本技術涉及一種負載降低轉甲狀腺素蛋白核酸的含鈣脂質納米粒，尤其是一種內核中含有鈣離子的用于負載降低轉甲狀腺素蛋白核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒，進一步地涉及一種內核中含有鈣離子的用于負載降低轉甲狀腺素蛋白小干擾rna的含鈣的陽離子脂質納米粒。本發(fā)明所公開的用于負載降低轉甲狀腺素蛋白核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒具有高效降低轉甲狀腺素蛋白mrna及蛋白的特性。

背景技術：

1、轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性(transthyretin?amyloidosis，attr)疾病是由轉甲狀腺素蛋白(transthyretin，ttr)錯誤折疊導致其在組織中異常沉積引起的疾病，其發(fā)病率低，屬于罕見病，確診后生存期一般僅2-12年，常見臨床表型為轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性多發(fā)性神經病(transthyretin?amyloidosis?polyneuropathy，attr-pn)和轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性心肌病(transthyretin?amyloidosis?cardiomyopathy，attr-cm)，表現為進行性加重至危及生命。ttr主要由肝細胞產生，正常生理條件下以同源四聚體形式存在于外周血中，轉運甲狀腺素和維生素a，編碼ttr的基因發(fā)生突變以及隨年齡增長，可導致ttr的蛋白四聚體結構不穩(wěn)定，ttr單體在外周神經系統(tǒng)、心臟、眼、腎臟、腦膜等組織中病理聚集，形成不溶性淀粉樣沉積。

2、目前針對attr-cm，僅有一款小分子藥物氯苯唑酸(tafamidis)上市，為ttr穩(wěn)定劑，通過與ttr的甲狀腺素結合位點結合，穩(wěn)定野生型及突變型ttr的四聚體結構，減緩其解離成單體。批準用于attr-pn治療的藥物主要包括反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，aso)藥物tegsedi，及alnylam公司開發(fā)的兩款sirna藥物，商品名分別為onpattro和amvuttra，其中onpattro為采用脂質納米粒(lipid?nanoparticles，lnp)遞送敲低ttr的sirna的制劑產品，amvuttra為采用n-乙酰半乳糖胺(galnac)偶聯(lián)的敲低ttr的sirna的產品，兩者均有較高的肝臟遞送效率，通過rna干擾技術敲低ttr達到約90％。lnp作為ttr-sirna遞送載體，顯示了其高效的遞送效率和安全性，已被fda批準用于attr-pn的治療，然而，由于其非臨床研究中發(fā)現的多種毒性效應，包括肝臟毒性(肝細胞壞死/空泡化、炎性細胞浸潤、色素沉積)、脾臟毒性(萎縮、細胞減少)、免疫系統(tǒng)毒性(脾臟淋巴細胞耗竭、淋巴結壞死)等，限制了其給藥劑量，即使在上市藥品onpattro使用劑量下，臨床試驗中相較于安慰劑組仍存在明顯副作用，包括輸注反應、消化不良、呼吸困難、肌肉痙攣等等。如何在更低的使用劑量下，達到同樣的ttr降低水平，從而減少藥物帶來的副作用，對于attr疾病的治療具有重要意義。

技術實現思路

1、本技術涉及一種負載降低轉甲狀腺素蛋白核酸的含鈣脂質納米粒，尤其是一種內核中含有鈣離子的用于負載降低轉甲狀腺素蛋白核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒，進一步地涉及一種內核中含有鈣離子的用于負載降低轉甲狀腺素蛋白小干擾rna的含鈣的陽離子脂質納米粒。本發(fā)明所公開的用于負載降低轉甲狀腺素蛋白核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒具有高效降低轉甲狀腺素蛋白mrna及蛋白的特性。

2、方面1.一種負載核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于所述陽離子脂質納米粒包含陽離子脂質、中性脂質、peg化脂質和膽固醇和/或膽固醇酯；

3、所述陽離子脂質納米粒中含有鈣離子，其鈣離子所對應的陰離子不是磷酸根，磷酸氫根以及磷酸二氫根；和

4、所述陽離子脂質納米粒中不含有非peg基團修飾負電性脂質；

5、所述陽離子脂質納米粒負載了用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸。

6、方面2.如方面1所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于：用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸為質粒dna、單鏈dna、雙鏈dna、sirna、shrna、airna、mirna、mrna、環(huán)狀rna、grna、適配體、核酶、反義寡核苷酸aso或其任意的組合；優(yōu)選地，用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸為sirna或aso；

7、更優(yōu)選地，用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸為sirna，其中所述sirna包含有義鏈和與之至少85％互補的反義鏈，該有義鏈具有至少17個鄰接核苷酸的核苷酸序列，該有義鏈或反義鏈之一具有至少85％的區(qū)域能夠互補作用于表1的ttr基因序列的部分連續(xù)區(qū)域內；

8、進一步更優(yōu)選地，用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸為sirna，其中所述sirna包含有義鏈和與之至少90％互補的反義鏈，該有義鏈具有至少17個鄰接核苷酸的核苷酸序列，該反義鏈具有至少90％的區(qū)域能夠互補作用于表1的ttr基因序列的部分連續(xù)區(qū)域內；進一步更優(yōu)選地，用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸為sirna，其中所述sirna包含有義鏈和與之互補的反義鏈，該有義鏈具有至少17個鄰接核苷酸的核苷酸序列，該反義鏈具有至少95％的區(qū)域能夠互補作用于表1的ttr基因序列的部分連續(xù)區(qū)域內；

9、進一步更優(yōu)選地，用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸為sirna，其序列獨立地選自如下的序列之一：

10、

11、其中小寫字母代表2'-o-甲基核苷酸殘基，小寫加下劃線字母代表2'-氟代核苷酸殘基，*代表硫代磷酸鍵。

12、方面3.如方面1或2所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于所述陽離子脂質納米粒中含有非沉淀狀態(tài)的鈣離子。

13、方面4.如方面1或2所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于鈣在制劑整體中的濃度為0.01～150mmol/l；優(yōu)選為0.01～10mmol/l或10～150mmol/l；優(yōu)選為0.01～0.1mmol/l，0.1～1mmol/l，1～10mmol/l，10～100mmol/l或100～150mmol/l；更優(yōu)選為0.01～0.1mmol/l，0.1～1mmol/l，1～10mmol/l，10～30mmol/l，30～50mmol/l，50～70mmol/l，70～90mmol/l，90～110mmol/l，110～130mmol/l或130～150mmol/l；

14、更優(yōu)選鈣在制劑整體中的濃度為0.01～10mmol/l；更優(yōu)選為0.02～8mmol/l；更優(yōu)選為0.05～5mmol/l；更優(yōu)選為0.1～3mmol/l；

15、更優(yōu)選地，鈣在制劑整體中的濃度為濃縮前為0.1～1mmol/l，優(yōu)選地為0.1～0.5mmol/l，更優(yōu)選地為0.1～0.5mmol/l；和/或鈣在制劑整體中的濃度為濃縮后為1～10mmol/l，優(yōu)選地為1～5mmol/l，更優(yōu)選地為2～4mmol/l。

16、方面5.如方面1或2所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于陽離子脂質納米粒中的鈣占溶液總體積的濃度為10-30000μm，優(yōu)選20-10000μm，優(yōu)選為30-3000μm；

17、更優(yōu)選地，陽離子脂質納米粒中的鈣占溶液總體積的濃度為濃縮前為30-300μm，優(yōu)選為50-200μm，更優(yōu)選為60-180μm；和/或陽離子脂質納米粒中的鈣占溶液總體積的濃度為濃縮后為500-5000μm，優(yōu)選為1000-4000μm，更優(yōu)選為2000-3000μm。

18、方面6.如方面1或2所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于陽離子脂質納米粒中鈣與脂質摩爾比為1：(5～50)，更優(yōu)選為1：(8～30)，更優(yōu)選為1：(10～14)。

19、方面7.如方面1或2所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于陽離子脂質納米粒中鈣與制劑中膽固醇總量的摩爾比為1：(1～20)；優(yōu)選為1：(1～15)；更優(yōu)選為1：(3～12)；更優(yōu)選為1：(4～7)。

20、方面8.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于：鈣離子來自鈣鹽，優(yōu)選為可溶性鈣鹽，進一步優(yōu)選為醋酸鈣、氯化鈣、edta鈣鈉、葡萄糖酸鈣、磷酸二氫鈣、硝酸鈣、碳酸氫鈣、硫酸氫鈣、亞硫酸氫鈣、溴化鈣、碘化鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣，更進一步優(yōu)選為醋酸鈣、edta鈣鈉、葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣，更進一步優(yōu)選為醋酸鈣；

21、優(yōu)選地，鈣離子來自濃度為50mmol/l～1000mmol/l的鈣鹽溶液；優(yōu)選鈣離子來自濃度為50～150mmol/l的鈣鹽溶液，150～300mmol/l的鈣鹽溶液，300～500mmol/l的鈣鹽溶液或500～800mmol/l的鈣鹽溶液；

22、更優(yōu)選鈣離子來自濃度為100±50mmol/l的鈣鹽溶液，200±50mmol/l的鈣鹽溶液，300±50mmol/l的鈣鹽溶液，400±50mmol/l的鈣鹽溶液，500±50mmol/l的鈣鹽溶液，600±50mmol/l的鈣鹽溶液，700±50mmol/l的鈣鹽溶液，800±50mmol/l的鈣鹽溶液或900±50mmol/l的鈣鹽溶液；

23、更優(yōu)選鈣離子來自濃度為200±20mmol/l的鈣鹽溶液。

24、方面9.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于核酸的磷酸根摩爾數：陽離子脂質的正電荷摩爾數為1：(0.5～20)，優(yōu)選為1：(1～10)，更優(yōu)選為1：(1.5～6)，更優(yōu)選為1：(1.5～3)或1：(3～6)，更優(yōu)選為1：3。

25、方面10.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于核酸：脂質質量比為1：(1～100)，優(yōu)選1：(5～90)，更優(yōu)選1：(10～70)，進一步優(yōu)選1：(10～30)，進一步優(yōu)選為1：(15～20)。

26、方面11.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于：負載核酸的量為5μg/ml～15mg/ml；

27、優(yōu)選負載核酸的量為5μg/ml～10μg/ml，10μg/ml～20μg/ml，20μg/ml～30μg/ml，30μg/ml～70μg/ml，70μg/ml～150μg/ml，150μg/ml～300μg/ml，300μg/ml～400μg/ml，400μg/ml～800μg/ml，800μg/ml～1mg/ml，1mg/ml～1.5mg/ml，1.5mg/ml～2mg/ml，2mg/ml～4mg/ml，4mg/ml～6mg/ml，6mg/ml～8mg/ml，8mg/ml～10mg/ml或10～15mg/ml；更優(yōu)選負載核酸的量為10μg/ml～100μg/ml(優(yōu)選地為30μg/ml～70μg/ml)，和/或任選地制備后根據需要弄縮至所需要濃度；

28、更優(yōu)選負載核酸的量為優(yōu)選地為30μg/ml～70μg/ml，和/或任選地制備后根據需要弄縮至所需要濃度4mg/ml～6mg/ml，6mg/ml～8mg/ml，8mg/ml～10mg/ml或10～15mg/ml。方面12.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于構成所述陽離子脂質納米粒的脂質包括如下組中一種或多種的組合：陽離子脂質、膽固醇和/或膽固醇酯、中性脂質、peg化脂質；

29、優(yōu)選地，構成所述陽離子脂質納米粒的脂質包括如下脂質：

30、(1)陽離子脂質：所述陽離子脂質選自可電離陽離子脂質；

31、(2)膽固醇脂質：所述膽固醇脂質選自膽固醇和/或膽固醇酯；

32、(3)中性脂質：所述中性脂質選自磷脂、脂肪酸甘油酯或糖脂或其任意的組合；和任選的(4)peg化脂質；

33、更加優(yōu)選地，構成所述陽離子脂質納米粒的脂質包括：

34、(1)陽離子脂質：所述陽離子脂質選自可電離陽離子脂質；

35、(2)膽固醇脂質：所述膽固醇脂質選自膽固醇；

36、(3)中性脂質：所述中性脂質選自磷脂；和

37、任選的(4)peg化脂質。

38、方面13.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于構成所述陽離子脂質納米粒的脂質包括摩爾比為10％-50％的陽離子脂質和/或25％-75％的膽固醇脂質；

39、優(yōu)選地，構成所述陽離子脂質納米粒包括摩爾比為20％-40％的陽離子脂質和/或40％-60％的膽固醇脂質；

40、更優(yōu)選地，構成所述陽離子脂質納米粒包括摩爾比為33.3％±5％的陽離子脂質和/或51.3％±5％的膽固醇脂質。

41、方面14.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于構成所述陽離子脂質納米粒的脂質包括如下摩爾比例的各組的組合：

42、(1)陽離子脂質：10％-50％，

43、(2)膽固醇脂質：25％-75％，

44、(3)中性脂質：1％-30％，

45、(4)peg化脂質：0.5％-5％；

46、更優(yōu)選地，構成所述陽離子脂質納米粒的脂質包括如下摩爾比例的各組的組合：

47、(1)陽離子脂質：20％-40％，

48、(2)膽固醇脂質：40％-60％，

49、(3)中性脂質：10％-15％，

50、(4)peg化脂質：1％-3％；

51、更優(yōu)選地，構成所述陽離子脂質納米粒的脂質包括如下摩爾比例的各組的組合：

52、(1)陽離子脂質：33.3％±5％，

53、(2)膽固醇脂質：51.3％±5％，

54、(3)中性脂質：13.3％±5％，

55、(4)peg化脂質：2％±1％。

56、方面15.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于陽離子脂質選自可電離陽離子脂質；優(yōu)選地，可電離陽離子脂質選自dsdma，dlindma，dlendma，dodma，a6，of-02，a18-iso5-2dc18，98n12-5，9a1p9，c12-200，ckk-e12，7c1，g0-c14，l319，304o13，of-deg-lin，306-o12b，306oi10，ftt5，sm102，alc-0315，a9，lipid?2,2(8,8)4cch3，cl1，lp01，dlin-mc3-dma或前述任意的陽離子脂質的類似物及組合；更優(yōu)選地，可電離陽離子脂質選自dlin-mc3-dma；和/或中性磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、9a1p9、10a1p10的一種或多種；優(yōu)選中性磷脂選自二硬脂酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂和磷脂酰乙醇胺中的一種或多種；更優(yōu)選中性磷脂選自二硬脂酰磷脂酰膽堿；和/或peg化脂質選自甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mpeg-dspe)、甲氧基聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺(mpeg-dope)、甲氧基聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(mpeg-dppe)、聚乙二醇-二月桂酰甘油(peg-dag)、聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(peg-dmg)、聚乙二醇-二棕櫚酰甘油(peg-dpg)、聚乙二醇-二硬脂酰甘油(peg-dsg)、聚乙二醇-二油酰甘油(peg-dog)、聚乙二醇-二亞油酰甘油(peg-dling)、聚乙二醇-雙月桂酰丙胺(peg-daa)、聚乙二醇-雙肉豆蔻酰丙胺(peg-dma)、聚乙二醇-雙棕櫚酰丙胺(peg-dpa)、聚乙二醇-雙油酰丙胺(peg-doa)、聚乙二醇-雙亞油酰丙胺(peg-dlina)、聚乙二醇-神經酰胺(peg-ceramide)、硬脂酰聚乙二醇酯、維生素e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)及其任意的組合；優(yōu)選地，peg化脂質選自聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(peg-dmg)；

57、其中peg為聚合度選自3～100的peg基團；優(yōu)選peg為聚合度選自3～50或50～100的peg基團；更優(yōu)選peg為聚合度選自3～10，10～20，20～30，30～40，40～50，50～60，60～70，70～80，80～90或90～100的peg基團；更優(yōu)選peg為聚合度選自約5，約10，約15，約20，約25，約30，約35，約40，約45，約50，約55，約60，約65，約70，約75，約80，約85，約90，約95或約100的peg基團。

58、方面16.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于：含鈣的陽離子脂質納米粒的粒徑25～1000nm；優(yōu)選地，脂質納米粒的粒徑是25～50nm、50～200nm、200～500nm或500～1000nm；更優(yōu)選地，脂質納米粒的粒徑是25～75nm、75～150nm、150～225nm、225～350nm、350nm～500nm、500～800nm或800～1000nm；更優(yōu)選地，脂質體納米粒的粒徑是40±10nm，50±10nm，60±10nm，70±10nm，80±10nm，90±10nm，100±10nm，110±10nm，120±10nm，125±10nm，130±10nm，140±10nm，150±10nm，160±10nm，170±10nm，180±10nm，190±10nm，200±10nm，210±10nm，220±10nm或250±10nm。

59、方面17.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于：含鈣的陽離子脂質納米粒選自如下的納米粒制劑：

60、以陽離子脂質(優(yōu)選dlin-mc3-dma)、膽固醇、中性磷脂(優(yōu)選dspc)、peg化脂質(優(yōu)選peg2000-dmg)為脂質，以醋酸鈣為鈣離子來源，負載sirna的含鈣的陽離子脂質納米粒；

61、以陽離子脂質(優(yōu)選dlin-mc3-dma)、膽固醇、中性磷脂(優(yōu)選dspc)、peg化脂質(優(yōu)選peg2000-dmg)為脂質，以醋酸鈣為鈣離子來源，負載mrna的含鈣的陽離子脂質納米粒；

62、以陽離子脂質(優(yōu)選dlin-mc3-dma)、膽固醇、中性磷脂(優(yōu)選dspc)、peg化脂質(優(yōu)選peg2000-dmg)為脂質，以醋酸鈣為鈣離子來源，負載dna的含鈣的陽離子脂質納米粒；

63、優(yōu)選地，含鈣的陽離子脂質納米粒選自如下的納米粒制劑：

64、以陽離子脂質(優(yōu)選dlin-mc3-dma)、膽固醇、中性磷脂(優(yōu)選dspc)、peg化脂質(優(yōu)選peg2000-dmg)為脂質，以醋酸鈣為鈣離子來源，負載sirna的含鈣的陽離子脂質納米粒；其中陽離子脂質(優(yōu)選dlin-mc3-dma)、膽固醇、中性磷脂(優(yōu)選dspc)、peg化脂質(優(yōu)選peg2000-dmg)的摩爾比為陽離子脂質：33.3％±5％，膽固醇：51.3％±5％，中性脂質：13.3％±5％，peg化脂質：2％±1％。

65、方面18.如前述任意一項方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒，其特征在于：所述的含鈣的陽離子脂質納米粒具有靶向肝臟作用。

66、方面19.一種含鈣的陽離子脂質納米粒組合物，其特征在于將含鈣的核酸溶液與脂質溶液混合后制得，

67、優(yōu)選地混合后將ph值調節(jié)至中性；

68、優(yōu)選地，所述核酸溶液為sirna在鈣鹽水溶液中的溶液，和/或所述脂質溶液為陽離子脂質(優(yōu)選dlin-mc3-dma)、膽固醇、中性磷脂(優(yōu)選dspc)、peg化脂質(優(yōu)選peg2000-dmg)在乙醇中的溶液。

69、方面20.方面1-19所述的負載核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒或方面20所述的含鈣的陽離子脂質納米粒組合物用于制備向體內靜脈注射用的基因藥物的用途。

70、方面21.方面1-19所述的負載核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒或方面20所述的含鈣的陽離子脂質納米粒組合物用于制備治療轉甲狀腺素蛋白介導的淀粉樣變性、遺傳性ttr淀粉樣變性(hattr)的藥物的用途；

71、優(yōu)選地，所述甲狀腺素運載蛋白介導的淀粉樣變性為家族性甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性或散發(fā)性甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性；

72、更優(yōu)選地，所述家族性甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性為家族性淀粉樣心肌病(fac)、家族性淀粉樣多發(fā)性神經病(fap)或中樞神經系統(tǒng)選擇性淀粉樣變性(cnsa)；所述散發(fā)性甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性為老年全身性淀粉樣變性(ssa)或老年心臟淀粉樣變性(sca)。

73、方面22.一種負載了用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒的制備方法，其特征在于步驟(1)：將陽離子脂質、膽固醇脂質、中性磷脂、peg化脂質與乙醇混合形成脂質溶液；

74、步驟(2)：將含有水溶性鈣鹽的水相與用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸混合形成核酸溶液；

75、步驟(3)：將步驟(1)和步驟(2)中的溶液混合形成所述的負載了用于降低轉甲狀腺素蛋白的核酸的含鈣的陽離子脂質納米粒；以及

76、任選的步驟(4)透析調節(jié)ph。

77、方面23.方面22所述的制備方法，步驟(1)中有機相溶劑選自能夠與水混溶的溶劑；優(yōu)選地，有機相溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、仲丁醇、dmso、dmf、醋酸及其任意的組合；更優(yōu)選地，有機相溶劑選自乙醇、正丙醇、異丙醇；更優(yōu)選地，有機相溶劑選自乙醇。

78、方面24.方面22所述的制備方法，步驟(1)中脂質包括如下摩爾比例的各組的組合：(1)陽離子脂質：10％-50％，

79、(2)膽固醇脂質：25％-75％，

80、(3)中性脂質：1％-30％，

81、(4)peg化脂質：0.5％-5％；

82、更優(yōu)選地，步驟(1)中脂質包括如下摩爾比例的各組的組合：

83、(1)陽離子脂質：20％-40％，

84、(2)膽固醇脂質：40％-60％，

85、(3)中性脂質：10％-15％，

86、(4)peg化脂質：1％-3％；

87、進一步優(yōu)選地，步驟(1)中中脂質包括如下摩爾比例的各組的組合：

88、(1)陽離子脂質：33.3％±5％，

89、(2)膽固醇脂質：51.3％±5％，

90、(3)中性脂質：13.3％±5％，

91、(4)peg化脂質：2％±1％。

92、方面25.方面22所述的制備方法，步驟(1)中脂質選自：

93、陽離子脂質選自可電離陽離子脂質；優(yōu)選地，可電離陽離子脂質選自dsdma，dlindma，dlendma，dodma，a6，of-02，a18-iso5-2dc18，98n12-5，9a1p9，c12-200，ckk-e12，7c1，g0-c14，l319，304o13，of-deg-lin，306-o12b，306oi10，ftt5，sm102，alc-0315，a9，lipid2,2(8,8)4cch3，cl1，lp01，dlin-mc3-dma或前述任意的陽離子脂質的類似物及組合；更優(yōu)選地，可電離陽離子脂質選自dlin-mc3-dma；和/或中性磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、9a1p9、10a1p10的一種或多種；優(yōu)選中性磷脂選自二硬脂酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆磷脂和磷脂酰乙醇胺中的一種或多種；更優(yōu)選中性磷脂選自二硬脂酰磷脂酰膽堿；和/或peg化脂質選自甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mpeg-dspe)、甲氧基聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺(mpeg-dope)、甲氧基聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(mpeg-dppe)、聚乙二醇-二月桂酰甘油(peg-dag)、聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(peg-dmg)、聚乙二醇-二棕櫚酰甘油(peg-dpg)、聚乙二醇-二硬脂酰甘油(peg-dsg)、聚乙二醇-二油酰甘油(peg-dog)、聚乙二醇-二亞油酰甘油(peg-dling)、聚乙二醇-雙月桂酰丙胺(peg-daa)、聚乙二醇-雙肉豆蔻酰丙胺(peg-dma)、聚乙二醇-雙棕櫚酰丙胺(peg-dpa)、聚乙二醇-雙油酰丙胺(peg-doa)、聚乙二醇-雙亞油酰丙胺(peg-dlina)、聚乙二醇-神經酰胺(peg-ceramide)、硬脂酰聚乙二醇酯、維生素e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)及其任意的組合；優(yōu)選地，peg化脂質選自聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油(peg-dmg)；

94、其中peg為聚合度選自3～100的peg基團；優(yōu)選peg為聚合度選自3～50或50～100的peg基團；更優(yōu)選peg為聚合度選自3～10，10～20，20～30，30～40，40～50，50～60，60～70，70～80，80～90或90～100的peg基團；更優(yōu)選peg為聚合度選自約5，約10，約15，約20，約25，約30，約35，約40，約45，約50，約55，約60，約65，約70，約75，約80，約85，約90，約95或約100的peg基團。

95、方面26.方面22所述的制備方法，步驟(2)水溶性鈣鹽選自醋酸鈣、氯化鈣、edta鈣鈉、葡萄糖酸鈣、磷酸二氫鈣、硝酸鈣、碳酸氫鈣、硫酸氫鈣、亞硫酸氫鈣、溴化鈣、碘化鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣，更進一步優(yōu)選為醋酸鈣、edta鈣鈉、葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣，更進一步優(yōu)選為醋酸鈣；

96、優(yōu)選地，水溶性鈣鹽濃度為50mmol/l～1000mmol/l的鈣鹽溶液；優(yōu)選水溶性鈣鹽濃度為50～150mmol/l的鈣鹽溶液，150～300mmol/l的鈣鹽溶液，300～500mmol/l的鈣鹽溶液或500～800mmol/l的鈣鹽溶液；

97、更優(yōu)選水溶性鈣鹽濃度為100±50mmol/l的鈣鹽溶液，200±50mmol/l的鈣鹽溶液，300±50mmol/l的鈣鹽溶液，400±50mmol/l的鈣鹽溶液，500±50mmol/l的鈣鹽溶液，600±50mmol/l的鈣鹽溶液，700±50mmol/l的鈣鹽溶液，800±50mmol/l的鈣鹽溶液或900±50mmol/l的鈣鹽溶液；

98、更優(yōu)選水溶性鈣鹽濃度為200±20mmol/l的鈣鹽溶液。

99、方面27.方面22所述的制備方法，步驟(2)所使用鈣鹽溶液為弱酸性溶液，優(yōu)選地為ph值為4-6.8的弱酸性溶液，更優(yōu)選地ph值為5±0.5的弱酸性溶液。

100、方面28.方面22所述的制備方法，步驟(3)中混合方式為

101、步驟(1)所得溶液與步驟(2)所得溶液通過流過同一管路進行混合；優(yōu)選地，所述同一管路的混合器為三通管、微流控芯片、或其任意的變種方式；更優(yōu)選地，所述同一管路的混合器為y型管、t型管、微流控芯片、或其任意的變種方式；

102、更優(yōu)選地，混合通過流速比調控。

103、方面29.方面22所述的制備方法，步驟(3)中步驟(1)所得溶液與步驟(2)所得溶液的流速比為1：(3～6)，優(yōu)選為1：(4～5)，優(yōu)選為1：4.5。

104、方面30.方面22所述的制備方法，步驟(4)通過透析調節(jié)ph值為中性。

105、將溶有脂質的有機相與含鈣和ttr?sirna的水相混合形成負載ttr?sirna的含鈣的陽離子脂質納米粒。發(fā)明人基于研究驚人地發(fā)現，當陽離子脂質納米粒的內核中含有可溶性鈣鹽時，使用脂質納米粒負載核酸藥物具有轉染效率高、包封穩(wěn)定、粒度均一可控和特異性靶向肝臟器官的特性。通過檢測核酸起效的作用的實驗發(fā)現，本發(fā)明的含鈣的陽離子脂質納米粒所負載的干擾rna能夠顯著降低相關mrna含量，負載的ttr?sirna可顯著降低相關ttr?mrna和蛋白的量。

106、除非另外指明，以下術語具有它們被賦予的含義。

107、除非上下文另外需要，本說明書和權利要求書中詞語“包含”及其變形，如“包括”和“含有”，以及開放且包括的含義解釋，即為“包括，但不限于”。

108、術語“沉淀狀態(tài)的鈣離子”指在常規(guī)狀態(tài)下其純凈的物質為難溶狀態(tài)的鈣鹽，例如磷酸鈣、碳酸鈣、氟化鈣等。術語“非沉淀狀態(tài)的鈣離子”指在常規(guī)狀態(tài)下其純凈的物質為非難溶狀態(tài)，即包含可溶解、易溶解、微溶解狀態(tài)的鈣離子，包括但不限于醋酸鈣、氯化鈣、edta鈣鈉、葡萄糖酸鈣、磷酸二氫鈣、硝酸鈣、碳酸氫鈣、硫酸氫鈣、亞硫酸氫鈣、溴化鈣、碘化鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣等。

109、術語“dna”指采用非復制型基因或復制型基因載體作為的表達載體。

110、術語“干擾rna”或“rnai”或“干擾rna序列”指這樣的單鏈rna(例如，成熟mirna)或雙鏈rna(即，雙鏈體rna諸如sirna，airna，或前-mirna)，其在當干擾rna與靶基因或序列處于相同細胞中時，能夠降低或抑制該靶基因或序列的表達(例如，通過介導降解和抑制與干擾rna序列互補的mrna的翻譯)。干擾rna因此指與靶mrna序列互補的單鏈rna或由兩條互補鏈或由單條自身互補鏈形成的雙鏈rna。干擾rna可以與靶基因或序列具有基本或完全的同一性，或可以包括錯配區(qū)(即，錯配基序)。干擾rna的序列可以與全長靶基因或其子序列相對應。

111、干擾rna包括“小干擾rna”或“sirna，”例如，長度約15-60，15-50，或15-40個(雙鏈體)核苷酸，更典型長度約15-30，15-25，或19-25個(雙鏈體)核苷酸，和優(yōu)選長度約20-24，21-22，或21-23個(雙鏈體)核苷酸的干擾rna(例如，雙鏈sirna的每條互補鏈序列是長度15-60，15-50，15-40，15-30，15-25，或19-25個核苷酸，優(yōu)選長度約20-24，21-22，或21-23個核苷酸，且雙鏈sirna是長度約15-60，15-50，15-40，15-30，15-25，或19-25個堿基對，優(yōu)選長度約18-22，19-20，或19-21個堿基對)。sirna雙鏈體可以包括約1-約4個核苷酸或約2-約3個核苷酸的3’突出端和5’磷酸末端。sirna的實例包括，但不僅限于，由兩個單獨的鏈分子裝配的雙鏈多核苷酸分子，其中一條鏈是有義鏈且另一條是互補的反義鏈；由單鏈分子裝配的雙鏈多核苷酸分子，其中有義區(qū)和反義區(qū)通過基于核酸或基于非核酸的接頭相連；含有具有自互補有義區(qū)和反義區(qū)的發(fā)夾二級結構的雙鏈多核苷酸分子；和含有有兩個以上環(huán)結構和具有自互補有義區(qū)和反義區(qū)的莖部的環(huán)形單鏈多核苷酸分子，其中所述環(huán)形多核苷酸可以在體內或體外加工以生成活性雙鏈sirna分子。

112、優(yōu)選地，sirna是化學合成的。sirna還可以通過使用大腸桿菌(e.coli)rna酶iii或dicer裂解較長的dsrna(例如，長度大于約25個核苷酸的dsrna)來產生。這些酶將dsrna加工為生物活性sirna(參見，例如，yang等，proc.natl.acad.sci.usa(美國科學院院刊)，99：9942-9947(2002)；calegari等，proc.natl.acad.sci.usa(美國科學院院刊)，99：14236(2002)；byrom等，ambion?technotes(ambion技術手冊)，10(1)：4-6(2003)；kawasaki等，nucleic?acids?res.(核酸研究)，31：981-987(2003)；knight等，science(科學)，293：2269-2271(2001)；和robertson等，j.biol.chem(生物化學雜志).，243：82(1968))。優(yōu)選地，dsrna長度是至少50個核苷酸-約100，200，300，400，或500個核苷酸。dsrna長度可以長達1000，1500，2000，5000個核苷酸或更長。dsrna可以編碼完整基因轉錄物或部分基因轉錄物。在某些實例中，sirna可以由質粒來編碼(例如，轉錄為自動折疊成具有發(fā)夾環(huán)的雙鏈體的序列)。

113、術語“基本上相同”或“基本同一性”在兩個或更多核酸的上下文中指當通過使用以下序列比較算法之一或通過手動比對和目測測量時在比較窗，或指定區(qū)域范圍內比較和比對最大對應性時，為相同的或具有特定百分比的相同核苷酸(即，在特定區(qū)域范圍內至少約60％，優(yōu)選至少約65％、70％、75％、80％、85％、90％，或95％同一性)的兩個或更多個序列或子序列。該定義，在上下文指出時，還類似意指序列的互補體。優(yōu)選地，基本同一性在長度至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55，或60個核苷酸的區(qū)域范圍內存在。

114、術語“核酸”用于本文中時，指含有處于單鏈或雙鏈形式的至少兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物并且包括dna和rna。dna可以采用下列形式：例如，反義分子、質粒dna、預濃縮dna、pcr產物、載體(p1，pac，bac，yac，人工染色體)、表達盒、嵌合序列、染色體dna、或這些組的衍生物和組合。rna可以采用下列形式：sirna、不對稱干擾rna(airna)、微小rna(mirna)、mrna、trna、rrna、trna、病毒rna(vrna)、和其組合。核酸包括包含已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，且其具有與參考核酸類似的結合特性。所述類似物的實例包括，但不僅限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2’-o-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(pnas)。除非特別限定，該術語包括包含具有與參考核酸類似的結合特性的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另外指明，具體的核酸序列還固有地包括其保守修飾變體(例如，簡并密碼子取代)、等位基因、直向同源物、snp、和互補序列以及明確指出的序列。特別地，簡并密碼子取代可以通過產生這樣的序列實現，在所述序列中，一種或多種所選(或全部)密碼子的第三個位置被混合的堿性和/或脫氧肌苷殘基(batzer等，nucleic?acid?res.(核酸研究)，19：5081(1991)；ohtsuka等，j.biol.chem.(生物化學雜志)，260：2605-2608(1985)；rossolini等，mol.cell.probes(分子細胞探針)，8：91-98(1994))取代。“核苷酸”包含糖脫氧核糖(dna)或核糖(rna)，堿基，和磷酸基團。核苷酸通過磷酸基團連接在一起。“堿基”包括嘌呤和嘧啶，其進一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然類似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于，放置新的反應基團諸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基鹵化物的修飾。

115、術語“基因”是指包含用于產生多肽或前體多肽所必需的部分長度或全長編碼序列的核酸(例如，dna或rna)序列。

116、術語“脂質”是指一組有機化合物，其包括但不僅限于脂肪酸的酯，并且特征是在水中不溶，但是在許多有機溶劑中是可溶的。通常將它們分成至少三類：(1)“簡單脂質”，其包括脂肪和油以及蠟；(2)“化合物脂質”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生的脂質”諸如類固醇。

117、“脂質顆粒”用于本文中時，指可以用于遞送活性劑或治療劑，諸如核酸(例如，干擾rna)，至目標靶部位的脂質制劑。在本發(fā)明的典型由陽離子脂質、非-陽離子脂質、和防止顆粒聚集的結合脂質形成的脂質顆粒中，所述活性劑或治療劑可以包封在脂質中，由此保護試劑免受酶降解。

118、磷脂的代表性實例包括，但不限于，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿和二亞油酰磷脂酰膽堿。缺乏磷的其它化合物，諸如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰甘油和β-酰氧酸也包括在被稱為兩親性脂質的組中。另外，上述的兩親性脂質可與其它脂質混和，所述其他脂質包括甘油三酯類和固醇類。

119、術語“中性脂質”，當存在于脂質顆粒中時，可以是在生理ph下以不帶電荷或中性兩性離子形式存在的許多脂質種類的任一種。此類脂質包括，例如二酰基磷脂酰膽堿、二酰基磷脂酰乙醇胺、神經酰胺、鞘磷脂、二氫鞘磷脂、膽固醇、腦磷脂和腦苷脂類。用于本文中描述的顆粒的中性脂質的選擇通常通過考慮，例如脂質體大小和脂質體在血流中的穩(wěn)定性來指導。優(yōu)選地，中性脂質成分是具有兩個酰基的脂質(即，二酰基磷脂酰膽堿和二酰基磷脂酰乙醇胺)。具有多種不同鏈長度和飽和度的酰基鏈基團的脂質體是可獲得的或可通過公知的技術來分離或合成。在一組實施方案中，含有具有在c10至c20范圍內的碳鏈長度的飽和脂肪酸的脂質是優(yōu)選的。在另一組實施方案中，使用具有帶有在c10至c20范圍內的碳鏈長度的單或二不飽和脂肪酸的脂質。此外，可使用具有飽和和不飽和脂肪酸鏈的混合物的脂質。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的中性脂質是dope、dspc、popc、dppc或任意相關的磷脂酰膽堿。用于本發(fā)明的中性脂質還可由鞘磷脂、二氫鞘磷脂或具有其它頭部基團，例如絲氨酸和肌醇的磷脂類組成。

120、術語“負電性脂質”指在分子中含有游離磷酸羥基的脂質。由于磷酸羥基的存在，使這一類脂質在溶液中能夠電離正電性性氫離子而帶負電，包括但不限于磷脂酰絲氨酸等酸性磷脂。

121、術語“帶有peg基團的負電性脂質”指peg修飾的負電性脂質”，包括但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(dspe-mpeg2000)。

122、術語“非peg基團修飾負電性脂質”指不含有peg修飾的負電性脂質，例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油。

123、術語“非陽離子脂質”指任何兩親性脂質以及任何其他中性脂質或陰離子脂質。

124、術語“陰離子脂質”指在生理ph值下帶負電荷的任何脂質。這些脂質包括，但不限于，磷脂酰甘油、心磷脂、二酰磷脂酰絲氨酸、二酰磷脂酸、n-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、n-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、n-戊二酰磷脂酰乙醇胺、賴氨酰磷脂酰甘油、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(popg)，和其它與中性脂質連接的陰離子修飾基團。

125、術語“陽離子脂質”指在選定的ph值，諸如生理ph值或制劑制備過程中所用ph值下攜帶凈正電荷的許多脂質物種中的任何一種。已經意外地發(fā)現，包含具有多個不飽和位點，例如，至少2或3個不飽和位點的烷基鏈的陽離子脂質特別有效用于形成具有增加的膜流動性的脂質顆粒。也有效用于本發(fā)明的許多陽離子脂質和相關類似物已經記述在美國專利公開號20060083780和20060240554；美國專利號5,208,036；5,264,618；5,279,833；5,283,185；5,753,613；和5,785,992；和pct公開號wo96/10390中，通過引用將其公開內容整體引入本文中用于全部目的。陽離子脂質的非限制性實例詳細記述在本文中。在一些情形中，陽離子脂質包含可質子化叔胺(例如，可ph滴定的)頭基，c18烷基鏈，所述頭基和烷基鏈之間的醚鍵，和0至3個雙鍵。這樣的脂質包括，例如，dsdma，dlindma，dlendma，dodma，a6，of-02，a18-iso5-2dc18，98n12-5，9a1p9，c12-200，ckk-e12，7c1，g0-c14，l319，304o13，of-deg-lin，306-o12b，306oi10，ftt5，sm102，alc-0315，a9，lipid?2,2(8,8)4cch3，cl1，lp01，mc3或前述任意的陽離子脂質的類似物。

126、術語“陽離子脂質的類似物”指陽離子脂質在任選的碳鏈上碳原子個數的變化所產生的結構相似的陽離子脂質。

127、在一些實例中，陽離子脂質選自式(ia)陽離子脂質：

128、

129、其中r1a和r2a在每一次出現時各自獨立地為c10-c30烷基、c10-c30烯基或c10-c30炔基；優(yōu)選地，其中r1a和r2a均包括至少一個不飽和位置；更優(yōu)選地，其中r1a和r2a均包括至少二個不飽和位置；更優(yōu)選地，其中r1a和r2a均包括至少二個雙鍵；

130、r3a為nh2-c1-8烷基-，nh(c1-8烷基)-c1-8烷基-或nh(c1-8烷基)2-c1-8烷基-；優(yōu)選地，r3a為nh2-(ch2)-，nh2-(ch2)2-，nh2-(ch2)3-，nh2-(ch2)4-，nh2-(ch2)5-，nh2-(ch2)6-，nh2-(ch2)7-，nh2-(ch2)8-，nh(ch3)-(ch2)-，nh(ch3)-(ch2)2-，nh(ch3)-(ch2)3-，nh(ch3)-(ch2)4-，nh(ch3)-(ch2)5-，nh(ch3)-(ch2)6-，nh(ch3)-(ch2)7-，nh(ch3)-(ch2)8-，n(ch3)2-(ch2)-，n(ch3)2-(ch2)2-，n(ch3)2-(ch2)3-，n(ch3)2-(ch2)4-，n(ch3)2-(ch2)5-，n(ch3)2-(ch2)6-，n(ch3)2-(ch2)7-或n(ch3)2-(ch2)8-；

131、e為o、n(q)c(o)、c(o)n(q)、(q)nc(o)o、oc(o)n(q)、ss或o＝n，以及q為氫或甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基；優(yōu)選地，e為o、nhc(o)、n(ch3)c(o)、c(o)nh、c(o)n(ch3)、nhc(o)o、n(ch3)c(o)o、c(o)onh或c(o)on(ch3)。

132、在一些實例中，陽離子脂質選自式(ib)陽離子脂質：

133、

134、r1b選自由c5-30烷基、c5-20烯基、-rb*ycrb”、-ybrb”和-rb”mb’rb’組成的組；

135、r2b和r3b獨立地選自由h、c1-14烷基、c2-14烯基、-rb*ybrb”、-ybrb”和-rb*orb”組成的組，或r2b和r3b連同它們所附接的原子一起形成雜環(huán)或碳環(huán)；

136、r4b選自由c3-6碳環(huán)、-(ch2)1-5q、-(ch2)1-5chqbrb、-chqbrb、-cqb(rb)2和未取代的c1-6烷基組成的組，其中qb選自碳環(huán)、雜環(huán)、-orb、-o(ch2)1-5n(rb)2、-c(o)orb、-oc(o)rb、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-n(rb)2、-c(o)n(rb)2、-n(rb)c(o)rb、-n(rb)s(o)2rb、-n(rb)c(o)n(rb)2、-n(rb)c(s)n(rb)2、-n(rb)r8b、-o(ch2)1-5orb、-n(rb)c(＝nr9b)n(rb)2、-n(rb)c(＝chr9b)n(rb)2、-oc(o)n(rb)2、-n(rb)c(o)orb、-n(orb)c(o)rb、-n(orb)s(o)2rb、-n(orb)c(o)orb、-n(orb)c(o)n(rb)2、-n(orb)c(s)n(rb)2、-n(orb)c(＝nr9b)n(rb)2、-n(orb)c(＝chr9b)n(rb)2、-c(＝nr9b)n(rb)2、-c(＝nr9b)rb、-c(o)n(rb)orb和-c(rb)n(rb)2c(o)orb；各r5b獨立地選自由c1-3烷基、c2-3烯基和h組成的組；各r6b獨立地選自由c1-3烷基、c2-3烯基和h組成的組；m和mb’獨立地選自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(rb’)-、-n(rb’)c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(orb’)o-、-s(o)2-、-s-s-、芳基基團和雜芳基基團；r7b選自由c1-3烷基、c2-3烯基和h組成的組；r8b選自由c3-6碳環(huán)和雜環(huán)組成的組；r9b選自由h、cn、no2、c1-6烷基、-orb、-s(o)2rb、-s(o)2n(rb)2、c2-6烯基、c3-6碳環(huán)和雜環(huán)組成的組；各rb獨立地選自由c1-3烷基、c2-3烯基和h組成的組；各rb’獨立地選自由c1-18烷基、c2-18烯基、-rb*yrb”、-yrb”和h組成的組；各rb”獨立地選自由c3-14烷基和c3-14烯基組成的組；各rb*獨立地選自由c1-12烷基和c2-12烯基組成的組；各yb獨立地是c3-6碳環(huán)；各xb獨立地選自由f、cl、br和i組成的組。

137、在一些實例中，陽離子脂質選自式(ic)陽離子脂質：

138、

139、其中，g1c和g2c各自獨立地為未取代的-(ch2)6-,-(ch2)7-,-(ch2)8-,-(ch2)9-或-(ch2)10-；

140、g3c為未取代的-(ch2)-,-(ch2)2-,-(ch2)3-,-(ch2)4-,-(ch2)5-,-(ch2)6-,-(ch2)7-,-(ch2)8-,-(ch2)9-,-(ch2)10-,-(ch2)11-或-(ch2)12-；

141、r1c和r2c各自獨立地為c6-24烷基或c6-24烯基；

142、r3c為or5c、cn、-c(＝o)or4c、-oc(＝o)r4c或–nr5cc(＝o)r4c；

143、r4c為c1-12烴基；并且

144、r5c為h，甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基。

145、在一些實例中，陽離子脂質選自式(ida)或式(idb)陽離子脂質：

146、

147、l1d和l2d各自獨立地為-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-nradc(＝o)-、-c(＝o)nrad-、-nradc(＝o)nrad-、-oc(＝o)nrad-、-nradc(＝o)o-或鍵；

148、g3d為-(ch2)-,-(ch2)2-,-(ch2)3-,-(ch2)4-,-(ch2)5-或-(ch2)6-；

149、rad為h或c1-12烴基；

150、r1ad和r1bd在每次出現時獨立地為：(a)h或c1-12烴基；或者(b)r1ad為h或c1-12烴基，并且r1bd連同其連接的碳原子與相鄰的r1bd及其連接的碳原子一起形成碳-碳雙鍵；

151、r2ad和r2bd在每次出現時獨立地為：(a)h或c1-12烴基；或者(b)r2ad為h或c1-12烴基，并且r2bd連同其連接的碳原子與相鄰的r2bd及其連接的碳原子一起形成碳-碳雙鍵；

152、r3ad和r3bd在每次出現時獨立地：(a)為h或c1-12烴基；或者(b)r3ad為h或c1-12烴基，并且r3bd連同其連接的碳原子與相鄰的r3bd及其連接的碳原子一起形成碳-碳雙鍵；

153、r4ad和r4bd在每次出現時獨立地：(a)為h或c1-12烴基；或者(b)r4ad為h或c1-12烴基，并且r4bd連同其連接的碳原子與相鄰的r4bd及其連接的碳原子一起形成碳-碳雙鍵；

154、r5d和r6d各自獨立地為h或甲基；

155、r7d為被-(c＝o)orbd、-o(c＝o)rbd、-c(＝o)rbd、-orbd、-c(＝o)srbd、-nradrbd、-nradc(＝o)rbd、-c(＝o)nradrbd、-nradc(＝o)nradrbd、-oc(＝o)nradrbd、-nradc(＝o)orbd任選取代的c6-16烴基，其中rad為h或c1-12烴基；rbd為c1-15烴基；

156、r8d和r9d各自獨立地為c1-12烴基；或者r8d和r9d，連同它們連接的氮原子，一起形成5元、6元或7元的雜環(huán)。

157、術語“dlin-mc3-dma”指cas號為1224606-06-7的物質。該物質結構為

158、

159、術語“dsdma”指cas號為871258-14-9的物質，該物質結構為

160、

161、術語“dlendma”指cas號為874291-25-5的物質，該物質結構為

162、

163、術語“dodma”指cas號為104162-47-2的物質，該物質結構為

164、

165、術語“a6”指結構為的物質。

166、術語“of-02”指結構為的物質。

167、術語“a18-iso5-2dc18”指結構為的物質。

168、術語“98n12-5”指結構為的物質。

169、術語“9a1p9”指結構為的物質。

170、術語“c12-200”指結構為的物質。

171、術語“ckk-e12”指結構為的物質。

172、術語“g0-c14”指結構為的物質。

173、術語“l(fā)319”指結構為的物質。

174、術語“sm-102”指cas號為2089251-47-6，結構為

175、的物質。

176、術語“alc-0315”指cas號為2036272-55-4，結構為

177、的物質。

178、術語“a9”指結構為的物質。

179、術語“l(fā)ipid?2,2(8,8)4cch3”指結構為的物質。

180、術語“cl1”指結構為的物質。

181、術語“l(fā)p01”指結構為的物質。

182、術語“mc3”或“dlin-mc3-dma”指結構為的物質。

183、術語“peg2000-dmg”指1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethyleneglycol-2000，中文名為二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000。它的分子式為c122h242o50，分子量2509.2，結構式為：

184、n＝45。

185、除了上文中明確描述的陽離子脂質外，還可將在大約生理ph下攜有凈正電荷的其它陽離子脂質包含在本發(fā)明的脂質顆粒中。此類陽離子脂質包括但不限于n，n-二油基-n，n-二甲基氯化銨(″dodac″)；n-(2，3-二油基氧基)丙基-n，n-n-三乙基氯化銨(″dotma″)；n，n-二硬脂酰基-n，n-二乙基溴化銨(″ddab″)；n-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-n，n，n-三乙基氯化銨(″dotap″)；1，2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷鹽酸鹽(″dotap.cl″)；3-(n-(n’，n’-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)膽固醇(″dc-chol″)、n-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-n-2-(精胺甲酰胺基)乙基)-n，n-二甲基三氟乙酸銨(″dospa″)、二-十八烷基氨基甘氨酰基羧精胺(″dogs″)，1，2-二油基-sn-3-磷酸乙醇胺(″dope″)、1，2-二油酰基-3-二甲基丙胺(″dodap″)、n，n-二甲基-2，3-二油基氧基)丙胺(″dodma″)和n-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n，n-二甲基-n-羥乙基溴化銨(″dmrie″)。此外，可使用許多陽離子脂質的商業(yè)制劑，諸如，例如，lipofectin(包括dotma和dope，可從gibco/brl獲得)和lipofectamine(包括dospa和dope，可從gibco/brl獲得)。在特定的實施方案中，陽離子脂質是氨基脂質。

186、縮寫“chol”指膽固醇。

187、“n/p”的比值指組合物所包含全部的陽離子脂質的正電荷摩爾數：磷酸根摩爾數。

188、術語“calnp”是指前述任一方面所述的含鈣的陽離子脂質納米粒。

189、術語“哺乳動物”指任何哺乳動物物種諸如人、小鼠、大鼠、狗、貓、倉鼠、豚鼠、兔、家畜等。

190、人ttr基因如下所示：

191、表1：人ttr基因(ncbi?reference?sequence:nm_000371.4)

192、

193、

194、本技術中作用于ttr基因的核酸(優(yōu)選地，為sirna)包含有義鏈和與之至少85％互補的反義鏈。該核酸的有義鏈具有至少17個鄰接核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述有義鏈序列具有在17個鄰接核苷酸上的與所述反義鏈至少85％互補的區(qū)域。該核酸的有義鏈或反義鏈之一(優(yōu)選地，為反義鏈)具有至少85％的區(qū)域能夠互補作用于表1的ttr基因序列的部分連續(xù)區(qū)域內。