碳二亞胺(dcc)，室溫反應后過濾到thf混懸液中，過濾、洗滌、無水硫酸鈉干燥、濃縮物經硅膠快速柱層析，以二氯甲烷/甲醇梯度洗脫得骨靶向接合物bp-peg-chol。

步驟(2)中，過濾膜的具體過程為：依次過0.8和0.45um的濾膜。

本發明的第三個目的是提供上述骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體在制備治療骨質疏松癥藥物中的應用。

上述技術方案具有如下有益效果：

(1)本發明選用合適的原料制備成為骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體，由于采用了合適的原料以及配制量和制備方法，制備得到的脂質體多為類似球形的粒子，粒徑約為200～300nm，平均粒徑為224.3nm，該粒徑范圍在體內的穩定性較高；包封率和載藥量較高，體外釋放度比較穩定。

(2)將異補骨脂素制備成為骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體，對骨質疏松癥具有顯著的治療效果，對老年性骨代謝疾病具有顯著的治療前景，為難治性骨代謝疾病患者帶來福音。

(3)本發明的脂質體作為藥物載體，能夠有效保護異補骨脂素，提高異補骨脂素的生物利用度，使異補骨脂素具有靶向性，從而加強了骨質疏松癥的治療效果。

附圖說明

圖1是骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體結構示意圖。

圖2是骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體透射電鏡(x20000)。

圖3是骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體粒徑分布圖。

圖4是骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體包封率和載藥量測定標準曲線圖。

圖5：骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體對去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段runx2和ppar-γ表達影響。

圖6：骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體對去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段骨量的影響。

具體實施方式

應該指出，以下詳細說明都是示例性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本發明的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

本發明中所用試劑和材料均是本領域技術人員可以常規得到的。

為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本發明的技術方案，以下將結合具體的實施例與對比例詳細說明本發明的技術方案。

實施例1

一種骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體的制備方法，包括以下步驟：

分別稱取卵磷脂、膽固醇、異補骨脂素、維生素e、氯仿溶液，過濾后備用。按實施例2中正交試驗表的安排，依次精密吸取上述濾液適量置于25ml的圓底燒瓶中，在適宜的溫度水浴條件下旋轉蒸發至瓶壁上形成均勻薄膜，繼續抽吸至氯仿充分揮發，再加入適量pbs緩沖液(是一種常規的磷酸緩沖鹽溶液)和膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸，在20-30℃水浴條件下超聲，形成近透明略顯乳光的脂質體混懸液；依次過0.8和0.45um的濾膜，再加入葡萄糖調節所述脂質體混懸液的滲透壓，得到骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體。

得到骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體，是由以下重量份的各原料制成的：卵磷脂5mg·ml^-1、膽固醇5mg·ml^-1、異補骨脂素0.3mg·ml^-1、維生素e0.5mg·ml^-1、膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸5mg·ml^-1、葡萄糖0.1mg·ml^-1。

使得異補骨脂素脂質體效果最優的條件為：旋轉蒸發溫度為30℃，緩沖液用量5ml，超聲功率150w及超聲時間15分鐘。

對比例1

骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體是由以下重量份的各原料制成的：卵磷脂10mg·ml^-1、膽固醇10mg·ml^-1、異補骨脂素0.3mg·ml^-1、維生素e0.8mg·ml^-1、膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸5mg·ml^-1、葡萄糖0.1mg·ml^-1。實驗步驟與實施例1相同，條件為：旋轉蒸發溫度為30℃，緩沖液用量5ml(pbs緩沖液與卵磷脂的添加比例為1ml：1mg)，超聲功率150w及超聲時間15分鐘，區別在于形成的脂質體混懸液中，各原料的含量不同，脂質體的整體作用效果顯著降低。

實施例2

一種骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體的制備工藝的研究，包括以下步驟：

根據薄膜-超聲分散法的制備過程著重考察了旋轉蒸發溫度(a)、緩沖液的用量(b)、超聲功率(c)、超聲時間(d)四因素對脂質體包封率的影響，擬訂了l9(3⁴)試驗因素水平表(見表1)。

表1制備工藝正交試驗表

結果顯示最佳制備條件為a1b3c2d3，即旋轉蒸發溫度為30℃，緩沖液用量5ml，超聲功率150w及超聲時間15分鐘。

實施例3

實施例1中效果最優的骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體的質量考察，包括以下步驟：

脂質體粒徑的大小直接影響其在體內的穩定性，脂質體在體內時由于與高密度脂蛋白膽固醇(hdl)結合會導致粒徑的改變。粒徑大于300nm的脂質體缺乏血管通透性，易被網狀內皮系統吞噬，難以離開循環系統，而小于等于l00nm的脂質體易被淋巴系統清除掉。小單室脂質體(20nm-50nm)增加了體內靶部位的聚集和延長在血液中的半衰期，但多室的脂質體藥物滲透困難。本實驗制備脂質體的透射電鏡結果(見圖2、圖3)，本發明通過控制各原料的配比量，所制備的脂質體多為類似球形的粒子，粒徑約為200～300nm，平均粒徑為224.3nm，該粒徑范圍的骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體在體內的穩定性較高。

經過測定，對比例1脂質體的粒徑范圍在300nm以上，這會影響脂質體在體內的穩定性。這說明改變脂質體各組分的用量對脂質體的粒徑大小影響較大，不合適的配比關系的各原料得到的脂質體形態不滿足要求。

實施例4實施例1中效果最優的骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體的包封率和載藥量的測定，包括以下步驟：精密吸取上述所制得的脂質體液1.0ml低溫超速離心(4℃、16000r.rain^-1)30min，取上清液用pbs稀釋至l0ml，用微孔濾膜過濾，取濾液10ul，進樣測定峰面積，代入標準曲線求出異補骨脂素生物濃度，從而求出脂質體中游離異補骨脂素衍生物的含量，按下列公式計算包封率(entrapmentefficiency，ee)和載藥量(drugloading，dl)。計算公式：ee＝(w總-w游)/w總x100％，dl＝(w總-w游)/w類脂xl00％，其中w總為投藥量，w游為未包入脂質體的游離的藥量，w類脂為處方中類脂總量(見圖4)。

經過測定可得，實施例1中的脂質體的包封率ee為91.2％，載藥量dl為38.3％。對比例1脂質體的包封率ee為80.3％，載藥量dl為29.7％，與實施例1中的效果相比具有顯著的差別，這說明改變脂質體各組分的用量對脂質體的包封率和載藥量影響較大，不合適的配比關系的各原料得到的脂質體的包封率和載藥量較低，兩者的效果具有顯著的差異。

實施例5實驗效果

1.1候選藥物

異補骨脂素(純度＞99％，分子量186.1635，sigma，usa)；

實施例1中效果最優的骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體。

1.2動物分組與模型建立

24只c57/bl6雌鼠隨機平均分為假手術組(shame)、去卵巢組(ovx)和去卵巢加異補骨脂素組(ovx+iso1)、去卵巢加骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體.(ovx+iso2)，各組數量6只。ovx組、ovx+iso1和ovx+iso2組分離背部近髂脊處肌肉，取出雙側卵巢，結扎上部輸卵管，剪去雙側輸卵管。shame組相同入路后剪去包裹卵巢周圍的部分脂肪組織。ovx+iso1和ovx+iso2組在去卵巢前5天開始分別灌胃異補骨脂素和骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體，灌胃劑量為20mg/(kg·d)，灌胃持續時間2個月，shame組組以等劑量生理鹽水灌胃。

1.3觀察指標及方法

1.3.1骨標本收集：術后喂養3個月，斷頸處死小鼠，取兩側股骨、脛骨，仔細剔除周圍附著的肌肉等軟組織，同時將左側股骨放入含有0.1％疊氮鈉的生理鹽水中，備骨組織微結構測定；右側股骨用于免疫組織化學、免疫熒光檢測runx2和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(ppar-γ)蛋白表達以及組織形態學分析。

1.3.2股骨下段he染色及脂肪細胞定量分析：取實驗鼠股骨4％中性多聚甲醛常溫固定，漂洗后進行脫鈣，4℃脫鈣21天，每3天更換1次脫鈣液，每隔3天觀察脫鈣過程，股骨彎曲至90°認為脫鈣完全即可終止。將已經完成脫鈣的標本漂洗、組織脫水、石蠟包埋、切片、烤片，進行he染色。普通光學顯微鏡對股骨下段干骺端進行拍照，定量脂肪細胞，分析參數為:脂肪細胞數量(ad#，permm²)，總脂肪細胞面積占骨髓腔比例(av/tv)。所有切片均由3個不同人統一拍攝同一區域，拍攝順序由圖片左下角干骺端向右將圖片平均分割呈3個區域進行拍攝，然后從圖片左上角皮質骨內向右將圖片分割成3個區域進行拍攝，進行脂肪細胞計數時不包括已被破壞的脂肪細胞。分析時為避免對最終結果產生偏倚，所有圖均未知標本的各自分組(sham，ovx、ovx+iso1組和ovx+iso2)。

1.3.3股骨下段micro-ct掃描：股骨遠端進行顯微ct(scancomedical，μct80)分析:小鼠co2麻醉，股骨下端骨小梁較為明顯和集中的區域通過顯微ct(μct)分析和三維重建，設置參數為掃描電壓70kv，功率30w，掃描電流429μa，每次掃描厚度5μm。分析數據包括:骨小梁厚度(tb.th)、骨小梁體積(tb.sp)、骨體積(bv)/總體積(tv)和骨小梁數量(tb.n)。

1.3.4股骨下段runx2、ppar-γ免疫熒光表達:取去卵巢并灌胃異補骨脂素c57/bl6小鼠股骨，保留膝關節和股骨中下段，4％中性多聚甲醛室溫固定，進行漂洗、脫鈣、再漂洗、組織脫水、石蠟包埋、切片烤片、烤蠟、脫蠟、抗原修復、孵育抗體等，后用含dipi封片劑封片，避光保存3分鐘后熒光共聚焦顯微鏡觀察拍照，從上下左右中5個方位隨機取5個非重疊視野，使用image-proplus(ipp)軟件計算平均光密度值。

1.4結果分析

1.4.1候選藥物對去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段runx2和ppar-γ表達結果：

核心結合蛋白因子2(runx2)是成骨細胞分化的關鍵調控因子，用來衡量細胞成骨或成脂的能力。ppar-γ是脂肪細胞成熟過程中必需的細胞轉錄因子，它的表達強弱和活性高低會決定小鼠bmscs向成骨細胞或是脂肪細胞分化。

結果：對去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段進行runx2和ppar-γ免疫熒光提示，骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體治療能增加股骨下段由于去卵巢引起的runx2表達降低，同時能抑制ppar-γ表達增加，即ovx+iso2組股骨下段runx2、ppar-γ免疫熒光表達強度高于ovx+iso1組，差異具有統計學意義(p<0.05)，見表2，圖5。

表2骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體對去卵巢c57/bl6小鼠股骨下段runx2和ppar-γ表達影響(均值±標準差，n＝6)

*為ovx+iso2與ovx+iso1組相比較，p<0.05；+為sham組與ovx組相比較，p<0.05。

1.4.2候選藥物對骨質疏松動物模型的試驗結果：

脂肪細胞對成骨細胞具有脂毒性，脂肪細胞成脂分化的狀態會影響成骨細胞的成骨能力和分化能力。

骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體能顯著抑制去卵巢小鼠骨髓腔中脂肪細胞的增加，即ovx+iso2組脂肪細胞數量低于ovx+iso1組，差異具有統計學意義(p<0.05)。(表3)

表3骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體對c57/bl6小鼠股骨下段脂肪細胞量的影響(均值±標準差，n＝6)

*為ovx+iso與ovx組相比較，p<0.05；+為sham組與ovx組相比較，p<0.05。

通過對各組c57/bl6小鼠股骨下段的顯微ct(micro-ct)掃描提示，骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體治療能明顯改善由于去卵巢引起的股骨下段骨量丟失，即ovx+iso2組骨小梁厚度(tb.th)、骨體積/總體積(bv/tv)、骨小梁數量(tb.n)大于ovx+iso1組，差異具有統計學意義(p<0.05)；而ovx+iso2組骨小梁體積(tb.sp)小于ovx+iso1組，差異具有統計學意義(p<0.05)，見表3、4，圖6。

表4骨靶向修飾的異補骨脂素脂質體對c57/bl6小鼠股骨下段骨量的影響(均值±標準差，n＝6)

*為ovx+iso2與ovx+iso1組相比較，p<0.05；+為sham組與ovx組相比較，p<0.05。

綜上，本發明的脂質體作為藥物載體，能夠有效保護異補骨脂素，提高異補骨脂素的生物利用度，相比于單純的異補骨脂素，對骨質疏松癥具有更加優異的治療效果。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。