本發明屬于生物醫藥技術領域 具體涉及一種靶向脂質體-環二核苷酸的組成、制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
脂質體(liposomes)是由脂質雙分子層所形成的一種超微球形載體制劑，是納米載藥系統的典型代表。當兩性分子如磷脂分散于水相時，分子的疏水尾部聚集在一起，親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結構的封閉囊泡( vesicles)。在囊泡內水相和雙分子膜內可以包裹多種不同極性的藥物。由于脂質體的結構類似生物膜，故又稱為人工生物膜。由天然膜成分組成的脂質體，其脂質體膜的雙層結構原則上與天然細胞膜一樣。另外，脂質體還可以由人工合成的脂質組成，以改善它們的化學性質和生物學性質。
脂質體的大小從幾十納米到幾十微米不等，按照結構類型的不同，可以分為單室脂質體(unilamellar vesicles)、多室脂質體(multilamellar large vesicles，MLV)和多囊脂質體(multivescular liposomes，MVL)。其中單室脂質體是由一層雙分子層脂質膜形成的囊泡，又分為小單層脂質體(small unilamellar vesicles，SUV)和大單層脂質體(large unilamellar vesicles，LUV)。
脂質體作為一種藥物載體，主要有以下四個方面的優點：
（1） 靶向性和淋巴定向性；（2） 緩釋作用：緩慢釋放，延緩腎排泄和代謝，從而延長作用時間；（3）降低藥物毒性；（4）提高藥物穩定性。
脂質體因具有組織相容性、細胞親和性、靶向性和緩釋性等性質，被廣泛地用于抗腫瘤藥物的研發中。采用聚乙二醇(PEG)及其衍生物進行修飾，減弱脂質體長期儲存的聚集，增加再分散性，提高脂質體的穩定性。這主要是由于PEG能產生6nm厚度的立體位阻層，從而減弱血漿蛋白的作用和內皮網狀系統的攝取作用，延長藥效。其次PEG能夠提高膜表面親水性，降低脂質體與單核吞噬細胞系統的親合作用。修飾后的脂質體稱為長效脂質體或空間穩定脂質體。利用脂質體表面易被修飾獲得靶向作用的特點，可以制備出靶向于腫瘤細胞表面上某些特定靶點的分子靶向脂質體，減少肝腎蓄積毒性，提高生物利用度，使脂質體在特定部位發揮藥效。脂質體作為藥物載體的研發重點主要集中在三個方面：1.包裹抗腫瘤化療藥物，因為脂質體可以有效降低這些化療藥物的副作用，提高藥物治療效果；2.用作蛋白質-多肽疫苗以及DNA疫苗的載體，由于脂質體是一種有效的免疫佐劑，作為疫苗載體可以增強機體的免疫反應；3.用作核酸類藥物的載體，以脂質體為載體進行基因治療可以避免病毒類載體的不良反應。
癌癥作為威脅全球人類健康和生命的第二大殺手，其高發生率和高復發率使得抗腫瘤藥物的研究成為熱點領域。大多數抗腫瘤藥物的靶向性不明顯，而且會對人體正常組織產生副作用，造成不可逆傷害，影響癌癥的治療。脂質體載藥系統由于其低毒性和可以進行靶向性等特性受到了廣泛關注。目前國內外已經有許多種脂質體藥物已經被批準上市或進行臨床研究來進行癌癥治療。
分子靶向脂質體是在脂質體表面連接上某種分子配體，該配體能夠特異性識別腫瘤細胞表面的某種受體，使脂質體藥物能夠富集到靶細胞，減少對正常細胞的傷害。適當的靶向配體能夠提高藥物的生物利用度。按照配體的類型，分子靶向脂質體可分為抗體靶向型脂質體和非抗體靶向型脂質體。
抗體靶向脂質體又稱為免疫脂質體(immunoliposomes, ILs)，通常將單克隆抗體或抗體的抗原結合片段(fragment of antigen binding, Fab)共價結合到載藥的脂質體表面，依靠抗體與靶細胞表面的抗原或受體的識別作用，將藥物運送到特殊部位。作為一種新型藥物載體，免疫脂質體具有很多優勢，包括對腫瘤靶細胞呈現明顯的選擇性殺傷作用，且殺傷活性比游離藥物、非特異抗體脂質體、單獨單抗等更強；在荷瘤動物體內呈特異性分布，腫瘤病灶藥物濃度升高，藥物毒副作用較??；體內循環半衰期長及運載藥物量大等。目前已有多種抗體靶向脂質體處于研究階段。
由于腫瘤細胞周圍微環境的改變，腫瘤細胞表面會過度表達一些受體，而正常細胞表面不表達或低表達這些受體，因此可以在脂質體表面連接這些受體的靶向配體，發揮其特異性識別靶向作用。非抗體靶向型脂質體的常見配體有葉酸、轉鐵蛋白、多肽和糖類等，本發明專利屬于非抗體靶向型脂質體，脂質體鏈接的靶向配體是葉酸。
在感染的哺乳動物細胞中微生物和病毒DNA能通過刺激干擾素分泌誘導內源強有力的免疫應答。內質網（ER）受體蛋白（STING）對胞質DNA的免疫應答是必需的因素。最近的研究表明，環化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在結合DNA后的活化條件下，內源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一種胞質DNA傳感器，它作為第二信使通過STING刺激INF-β的感應，介導TBK1和IRF-3的活化，進而啟動INF-β基因的轉錄。最近報道，重組cGAS在DNA結合條件下催化環化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS結合雙鏈dsDNA的復合物的晶體結構也已被報道，cGAMP結合STING，使轉錄因子IRF3激活并產生β干擾素。
環二核苷酸合成酶(cGAS)是先天性免疫通路中重要的細胞質DNA感受器。cGAMP作為二級信使分子通過內質網膜上的STING蛋白通路誘導干擾素IFN-β和其他細胞因子的產生，調節下游蛋白質表達，誘導細胞生長停滯和凋亡，產生抗病毒效應。STING通路可以調節免疫原性腫瘤的先天免疫識別，促進干擾素的抗腫瘤作用。IFN-γ在體內通過TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)發揮抗腫瘤作用，促進腫瘤細胞凋亡。cGAMP是cGAS-cGAMP-STING-IRF3介導的先天免疫反應的關鍵刺激物，是STING的內源性激活劑，因此，cGAMP具有促進抗腫瘤免疫應答的作用。
STING是內質網的跨膜蛋白，內質網上具有一種ENPP1的水解酶。在細胞質中沒有發現ENPP1活性。相反，它被發現在肝細胞中的質膜的基底側表面上和肝臟的粗糙內質網部分。其催化結構域駐留在內質網空腔中，且需要高濃度鈣離子供其活動。ENPP1水解酶可以降解2’3’-cGAMP。實驗顯示2’3’-cGAMP是良好的重組ENPP1的底物。因此，用脂質體包裹cGAMP可以抑制其與ENPP1水解酶的接觸，延長其代謝時間，提高藥效。脂質體具有免疫佐劑的作用，可以進行腫瘤細胞靶向，提高藥物利用率， 因此，靶向脂質體包含的cGAMP具有制備抗腫瘤藥物的優勢和潛在應用。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供靶向脂質體-環二核苷酸cGAMP的組成、制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。該靶向脂質體包裹的環二核苷酸cGAMP藥物，具有靶向遞送、增強細胞滲透性、延長藥物代謝周期，提高藥物利用率。由于脂質體具有免疫佐劑的作用，靶向脂質體-環二核苷酸cGAMP具有更好的免疫抗腫瘤藥效。
本發明制備的靶向脂質體-環二核苷酸的組成包括：卵磷脂（lipoid EPCs）、膽固醇（CH）、 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-葉酸（DSPE-PEG-Folic Acid）組成的靶向脂質體，該脂質體包裹環二核苷酸cGAMP（或cGAMP的衍生物）。靶向脂質體-環二核苷酸cGAMP（或cGAMP的衍生物）的制備方法包括逆向蒸發法和硫酸銨梯度法。
本發明實驗研究表明，靶向脂質體包裹的環二核苷酸cGAMP可以抑制多種腫瘤細胞的生長，具有明顯的抗腫瘤作用，抗腫瘤藥效明顯優于cGAMP單獨用藥，可用于制備抗腫瘤藥物。
本發明還涉及利用靶向脂質體包裹的環二核苷酸cGAMP所制備的抗腫瘤藥。所述的腫瘤包括但不限于肺癌、胃癌、結腸直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌等。
本發明所述的靶向脂質體包括但不限于由卵磷脂（lipoid EPCs）、膽固醇（CH）、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-葉酸（DSPE-PEG-Folic Acid）組成的靶向脂質體。
本發明所述的環二核苷酸，指的是2’3’-cGAMP或 Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]，但不限于2’3’-cGAMP，包括cGAMP的衍生物。
本發明所用的靶向脂質體包裹的環二核苷酸cGAMP緩釋抗腫瘤藥物能夠延長cGAMP代謝周期，增強抗腫瘤治療效果，優于單獨使用cGAMP抗腫瘤治療效果。
具體實施方式
下面通過實施例具體說明本發明的內容。在本發明中，以下所述的實施例是為了更好地闡述本發明，并不是用來限制本發明的范圍。
實施例1：靶向脂質體-cGAMP的組成和制備方法
通過逆向蒸發法和硫酸銨梯度法分別制備包裹cGAMP藥物的靶向脂質體，并對其進行性質表征。
1、脂質體原料：卵磷脂（lipoid EPCs）、膽固醇（CH）、 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG2000）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-葉酸（DSPE-PEG-Folic Acid），均購買自西安瑞禧生物科技有限公司。
2、脂質體制備方法
（1）逆向蒸發法
（A）磷脂膜材溶解于有機溶劑三氯甲烷中，磷脂膜材比例為：
EPC : CH : DSPE-PEG2000 : DSPE-PEG2000-FA = 10 : 10 : 1 : 0.01 （molar ratio）；形成有機相溶液。
（B）cGAMP藥物溶解于超純水中，形成水相溶液。
（C）有機相磷脂溶夜 ：水相cGAMP溶夜=3:1（V ：V），cGAMP : 磷脂膜材總量 =1:10，將藥物水溶液加入到磷脂有機相溶液中。
（D）探頭超聲，功率200W，20分鐘（超聲5秒，停3秒），形成穩定的W/O型乳劑。
（E）真空旋轉蒸發除去有機溶劑（水浴45℃，轉速90rpm）。
（F）將所得的脂質體溶液進行水浴超聲，減小粒徑。
（G）用超濾管（MWCO=3000Da）超濾除去未包封藥物。
(2) 硫酸銨梯度法
（A）磷脂膜材溶解于有機溶劑三氯甲烷中，磷脂膜材比例為
EPC : CH : DSPE-PEG2000 : DSPE-PEG2000-FA = 10 : 10 : 1 : 0.01 （molar ratio）；
（B）將磷脂溶液旋轉蒸發成膜（水浴溫度35℃，轉速90rpm，真空度0.09Mpa），后旋轉蒸發掉有機溶劑；
（C）向磷脂膜中加入120mmol/L的硫酸銨溶液，振搖（120rpm、5分鐘）形成空白脂質體溶液。
（D）將空白脂質體溶液在超純水中透析過夜。
（E）cGAMP溶解于超純水中，加入到空白脂質體溶液中，65℃孵育20分鐘；
（F）水浴超聲減小粒徑；
（G）用超濾管（MWCO=3000Da）超濾除去未包封藥物。
3、靶向脂質體-cGAMP的表征
（1）粒徑表征
利用動態光散射 （Dynamic Light Scattering，DLS）測量脂質體的粒徑和粒徑分布（PDI）。其基本原理為微小粒子懸浮在液體中會無規則地運動（布朗運動），光通過膠體時，粒子會將光散射，在一定角度下可以檢測到光信號。大顆粒運動緩慢，散射光斑的強度也將緩慢波動；小粒子運動快速，散射光斑的密度也將快速波動，最后通過光強波動變化和光強相關函數計算出粒徑及其分布。PDI表示粒徑的均一度，是方差的概念。所制備的脂質體粒徑約100 nm左右，PDI=0.426。
（2）Zeta電位
Zeta電位是連續相與附著在分散粒子上的流體穩定層之間的電勢差。一般用來評價或預測微粒分散體系的物理穩定性,一般Zeta電位絕對值越高,其粒子間的靜電斥力也就越大,物理穩定性也就越好。一般Zeta電位絕對值達到30mV就認為體系比較穩定。本發明制備的脂質體Zeta 電位絕對值為29.5 mV，較為穩定。
（3）包封率
將靶向脂質體與游離cGAMP藥物分離，通過紫外分光光度計作標準曲線法,測定游離的cGAMP藥物量，計算脂質體包封率：EE(％)=(1一Cf／Ct)×100％。其中：EE—cGAMP脂質體包封率；Cf一游離cGAMP含量；Ct一總cGAMP含量。根據計算，利用逆向蒸發法制備的脂質體包封率在60%左右，利用硫酸銨梯度法制備的脂質體包封率在75%以上。
實施例2：cGAMP的制備
cGAMP （環化-GMP-AMP）按文獻方法在結合DNA后的活化條件下，由環化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）催化合成。純度在98％以上。（Li P.W，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）
實施例3：采用荷瘤鼠模型進行檢測脂質體包裹的cGAMP緩釋藥物的抗腫瘤作用即對動物皮下移植瘤生長的抑制作用。
動物
種屬、品系、性別、體重、來源、合格證
BALB/c普通小鼠、C57/BL6普通小鼠，雄性，體重16-18g，6-8周齡， SPF級，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物質量合格證號：SCXK （滬）2007-0005 ] 。
飼養條件
所有小鼠均自由覓食和飲水，在室溫（23±2）℃下飼養于中國人民解放軍軍醫大學實驗動物中心。飼料及水均經高壓滅菌處理，全部實驗飼養過程為SPF級。
劑量設置
靜脈注射小鼠，設置1個劑量組：10 mg/kg
試驗對照
陰性對照：生理鹽水溶液
陽性對照：cGAMP，劑量10mg/kg
給藥方法
給藥途徑：尾靜脈注射給藥
給藥體積：100 微升/只
給藥次數：每天1次，連續21天
每組動物數：10只
腫瘤細胞株
小鼠結直腸癌細胞株CT26，小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，人卵巢癌細胞株SK-OV-3，人黑色素瘤細胞株A375，人胃癌細胞株MNK-45均購自中國科學院細胞庫。
試驗主要步驟
1．腫瘤模型鼠的建立與干預
細胞培養，傳代，在細胞對數期收集細胞，做成濃度為(1.0×107)每毫升的細胞懸液，小鼠右前肢腋下注射0.2 ml細胞懸液(細胞數目為2.0×106個/只)，10 天左右腫瘤長至直徑約5 mm，致瘤成功，隨機均分為3組。分別為A：陰性對照組（靜脈注射生理鹽水組）； B：cGAMP組(靜脈注射cGAMP)10mg/kg;C：靶向脂質體-cGAMP組(靜脈注射脂質體-cGAMP)10mg/kg。每天給藥1次，連續給藥21天。21天后，處死小鼠并稱瘤體重量，抑瘤率=[1-實驗組平均瘤重(B、C組) ／A組平均瘤重)]×100％。
分別制備皮下移植瘤模型：小鼠結直腸癌細胞株CT26，移植到BalB/C普通小鼠；小鼠肺癌Lewis瘤株 LL/2，移植到C57/BL6小鼠，觀察抗腫瘤效果。
2．統計分析
數據用x±s表示，利用SPSS10.0軟件進行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗比較各組瘤重差異的顯著性，顯著性水平a=0.05。
結果
小鼠皮下接種腫瘤細胞后制備成功皮下移植瘤模型，靶向脂質體-cGAMP和cGAMP均可明顯抑制腫瘤生長，給藥21天后的瘤重均顯著低于陰性對照組（P<0.05 ，P<0.01），靶向脂質體-cGAMP優于cGAMP單獨用藥，表明靶向脂質體-cGAMP具有更優的抗腫瘤作用。具體結果表1-表5：
表1、脂質體-cGAMP對BalB/C小鼠結直腸癌細胞CT26皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對照組 2.266±0.244 （g） -
cGAMP組 0.748±0.182 （g）** 67.0
脂質體-cGAMP組 0.428±0.154 （g）** 81.0
注：*P<0.05 vs 陰性對照組；**P<0.01 vs 陰性對照組.
表2、脂質體-cGAMP對C57小鼠肺癌Lewis瘤株 LL-2皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對照組 2.640±0.378 （g） -
cGAMP組 0.782±0.245 （g）** 70.4
脂質體-cGAMP組 0.505±0.128 （g）** 80.8
注：*P<0.05 vs 陰性對照組；**P<0.01 vs 陰性對照組.
表3、 脂質體-cGAMP對人黑色素瘤細胞株A375鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對照組 2.680±0.368 （g） -
cGAMP組 0.768±0.254 （g）** 71.3
脂質體-cGAMP組 0.498±0.135 （g）** 81.4
注：*P<0.05 vs 陰性對照組；**P<0.01 vs 陰性對照組.
表4、 脂質體-cGAMP對人胃癌細胞株MNK-45鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對照組 2.668±0.382 （g） -
cGAMP組 0.786±0.265 （g）** 70.5
脂質體-cGAMP組 0.510±0.128 （g）** 80.8
注：*P<0.05 vs 陰性對照組；**P<0.01 vs 陰性對照組.
表5、 脂質體-cGAMP對人卵巢癌細胞株SK-OV-3鼠皮下移植瘤的作用
（n=10，mean±SD）
組別 平均瘤重（g） 平均抑瘤率（%）
陰性對照組 2.728±0.336 （g） -
cGAMP組 0.769±0.258 （g）** 71.8
脂質體-cGAMP組 0.509±0.156 （g）** 81.3
注：*P<0.05 vs 陰性對照組；**P<0.01 vs 陰性對照組.
實施例3 脂質體-cGAMP的急性毒性研究
實驗材料
ICR 小鼠20 只（購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物質量合格證號：SCXK （滬）2007-0005 ] ），雌雄各半，體重18～22g，動物以顆粒飼料喂養，自由攝食和飲水。
脂質體-cGAMP由實施例1制備，用生理鹽水配制成濃度為200mg/mL 的溶液。
實驗方法
ICR小鼠按體重單次尾靜脈注射2g/kg 的脂質體-cGAMP緩釋藥物，觀察給藥后小鼠14天內的毒性反應及死亡情況。結果發現，小鼠單次尾靜脈注射給藥后，小鼠活動正常。給藥后14天內，小鼠未出現死亡，第15天，全部小鼠處死，解剖，肉眼檢查各臟器，均未見明顯病變。
實驗結果
上述急性毒性實驗結果表明，靜脈注射給藥最大耐受量MTD 不低于2 g/Kg，說明脂質體-cGAMP藥物的急性毒性低。