本發明涉及一種ica-sf/plcl復合納米纖維膜的制備，尤其涉及一種采用同軸靜電紡絲技術制備ica-sf/plcl納米纖維膜的方法；本發明同時還涉及該方法制備的ica-sf/plcl復合納米纖維膜作為gbr膜的應用，屬于復合材料技術領域和醫藥材料技術領域。

背景技術：

牙種植術目前已成為牙列缺損或缺失的首選修復方法；然而，由炎癥（如肉芽組織）引起的骨缺損嚴重影響手術成功率。越來越多研究表明，引導骨再生（gbr）技術可有效恢復牙槽骨的高度和豐滿度，其原理是：通過阻礙成纖維細胞和上皮細胞長入骨缺損區而發揮屏障功能，并使成骨細胞附著、增殖增加，促進骨再生。

目前市場應用于gbr的材料，包括生物不可降解的聚四氟乙烯，該材料需二次手術取出，增加感染和膜暴露幾率。因此，越來越多學者致力于生物可降解膜。bio-gide?是一種臨床常用的生物可降解膜，研究表明，其具有良好的生物相容性，低抗原性，足夠的機械性能和適益的降解性。為更好的誘導骨再生，復合性gbr膜（膜材料與骨誘導物質如生長因子相結合）已成為目前研究的熱點。

淫羊藿苷（icariin，ica，c33h40o15，分子量：676.67）是從中藥總黃酮中提取的主要活性成分，其具有多種重要的生理活性，如促進成骨細胞的增殖和分化以治療骨代謝疾病，及免疫調節和抗腫瘤活性。研究發現，ica可治療絕經后婦女的骨量喪失，通過增加opn、bmp表達促進骨髓間充質干細胞分化成成骨細胞，最終恢復骨強度。同時，ica明顯抑制破骨細胞形成。因此認為，ica可以作為骨組織工程的成骨誘導劑。我們之前的研究發現，ica可以在體內外顯著促進人牙周膜干細胞（hpdlscs）的增殖和成骨分化。

聚l-丙交酯(plla)，具有良好的生物相容性和可降解性，使其更適宜在藥物控制釋放及組織工程等方面中應用。

絲素（sf）是一種天然結構蛋白，具有良好的生物學特性，如良好的細胞粘附性，可控降解率，機械強度，滲透性和抗酶降解性。它已經廣泛研究組織工程和控制藥物輸送系統。

同軸靜電紡絲是制備納米或亞微米纖維支架的簡單、有效方法，其在組織工程和藥物傳遞體系得到廣泛應用。其具有高的表面積/體積比，可以促進細胞附著，實現藥物卸載，并且達到持續和受控的藥物局部釋放。之前研究已證實，一些生物分子可成功包裹于納米纖維中，保持生物活性，纖維直徑可通過控制同軸靜電紡絲過程參數來控制。

因此，本發明采用同軸靜電紡絲技術擬制備一種ica-sf/plcl復合納米纖維膜，并對膜的理化性能、降解、釋藥及體內和外體對骨再生的作用進行研究，以期成為能持續釋放ica，促進骨再生功能的gbr膜。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種采用同軸靜電紡絲技術制備ica-sf/plcl復合納米纖維膜的方法；

本發明的另一目的是提供上述方法制備的ica-sf/plcl復合納米纖維膜作為誘導骨再生膜（gbr）的應用。

一、ica-sf/plcl復合納米纖維膜的制備

本發明ica-sf/plcl復合納米纖維膜的制備，包括以下工藝步驟：

（1）再生絲素蛋白的制備：將蠶繭浸于na2co3溶液中煮沸脫膠，并用蒸餾水洗滌除去絲膠，干燥后在75~85℃下完全溶解于cacl2/ch3ch2oh/h2o的三元溶劑體系中，然后于蒸餾水中室溫下透析3~5d，過濾，冷凍干燥，獲得再生絲素蛋白。

所述na2co3溶液的質量分數為0.2~0.5%；煮沸脫膠2次，每次0.5~1h；

所述cacl2/ch3ch2oh/h2o三元溶劑體系中，cacl2/ch3ch2oh/h2o的摩爾比為1/2/8。

（2）殼層紡絲液的制備：將上述所得再生絲素蛋白與plcl以1:2.3~1:2.5的質量比溶于六氟異丙醇中，且使再生絲素蛋白與plcl的總質量百分數為5~8%，常溫磁力攪拌5~6h，獲得殼層紡絲液。plcl的mw在1,000,000以上。

（3）芯層紡絲液的配制：將ica配制成濃度10^-5μmol/l的水溶液作為芯層紡絲液；

（4）同軸靜電紡絲制備ica-sf/plcl復合納米纖維膜：將配制好的芯層紡絲液、殼層紡絲液分別裝入注射器中，連接同軸電紡雙噴頭，并與高壓靜電發生裝置相連接；控制同軸電紡噴頭與接收板間電壓為12~15kv，距離為12~15cm，芯層紡絲液、殼層紡絲溶液推進速度分別為0.1ml/h和1.0ml/h，在溫度25±2℃，相對濕度50±6%的環境下進行電紡，獲得電紡絲膜；再使電紡絲膜與戊二醛水溶液于密閉環境下交聯反應45~50h，真空干燥，得ica-sf/plcl納米纖維膜樣品。

戊二醛溶液的質量百分數為25%。電紡絲膜的大小12mm×15mm，厚0.3~0.4mm時，戊二醛的用量為10ml。

二、ica-sf/plcl納米纖維膜表征

1、掃描電鏡(sem)

將干燥保存備用的樣本(3×3mm)，真空噴金處理60s，應用jsm-4800型掃描電鏡(jeol,tokyo,japan)于10kv電壓條件下觀察。應用imagej圖像處理軟件(nationalinstitutesofhealth,md,usa)隨機選取纖維（n≧100），計算其平均直徑，并繪制纖維直徑分布圖。

ica-sf/plcl納米維膜sem圖像及纖維直徑分布圖如圖2顯示，見纖維表面形貌光滑連續，纖維直徑均一形成三維立體網狀結構，無串珠樣結構形成；纖維平均直徑為451.57±80.33nm，分布范圍為200~700nm，與天然細胞外基質結構相似，且納米級直徑纖維具有高的比表面積，可為細胞的粘附、生長提供理想的微環境，同時納米級纖維可攜載更多藥物。

2、透射電鏡(tem)

在紡絲過程中，用碳膜噴涂的銅網在電場中小心接取一定量的纖維絲，真空干燥至有機溶劑充分揮發（約需7d）后，在100kv電壓條件下，應用feitecnaif3型透射電鏡（fei,usa）觀察纖維內部結構。

從ica-sf/plcl納米維膜的透射電鏡圖（圖3）可以看到，沿纖維長軸走向其內部形成明顯的芯殼結構。該芯殼結構形成的機理為：在同軸電紡過程中，殼層與芯層紡絲液在噴口處匯合，由于匯合時間短，加上聚合物擴散系數低，因此，芯殼層溶液固化前不會混合。同時，在高壓靜電場力作用下，芯殼層溶液的復合液滴表面聚集大量電荷，在電場力的作用下拉伸形成具有芯殼結構的納米纖維。其中，含原子數相對較多的ica在tem檢測過程中由于吸收電子相對較多，因此在tem圖像上顯示為相對較暗的纖維芯層，相對應的，sf/plcl顯示為纖維殼層，這暗示著中藥單體ica被成功包裹于纖維內部，形成了有效的藥物儲庫型緩釋系統。

3、x射線衍射(xrd)測試

制備的ica-sf/plcl納米纖維膜（15×15mm）采用d/max-2400型x射線多晶衍射儀（rigaku,tokyo,japan）對膜進行晶體結構的檢測。測試條件設置為：掃描速度為6°/min，功率為40kv/150ma，掃描范圍10~60°。

x射線衍射通過檢測材料衍射峰出現的位置，分析材料內部分子或原子結構以確定材料的結構特征。以往的研究關于絲素蛋白和plcl構象表明，silkⅰ在x射線衍射測試中主要衍射峰接近12.2°、19.7°、24.7°和28.2°，plcl靜電紡絲膜在23.6°附近出現明顯的衍射峰。silkⅰ結構不穩定，構象規整性差；而silkii由于主要由結構穩定性較好的β折疊構成，其構象規整性相對較好，穩定性好。ica-sf/plcl納米纖維膜的x射線衍射分析結果如圖4所示，圖像在17.2°左右出現新的衍射峰，而未檢測到其他明顯的衍射峰存在，說明芯層藥物ica的加入，對材料分子結構未產生明顯影響。電紡后的膜經2.5%的戊二醛交聯，絲素蛋白晶體結構的α螺旋轉變為穩定的β折疊，結晶度增強，材料性能穩定性增加。

4、接觸角檢測

納米纖維膜（20×30mm）平整固定于親水角測試儀，吸取30μl去離子水小心低至膜表面，5s后，拍照并測量水滴切線與膜表面間的夾角，作為樣本接觸角。需在膜表面5個不同測試點分別測量，計算其平均值及標準差。

材料的潤濕性與細胞的粘附、增殖和遷移等行為密切相關。研究證實，純plcl纖維膜的接觸角為139.57°，其疏水性較強，表面不利于細胞的黏附、生長。而本研究的ica-sf/plcl載藥纖維膜的接觸角檢測結果（圖5）為125.72±4.93°，其親水性較純plcl纖維膜增加，因此，芯層藥物的加入可以增加膜的親水性，從而有利于細胞的黏附、生長。

5、拉伸強度測試

樣本（10×50mm）兩端寬10mm部分小心夾持于anscmt8102型電子萬能力學試驗機（hounsfield,uk）的夾具上，中間30mm作為測試區。檢測前，需用精密游標卡尺測量樣本平均厚度。以10n測試力、1mm/min測試速度進行樣本的拉伸強度測試，并繪制相應的應力-應變曲線。

gbr膜需足夠的機械強度以抵抗周圍軟組織壓力，以維持有效的骨組織生長空間，避免缺損區塌陷，利于骨細胞的增殖分化。sf結構類似天然細胞外基質結構，為天然的細胞支架材料，但其力學性能較差；而plcl機械性能較好，將plcl與sf共混，可改善sf力學性能差的缺點。ica-sf/plcl納米纖維膜力學性能檢測結果（圖6）顯示，其拉伸強度為（5.54±0.46）mpa，力學性能良好，能滿足臨床gbr膜的強度要求。

6、體外釋藥行為檢測

將一定量的ica-sf/plcl納米纖維膜經紫外線正反面消毒各1h后，浸泡于30ml無菌pbs溶液，置于37℃、100rpm的恒溫水浴振蕩器震蕩，分別于測試的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30d的同一時間點，取5ml釋放液，同時加入同體積的新鮮pbs溶液。從載藥膜釋放獲得的ica的量，通過應用uv2600型紫外分光光度計（shimadzu,japan）在λmax=270nm處檢測不同時間點收集的釋放液的吸光度值計算得到，繪制藥物的累積釋放曲線。

藥物緩釋系統以穩定速率將藥物釋放于靶位點，可提供局部有效藥物濃度，并避免全身藥物副作用。ica-sf/plcl載藥纖維膜體外釋藥結果如圖7所示，從該藥物累積釋放曲線可以看出，整個藥物釋放過程呈現兩個階段：初期的藥物快速釋放階段（最初的5d，藥物累積釋放率達47.54±0.06%）和之后的藥物穩定緩慢釋放階段(最終藥物累計釋放率為82.09±1.86%)。發生這兩個階段的其原因為：在藥物從材料釋放的初期，靠近載藥纖維表面的少量藥物首先快速釋放于周圍介質，之后由于材料在介質中的逐漸降解，纖維表面形成一些微孔，使得芯層藥物進一步以擴散的方式穩定、緩慢的釋放出來，從而可延長藥物從材料中釋放的時間，降低釋放速率，從而實現藥物的緩釋，達到發揮藥物最大功效的目的。

7、體外降解性能

樣本紫外線消毒，20ml無菌pbs（ph=7.4）為本研究的降解介質，置于37℃、100rpm的恒溫振蕩器連續震蕩，分別于測試的0、1、2、4、6周的同一時間點隨機取樣，蒸餾水沖洗干凈，干燥，用掃描電鏡及電子萬能力學試驗機分別對ica-sf/plcl納米纖維膜表面形貌及力學性能變化進行觀察和檢測。

理想的可植入材料的降解應與再生組織的生成同步發生。ica-sf/plcl載藥纖維膜體外降解結果如圖8所示。掃描電鏡圖片觀察發現，降解開始前，膜纖維表面連續光滑，之后由于降解介質的沖刷作用及芯層藥物的不斷釋放，纖維表面開始變得粗糙，出現明顯的蠶蝕狀空洞，但纖維膜整體結構尚存。同時，從每個時間點相對應的纖維膜的應力-應變曲線（圖9）可以看出，隨著降解現象的存在，ica-sf/plcl載藥纖維膜中的部分纖維斷裂，膜整體力學性能降低。說明該載藥纖維膜具有生物可降解性。

三、體外實驗

1、bmmscs的分離、培養與鑒定

從蘭州大學醫學實驗中心購買3~4周齡雄性生理狀況良好的sd大鼠，采用過量麻藥（水合氯醛）處死，立即浸泡于盛有體積分數為75%酒精的容器中10min，置于無菌操作臺的手術板。嚴格無菌條件下獲得股骨，用含10%雙抗的無菌pbs沖洗3~5遍，剪去骨骺端，5ml注射器吸取含1%雙抗(gibco)、10%fbs的l-dmem(hyclone,usa)反復沖洗骨髓腔至骨質發白，加入一定量完全培養液，將沖出的骨髓吹打混勻成單細胞懸液，于5%co2、37°c恒溫孵箱培養。24h后半量換液，之后每2~3天換液。細胞融合度達80%~90%時傳代培養。取第3代細胞進行以下相關實驗的研究。應用流式細胞儀（bdfacscanto，usa）檢測細胞表面標記，進行細胞鑒定：取p3代生長狀態良好的bmmscs，用0.25%胰酶充分消化細胞，1000rpm離心5min，用含1%bsa的pbs清洗細胞3~5次，細胞計數，依次加入單克隆抗體cd34、cd44、cd45和cd90。同時每管設立陰性對照。避光冰上孵育45min，用含1%bsa的pbs再次清洗細胞3~5次，清除未結合抗體，接著，用500μl含1%bsa的pbs將細胞重懸，流式細胞儀進行檢測分析。

流式細胞儀檢測結果如附圖1所示，分離培養的p3代bmmscscd44，cd90陽性表達率較高，陽性率分別為94.9%和98.3%，而cd34，cd45陽性率很低，分別為0.1%和0.7%，綜合以上數據，這些細胞是來自骨髓的bmmscs。

2、膜體外成骨性能檢測

將制備的ica-sf/plcl納米纖維膜按100g/l的比例浸泡于含10%胎牛血清的l-dmem培養基內，37℃、5%co2條件下連續浸提72h，離心過濾后獲得浸提液。備用。

生長狀態良好的p3代bmmscs以1.0×10⁴cells/ml的密度接種于細胞培養皿，加入10ml完全培養液，37℃、5%co2孵箱中孵育；24h后，實驗組加入浸提液培養，對照組用普通完全培養液培養，每三天換液。用2%茜素紅染液（genmedscientificsinc.,usa）進行鈣結節檢測。細胞培養14d后，4%多聚甲醛固定，37℃條件下，茜素紅染色30min檢測鈣結節。

生長狀態良好的p3代bmmscs胰酶消化后，按1×10⁴個/ml接種于3塊96孔板上，37℃、5%co2孵箱中孵育24h后，棄去舊培養液。實驗分為2組，每組設6個復孔，實驗組加入浸提液，對照組加入普通完全培養液，每3天換液一次。分別于第3、7、14d取一塊96孔板，棄培養液，pbs清洗3遍，每孔加入500μl1%的tritonx-100(ambion,bylifetechnologies)，37℃培養箱裂解1h，收集細胞裂解液，按堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京，中國）說明依次加入各試劑，酶聯免疫檢測儀（elx800,bio-tek,winooski,vt,usa）于520nm處測定各孔alp值，以均值進行統計分析（應用spss17.0軟件進行統計學分析，數據以平均值±標準偏差表示。通過單因素方差分析（anova）評價各組間的統計學差異；p<0.05為差異有統計學意義。）。

3、纖維膜體外誘導骨向分化檢測

茜素紅染色及alp活性檢測通常用來成骨分化標志物的檢測。生長狀態良好的p3代bmmscs經ica-sf/plcl載藥纖維膜的浸提液培養14天后，茜素紅染色后可觀察到，細胞周圍出現明顯礦化結節，有橘紅色區域呈現（圖10a）。生長狀態良好的p3代bmmscs經ica-sf/plcl載藥纖維膜的浸提液分別培養3，7，14d后檢測細胞內alp表達活性。發現第3，7，14d，實驗組相比較于對照組，alp活性明顯升高(p＜0.05)。且在浸提液作用下，3-7d時alp活性增長幅度最大（圖10b）。

4、細胞在膜表面形態學觀察

ica-sf/plcl納米纖維膜（10×10mm）紫外線正反面消毒后，用含10%雙抗的pbs沖洗3遍，置于無菌24孔板底部，備用。對數生長期的bmmscs經0.25%胰酶消化后，反復吹打成單細胞懸液進行細胞計數，以1×10⁴細胞/孔的密度接種于膜表面，并用消毒鋼圈固定，滴加一定量的完全培養液，于37℃、5%co2條件下繼續培養，48h全量更換培養液。

細胞接種培養5d后，棄出舊培養基，pbs洗滌3遍，用2.5％的戊二醛固定1h，接著再用pbs沖洗3遍，用已配制好的系列梯度濃度乙醇（30％，50％，70％，90％，95％和100％）進行細胞脫水，細胞脫水結束后進行冷凍干燥6h，噴金處理60s，用掃描電鏡(s-3400n;jeol,tokyo,japan)觀察細胞在膜表面的黏附情況。

掃描電鏡（圖11）圖像顯示，bmmscs接種于ica–sf/plcl載藥纖維膜表面5d后，細胞在膜表面粘附、生長良好，細胞突起沿纖維走向廣泛伸展，并相互融合。tian報道，細胞在材料表面的粘附隨纖維直徑的減小而增加（纖維在50nm至10mm范圍內）。這種變化可歸因于纖維的更大的表面，為細胞粘附提供更多的接觸位點。

5、膜細胞毒性檢測

采用體外四甲基偶氮唑鹽（thiazolylbluetetrazoliumbromide，mtt）法進行ica-sf/plcl載藥纖維膜的細胞毒性檢測。具體的實驗分組包括：實驗組、對照組（無ica-sf/plcl載藥纖維膜）、空白組（無細胞的培養液），每組均設有6個復孔。分別于接種培養后的1、3、5、7d各取一塊24孔培養板，用移液槍每孔加入mtt液(sigma,usa)（質量濃度為5g/l）40μl，繼續培養4h后，每孔再滴加dmso400μl，搖床震蕩30min，使結晶完全溶解。移液槍按每孔100μl轉移至96孔板，用elx800型酶聯免疫檢測儀(elx800,bio-tek,winooski,vt,usa)在490nm處檢測吸光度值。

理想的載藥膜應最大化藥物治療作用，同時毒副作用最小。mtt結果（圖12）表明，bmmscs接種于ica–sf/plcl載藥纖維膜表面培養1、3、5、7d后，實驗組和對照組的od值都隨時間推移呈增加趨勢，說明在有膜和無膜條件下，細胞數量都隨時間變化在增多。同時觀察發現，各時間點實驗組的od值均大于對照組，但差異無統計學意義（p＞0.05）。證實該載藥纖維膜不具有細胞毒性，適宜細胞的生長。

四、體內實驗

1、動物模型的制作和材料植入

27只健康成年雄性sd大鼠（3–4周齡,80–100g）隨機分為三組：i）測試組（ica-sf/plcl納米纖維膜覆蓋骨缺陷區域，n=3）;ii）陰性對照組（sf/plcl膜覆蓋骨缺陷區域，n=3）;iii）和空白對照組（骨缺陷區域無膜覆蓋，n=3）。無菌手術過程如下：10％水合氯醛（0.35ml/100g體重）腹腔注射麻醉，待麻醉顯效后，備皮，局部消毒，顱頂正中作一縱行約2mm切口，分層切開，充分暴露顱骨，在大量生理鹽水沖洗冷卻下，用打磨機慢速以顱骨正中矢狀線為中線，作一直徑為8mm的圓形全層骨缺損，勿損傷硬腦膜。分別植入上述三種材料，使其超出骨缺損范圍約2mm，軟組織復位并逐層嚴密縫合。生理鹽水清洗手術區域，并局部涂布抗生素軟膏。術后所有動物在溫暖環境中蘇醒后，轉移至動物房進行術后護理。

2、μ-ct評估骨生成

分別于術后4、8、12周每組分別安樂處死3只動物，獲得顱骨，小心剔除附著的軟組織，4％多聚甲醛固定24h。應用quantumfx型μ-ct（perkinelmer，hopkinton，ma，usa）進行掃描，其工作條件為：調整電壓為90kv、電流為200μa、視野72mm和掃描分辨率為4.5μm。使用μ-ct圖像分析軟件（skyscan，kontich，belgium）對圖像三維重建后進行新骨體積和骨礦物質密度的測量。

為評價ica-sf/plcl納米纖維膜體內促進成骨作用，本實驗制備了大鼠顱骨直徑為8mm的完全骨缺損。缺損區植入材料4、8、12周后，通過μ-ct評價新骨生成。實驗期間，所有實驗動物植入部位均無炎癥或壞死。μ-ct三維重建圖像（圖13）顯示，與對照相比，ica-sf/plcl納米纖維膜組在術后4、8、12周顯示更多的新骨生成。

進一步應用μ-ct圖像分析軟件進行新骨體積和密度的定量分析（圖14a，b）。結果顯示，術后4周，ica-sf/plcl納米纖維膜組骨缺損區新骨形成統計結果為：新骨體積和密度分別為1.08±0.48mm³和1.04±0.46％。ica-sf/plcl納米纖維膜組與sf/plcl組新骨生成量差異無統計學意義（p>0.05），無膜覆蓋組幾乎觀察不到新骨形成。術后8周，所有組均有新骨形成，與sf/plcl組及無膜覆蓋組比較，ica-sf/plcl納米纖維膜組骨缺損愈合顯著較快，新骨體積和密度分別為6.09±1.27mm³、6.43±0.17％。sf/plcl組與無膜覆蓋組新骨生成體積差異無統計學意義（p>0.05）。術后12周，雖然所有組均顯示有新骨生成，但在ica-sf/plcl納米纖維膜組，新生骨已擴展覆蓋大部分缺陷區域，新骨體積和密度分別為約15.95±3.58mm³和14.02±0.93％，顯示最快和最多骨形成。而sf/plcl組和無膜覆蓋組的新骨形成僅局限于缺損中心或在缺損邊緣。因此，我們證實了從ica-sf/plcl納米纖維膜釋放的ica的具有體內成骨分化活性。

3、組織學檢測

固定后的樣本經脫鈣復合液（甲酸12ml、鹽酸8ml、甲醛5ml、蒸餾水75ml）脫鈣、梯度酒精脫水后，常規石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅(nanjingjianchengbiotechnologyinstitute)染色，光鏡（olympus，ix70，japan）下觀察。使用imagej軟件（nationalinstitutesofhealth，md，usa）定量分析新骨形成，并計算新骨面積與總缺損面積比。

術后4、8、12周樣本進行組織學分析進一步表征新骨形成，并計算新骨面積與總缺損面積的比率（圖13）。術后4周，ica-sf/plcl納米纖維膜組和sf/plcl組均可觀察到有新骨生成，但無膜覆蓋組其骨缺損區被大量纖維結締組織填充，幾乎無新骨生成。術后8周，ica-sf/plcl納米纖維膜組顯示比sf/plcl組或無膜覆蓋組更多的新骨形成。其中無膜覆蓋組可觀察到大量纖維結締組織。術后12周，ica-sf/plcl納米纖維膜組新骨面積顯著高于其他組。sf/plcl組是與纖維脂肪組織混合的新骨填充骨缺陷，無膜覆蓋組只有一些纖維結締組織。

綜上所述，我們利用同軸靜電紡絲成功制備了ica-sf/plcl納米纖維膜，骨促進生長因子ica可包裹于纖維中而無結構完整性或功能的變化。體外成骨誘導分化和體內應用于骨缺損實驗表明，該載藥膜可持續、有效地釋放ica而顯著促進骨生成，且無細胞毒性。因此，應用同軸電紡技術制備的ica-sf/plcl納米纖維膜是一種有前景的gbr膜。

附圖說明

圖1為大鼠骨髓間充質干細胞表面標志物的表達。

圖2為ica-sf/plcl載藥纖維膜sem圖（a：×5000，b：×10000）和纖維直徑分布圖(c)。

圖3為ica-sf/plcl載藥纖維tem圖（×50000）。

圖4為ica-sf/plcl載藥纖維膜xrd圖。

圖5為ica–sf/plcl載藥纖維膜的親水角。

圖6為ica–sf/plcl納米纖維膜應力-應變曲線。

圖7為ica–sf/plcl納米纖維膜體外藥物釋放曲線。

圖8為ica–sf/plcl載藥纖維膜表面形態（a~e）注：a：降解0周；b：降解1周；c：降解2周；d：降解4周；e：降解6周。

圖9為ica–sf/plcl載藥纖維膜拉伸強度(a~e)變化。注：a：降解0周；b：降解1周；c：降解2周；d：降解4周；e：降解6周。

圖10為bmmscs培養于ica-sf/plcl納米纖維膜浸提液后的茜素紅染色結果（a）及alp分（b）。

圖11為觀察bmscs與ica-sf/plcl載藥纖維膜復合后的細胞形態的sem（左：×1500；右：×3500）

圖12為bmscs在ica-sf/plcl載藥纖維膜上培養不同時間增殖情況。注：ica代表ica–sf/plcl載藥纖維膜組。

圖13為顱骨缺損的μ-ct圖像。

圖14為定量分析骨缺損區的新骨體積（a）j及密度百分比（b）。*與對照相比，骨形成明顯增多（注：*p<0.05，**p<0.01。sf表示sf/plcl膜組；ica表示ica-sf/plcl納米纖維膜組）。

圖15為顱骨缺損的新骨形成的組織學分析。（a）顱骨缺損的he染色圖像。比例尺=0.2mm。（b）定量分析顱骨缺損中新骨面積百分比。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明采用同軸靜電紡絲技術制備ica-sf/plcl納米纖維膜的方法作進一步的說明。

（1）再生絲素蛋白的制備：將蠶繭（浙江桐廬，中國）浸于質量分數0.5%的na2co3溶液中煮沸脫膠2次，每次1h；并用蒸餾水洗滌3此除去絲膠，50℃干燥12h后，再在80℃下完全溶解于cacl2/ch3ch2oh/h2o的三元溶劑體系中（cacl2/ch3ch2oh/h2o的摩爾比為1/2/8），然后于蒸餾水中室溫下透析4d，過濾，冷凍干燥，獲得再生絲素蛋白sf。

（2）殼層紡絲液的制備：將上述所得sf與plcl以1:2.3~1:2.5的質量比溶于六氟異丙醇中，且使sf與plcl（mw=1,000,000;naramedicaluniversity,japan）的總質量百分數為8%，常溫磁力攪拌6h，獲得殼層紡絲液；

（3）芯層紡絲液的配制：將ica配制成濃度10^-5μmol/l的水溶液作為芯層紡絲液；

（4）同軸靜電紡絲制備ica-sf/plcl復合納米纖維膜：將配制好的芯層紡絲液、殼層紡絲液分別裝入10ml注射器中，連接同軸電紡雙噴頭，并與高壓靜電發生裝置（dw-p503-1acdf；北京，中國）相連接；控制同軸電紡噴頭與接收板間電壓為15kv，距離為15cm，芯層紡絲液、殼層紡絲溶液推進速度分別為0.1ml/h和1.0ml/h，在溫度25℃左右，相對濕度50±6%的環境下進行電紡，獲得電紡絲膜；再使電紡絲膜用25%的戊二醛（國藥化學試劑有限公司，中國）（電紡絲膜的大小12mm×15mm，厚0.3~0.4mm時，戊二醛的用量10ml）作為交聯劑置于密閉玻璃干燥皿內交聯48h，真空干燥，即得ica-sf/plcl納米纖維膜樣品。