發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于治療疾病或病癥的轉(zhuǎn)基因盒和多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以促進細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)基因表達，以改善靶標(biāo)特異性和安全性。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、基因療法涉及將遺傳物質(zhì)摻入到細(xì)胞中以治療或預(yù)防疾病。遺傳物質(zhì)可以用缺陷基因的功能性拷貝來補充這些缺陷基因、使功能不正常的基因失活、沉默可能與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的基因或向細(xì)胞引入新的治療性基因。

2、基因療法的一個限制是選擇性地決定轉(zhuǎn)基因是否在其被遞送到的細(xì)胞內(nèi)表達的能力。持續(xù)存在對提供細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)基因表達的轉(zhuǎn)基因表達盒的需要，以減少與轉(zhuǎn)基因表達相關(guān)聯(lián)的脫靶效應(yīng)，這反過來又可以改善任何此類基因療法的特異性和安全性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在本文中，發(fā)明人提供了利用mirna靶序列來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的多核苷酸(例如轉(zhuǎn)基因表達盒)。所述表達盒允許調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達，使得減少或消除不需要的表達，從而改善安全性并減少脫靶效應(yīng)。發(fā)明人已經(jīng)使用一系列轉(zhuǎn)基因證明了他們的方法的功效，這些轉(zhuǎn)基因諸如gfp和表觀遺傳沉默因子(esf；作為表觀遺傳抑制子的工程化的致癌轉(zhuǎn)錄因子和癌癥相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子)。

2、在第一方面，提供了多核苷酸，其包含至少一個mir-124靶序列、和/或至少一個mir-338-3p靶序列、和/或至少一個mir-31靶序列，其中mirna靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

3、在一個實施方案中，多核苷酸包含至少一個mir-124靶序列，其中靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

4、在一個實施方案中，多核苷酸包含至少一個mir-338-3p靶序列，其中靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

5、在一個實施方案中，多核苷酸包含至少一個mir-31靶序列，其中靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

6、在一個實施方案中，多核苷酸包含至少一個mir-124靶序列和至少一個mir-338-3p靶序列，其中靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

7、在一個實施方案中，多核苷酸包含至少一個mir-124靶序列和至少一個mir-31靶序列，其中靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

8、在一個實施方案中，多核苷酸包含至少一個mir-338-3p靶序列和至少一個mir-31靶序列，其中靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

9、在一個實施方案中，多核苷酸包含至少一個mir-124靶序列、至少一個mir-338-3p靶序列和至少一個mir-31靶序列，其中靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

10、在一方面，提供了多核苷酸，其包含至少一個mir-124靶序列、至少一個mir-338-3p靶序列、和至少一個mir-31靶序列，其中所述mirna靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

11、在一個實施方案中，mirna靶序列中的每一種的拷貝數(shù)獨立地選自由以下組成的組：1個、2個、3個和4個。

12、在一個實施方案中，多核苷酸包含四個mir-124靶序列、四個mir-338-3p靶序列和四個mir-31靶序列，其中mirna靶序列可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

13、在一個實施方案中：

14、(a)mir-124靶序列包含與seq?id?no:1具有至少90％序列同一性，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；

15、(b)mir-338-3p靶序列包含與seq?id?no:2具有至少90％序列同一性，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；和/或

16、(c)mir-31靶序列包含與seq?id?no:3具有至少90％序列同一性，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。

17、在一個實施方案中，mir-124靶序列包含與seq?id?no:1具有至少90％序列同一性，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。在一個實施方案中，mir-338-3p靶序列包含與seq?id?no:2具有至少90％序列同一性，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。在一個實施方案中，mir-31靶序列包含與seq?idno:3具有至少90％序列同一性，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。

18、在一個實施方案中：

19、(a)mir-124靶序列包含與seq?id?no:1具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；

20、(b)mir-338-3p靶序列包含與seq?id?no:2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；和/或

21、(c)mir-31靶序列包含與seq?id?no:3具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。

22、在一個實施方案中：

23、(a)mir-124靶序列包含與seq?id?no:1具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；

24、(b)mir-338-3p靶序列包含與seq?id?no:2具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；和/或

25、(c)mir-31靶序列包含與seq?id?no:3具有至少95％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。

26、在一個實施方案中：

27、(a)mir-124靶序列包含與seq?id?no:1具有至少99％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；

28、(b)mir-338-3p靶序列包含與seq?id?no:2具有至少99％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；和/或

29、(c)mir-31靶序列包含與seq?id?no:3具有至少99％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。

30、在一個實施方案中：

31、(a)mir-124靶序列包含與seq?id?no:1具有100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；

32、(b)mir-338-3p靶序列包含與seq?id?no:2具有100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成；和/或

33、(c)mir-31靶序列包含與seq?id?no:3具有100％序列同一性的核苷酸序列，或由其組成。

34、在一個實施方案中，mirna靶序列位于轉(zhuǎn)基因的下游，即3'。換言之，mirna靶序列可以在5'至3'方向上位于轉(zhuǎn)基因之后。

35、在一個實施方案中，mirna靶序列位于轉(zhuǎn)基因的3'-utr內(nèi)。

36、在一個實施方案中，mirna靶序列或mirna靶序列的拷貝簇從5'到3'按以下順序排列：一個或多個mir-124靶序列、一個或多個mir-338-3p靶序列和一個或多個mir-31靶序列。靶序列或包含其一個或多個拷貝的簇可以例如從5'至3'排列，使得它們根據(jù)其靶特異性形成組，例如，在一個實施方案中，多核苷酸包含5'-[mir-124靶序列]4–[mir-338-3p靶序列]4–[mir-31靶序列]4–3'。

37、單個的靶序列以及靶序列簇均可以彼此相鄰、由間隔序列分隔或其任何組合。

38、因此，在一個實施方案中，mirna靶序列由間隔序列分隔。

39、在一個實施方案中，提供了多核苷酸，其中多核苷酸包含與seq?id?no:4具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一個實施方案中，多核苷酸包含與seq?id?no:4具有至少90％，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

40、在一個實施方案中，mirna靶序列包含如seq?id?no:4所示的序列。

41、在一個實施方案中，mirna靶序列由如seq?id?no:4所示的序列組成。

42、在一個實施方案中，多核苷酸進一步包含啟動子。在一個實施方案中，啟動子可操作地連接至轉(zhuǎn)基因。

43、在一個實施方案中，啟動子是組成型啟動子。在一些實施方案中，組成型啟動子是ef1a啟動子。

44、在一個實施方案中，啟動子是組織特異性啟動子，優(yōu)選地癌細(xì)胞特異性啟動子。

45、在一個實施方案中，啟動子是增殖細(xì)胞特異性啟動子。

46、在一個實施方案中，多核苷酸進一步包含可操作地連接至轉(zhuǎn)基因的啟動子，任選地其中啟動子是組織特異性啟動子或組成型啟動子，任選地癌細(xì)胞特異性啟動子。

47、在一個實施方案中，啟動子選自由以下組成的組：mki67啟動子、ccnd1啟動子、ccnb2啟動子、ccna2啟動子、cdc25c啟動子、cdc2啟動子、cks1啟動子、pcna啟動子、cdc6啟動子、pold1啟動子、csk1b啟動子、mcm2啟動子和plk1啟動子。

48、在一個實施方案中，啟動子是mki67啟動子。

49、在一個實施方案中，啟動子是ef1a啟動子。

50、在一方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的載體。

51、在一個實施方案中，載體是病毒載體。

52、在一個實施方案中，載體是慢病毒載體。

53、在一個實施方案中，載體是腺相關(guān)病毒(aav)載體。

54、在一個實施方案中，aav載體是血清型2、5或9。在優(yōu)選的實施方案中，載體是aav2載體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，載體是aav5載體。

55、在一個實施方案中，載體是mrna載體。

56、mirna靶序列的順序可以變化。在一個實施方案中，mirna靶序列或序列的拷貝簇從5'到3'按以下順序排列：一個或多個mir-124靶序列、一個或多個mir-338-3p靶序列和一個或多個mir-31靶序列。

57、在一個實施方案中，mirna靶序列或序列的拷貝簇從5'到3'按以下順序排列：一個或多個mir-124靶序列、一個或多個mir-31靶序列和一個或多個mir-338-3p靶序列。

58、在另一個實施方案中，mirna靶序列或序列的拷貝簇從5'到3'按以下順序排列：一個或多個mir-338-3p靶序列、一個或多個mir-124靶序列和一個或多個mir-31靶序列。

59、在另一個實施方案中，mirna靶序列或序列的拷貝簇從5'到3'按以下順序排列：一個或多個mir-338-3p靶序列、一個或多個mir-31靶序列和一個或多個mir-124靶序列。

60、在另一個實施方案中，mirna靶序列或序列的拷貝簇從5'到3'按以下順序排列：一個或多個mir-31靶序列、一個或多個mir-124靶序列和一個或多個mir-338-3p靶序列。

61、在另一個實施方案中，mirna靶序列或序列的拷貝簇從5'到3'按以下順序排列：一個或多個mir-31靶序列、一個或多個mir-338-3p靶序列和一個或多個mir-124靶序列。

62、單個的靶序列和序列的拷貝簇均可以彼此相鄰、由間隔序列分隔，或其任意組合。

63、因此，在一個實施方案中，mirna靶序列由間隔序列分隔。

64、在一個實施方案中，提供了多核苷酸，其中多核苷酸包含與seq?id?no:4具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一個實施方案中，多核苷酸包含與seq?id?no:4具有至少90％，諸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。

65、在一方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或載體的納米顆粒。

66、在一個實施方案中，納米顆粒是聚合物納米顆粒、無機納米顆?；蛑|(zhì)納米顆粒。在一些實施方案中，納米顆粒是脂質(zhì)體。

67、在一方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體或納米顆粒的細(xì)胞。

68、在一個實施方案中，細(xì)胞是真核細(xì)胞，諸如哺乳動物細(xì)胞。在另一個實施方案中，細(xì)胞是人細(xì)胞。

69、在一方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體、納米顆粒或細(xì)胞的組合物。

70、組合物可以是水凝膠。在一些實施方案中，水凝膠是聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯(peg-dma)水凝膠。在一些實施方案中，水凝膠進一步包含羥基磷灰石納米顆粒。

71、在一方面，提供了藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體、納米顆?；蚣?xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑、溶劑、載劑、鹽和/或佐劑。

72、在一方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體、納米顆粒、細(xì)胞、組合物或藥物組合物，其用于在療法中使用。

73、在一方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體、納米顆粒、細(xì)胞、組合物或藥物組合物，其用于在疾病或病癥的治療中使用。

74、在一方面，提供了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體、納米顆粒、細(xì)胞、組合物或藥物組合物，其用于在癌癥的治療中使用。

75、在一些實施方案中，局部施用多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物(例如水凝膠)。

76、在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體、納米顆粒、細(xì)胞、組合物或藥物組合物在制備用于療法的藥物中的用途。

77、在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸、載體、納米顆粒、細(xì)胞、組合物或藥物組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。