本發明屬于納米材料和功能性物質的控制釋放領域，具體涉及一種利用同軸靜電紡絲技術制備負載活性物質的結腸靶向控釋體系的制備方法和應用。

背景技術：

近年來，隨著人們對食品改善人類營養及健康功能的日益關注，功能性食品的研究與開發成為現代食品工業發展的新潮流。功能性食品中發揮作用的物質稱為生物活性物質，如活性蛋白與多肽、微生態調節劑、黃酮類與多酚類物質、功能性油脂、生物堿、維生素以及其它生理活性物質等。然而，活性物質在生產加工及儲存過程中穩定性差；口服后也易受上消化道影響(如胃酸及小腸中的蛋白酶)而失活或者發生首過效應被肝臟代謝消除，導致其生物利用度低。因此，亟需構建一個有效的運輸體系來提高活性物質的穩定性和生物利用度。

小腸是營養物質消化吸收的主要場所，近年來，隨著腸道菌群的發現及其促進健康功能的明確，證明了結腸亦可作為營養物質消化吸收的場所。結腸功能性食品的研究與開發成為熱點。與小腸相比，結腸中蛋白酶水平和活力低；結腸壁蠕動緩慢，食物在結腸中運轉時間長，而且結腸壁對蛋白質等大分子物質的穿透阻力比小腸壁小；經結腸吸收還可避免肝臟的首過效應，提高活性物質的生物利用度；另外結腸存在大量的有益菌群，能夠促進營養物質的吸收利用。因此，利用結腸靶向控釋體系將活性物質運載并釋放于結腸，不僅可以提高其生物利用度，而且可大幅度提高諸如腸易激綜合癥、潰瘍性結腸炎等結腸相關疾病的治療效果。

目前，構建結腸靶向控釋體系將活性物質運載并釋放于結腸的方法有噴霧干燥法、冷凍干燥法、流化床包衣法、擠出滾圓法、復凝聚法、微膠囊法及溶劑蒸發法等，但噴霧干燥法對壁材要求高且不適用于熱敏性物質，冷凍干燥法成本高且效率低，流化床包衣法對包衣內核要求較高，擠出法不適于大規模生產，復凝聚法操作過程復雜、活性成分易溶于凝聚溶劑中，溶劑蒸發法采用的有機溶劑易造成環境污染等。因此，負載活性物質的結腸靶向控釋體系的研究具有廣闊的發展前景。

技術實現要素：

針對活性物質的應用中存在穩定性差和生物利用度低的問題，本發明的目的在于提供了一種基于靜電紡絲法制備的負載活性物質的結腸靶向控釋體系及制備方法和其在功能性食品中的應用。

為實現上述目的，本發明提出以下技術方案：

一種核-殼結構納米纖維膜的制備方法，包括如下步驟：

(1)紡絲溶液的制備

將海藻酸鈉、聚氧化乙烯和泊洛沙姆F127溶于蒸餾水/乙醇(體積比為90:10)，攪拌均勻，得到殼層紡絲溶液；

將負載活性物質的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液混合均勻，得到核層紡絲溶液；

(2)同軸靜電紡絲

將殼層紡絲液和核層紡絲液分別注入含有同軸針頭的靜電紡絲裝置中，在室溫下進行同軸靜電紡絲，紡絲過程中溶劑揮發，得到負載納米粒子的核-殼結構納米纖維膜。

所述殼層紡絲溶液中海藻酸鈉的質量分數為6.4％～12％，聚氧化乙烯的質量分數為1.6％～3％，泊洛沙姆F127的質量分數為2％。

所述海藻酸鈉與聚氧化乙烯的質量比為4:1。

所述負載活性物質的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為1:1～3:1。

所述負載活性物質的殼聚糖納米粒子溶液采用離子交聯法制備，其制備方法為：首先將殼聚糖溶于1％，v/v的乙酸溶液，攪拌得到1.5～6mg/ml的殼聚糖溶液；然后向其中加入0.5～3mg/ml的活性物質溶液，攪拌；最后將0.5～4mg/ml的三聚磷酸鈉溶液以300～800μl/min的速率滴加到上述溶液中，獲得負載活性物質的殼聚糖納米粒子溶液。

所述殼聚糖納米粒子對活性物質的包埋率≥75％。

所述負載活性物質的殼聚糖納米粒子，單個納米粒子的直徑為15-30nm。

所述的生物活性物質包括功能蛋白與多肽、微生態調節劑(益生菌及益生元)、黃酮類與多酚類物質、功能性油脂、生物堿、維生素、礦物元素。

所述同軸紡絲的工藝參數為：殼層紡絲液的流速為0.25～0.8ml/h，核層紡絲液的流速為0.2～0.75ml/h，內層針頭直徑0.4～0.6mm，外層針頭直徑0.85～1.26mm，施中加電壓為15～30kv，接收距離為8-20cm。

所述的殼聚糖納米粒子溶液的pH為5～5.5；所述的聚乙烯醇溶液的質量分數為6％～14％。

上述方法制備的核-殼結構納米纖維膜，核層纖維直徑為200-300nm，殼層纖維直徑為300-500nm。

所述的核-殼結構納米纖維膜在制備結腸靶向運輸活性物質中的應用。

與現有技術相比，本發明具有以下優點和有益效果：

(1)本發明首次將同軸靜電紡絲技術應用在活性物質的結腸靶向控釋體系中，其顯著提高了活性功能物質在結腸部位的釋放率，在16h內可實現在結腸75％的釋放，在胃和小腸的釋放率較少，分別為4％和14％左右。

(2)本發明所制備的負載各種活性物質的多糖基靜電紡結腸靶向控釋體系，以海藻酸鈉為主要殼層材料、殼聚糖為主要核層材料，材料來源廣泛、具有良好的生物相容性、可降解性及酶解響應性，能保證控釋體系結腸的靶向釋放。此外，負載納米粒子的核-殼結構具有更優良的釋放性能。

(3)本發明將靜電紡絲的應用拓展到制備負載活性物質的結腸靶向控釋體系的構建中，靜電紡絲技術工藝簡單、綠色環保且生產成本低，與其它方法制備活性物質結腸靶向運輸體系相比，靜電紡絲溫和的操作方式保證了活性物質的生理活性，且所得的納米纖維膜比表面積大、孔隙率高，纖維直徑可控，提高了活性物質的包埋率與釋放率。

(4)本發明適用的生物活性物質，特別是對于功能蛋白和多肽類生物大分子，可以避免這類大分子在上消化道(低的胃酸環境及小腸中的蛋白酶)中的失活；還有可以治療哮喘、心絞痛、關節炎、結腸疾病如潰瘍性結腸炎、出血性結腸炎、克羅恩病及結腸癌等疾病的藥物，其可以減少化療藥物對胃腸道的刺激、提高局部藥物濃度從而提高療效。

(5)本發明制備的負載納米粒子的核-殼結構納米纖維膜只需要制備納米粒子和和同軸靜電紡絲兩步即可完成，節省了時間和材料成本；同時還可以控制核-殼結構的尺寸，進而有效地控制活性物質緩釋速度。

(6)本發明反應條件溫和，對活性物質的緩釋具有很好地控制，且制備的結腸靶向控釋體系具有明顯的結腸靶向性，提高了活性物質的利用度。該結腸靶向控釋體系可用于功能性食品領域。

附圖說明

圖1為實施例1制備的殼聚糖納米粒子TEM圖。

圖2為實施例1制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖(a)、直徑分布圖(b)和TEM圖(c)。

圖3為實施例2制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖4為實施例3制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖5為實施例4制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖6為實施例5制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖7為實施例6制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖8為實施例7制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖9為實施例8制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖10為實施例9制備的結腸靶向控釋體系在連續模擬消化液中的釋放曲線圖。

圖11為實施例10制備的結腸靶向控釋體系在連續模擬消化液中的代表性SEM圖(a，原纖維膜；b，模擬胃液中2h；c，模擬小腸液中4h；d，模擬結腸液中3h；e，模擬結腸液中8h；f，模擬結腸液中15h)。

圖12為實施例11制備的結腸靶向控釋體系在不同釋放介質中的釋放曲線(1)及其相應的數學擬合曲線(2)。

圖13為實施例12制備的結腸靶向控釋體系的紅外吸收光譜圖；

圖14為實施例13制備的結腸靶向控釋體系的熱重曲線的一階微分圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。以下實施例僅用于說明本發明而不限制發明的范圍。應當指出，在屬于本發明構思范圍內的前提下，可以進行多種活性物質的更改或變形，這些都屬于本發明的保護范圍。

實施例1

一種基于靜電紡絲法制備的負載牛血清白蛋白的結腸靶向控釋體系的制備方法，具體步驟如下：

(1)采用離子交聯法制備負載活性物質的殼聚糖納米粒子：以牛血清白蛋白為功能蛋白的模型，首先將中粘度的殼聚糖溶于(1％，v/v)的乙酸溶液，攪拌得到4mg/ml的殼聚糖溶液，然后調pH為5.3并用0.45μm膜過濾；然后向其中加入1.5mg/ml的牛血清白蛋白溶液，攪拌2h并調pH為5.3；最后將1mg/ml的三聚磷酸鈉溶液以400μl/min的速率滴加到上述溶液中，獲得殼聚糖納米粒子溶液。透射電鏡結果可知單個納米粒子的直徑為15-30nm，而采用粒度儀得到的納米粒子平均直徑為145nm，這主要是因為納米粒子在溶液中易發生團聚(圖1)。

(2)殼層溶液的制備方法為：配制質量分數為10％的聚合物溶液(海藻酸鈉：聚氧化乙烯＝8:2,w/w)，然后加入2％質量分數的泊洛沙姆F127，常溫下攪拌24h；

(3)核層溶液的制備方法為：首先將8g聚乙烯醇溶于100mL蒸餾水中，80℃下攪拌3h,得到8％聚乙烯醇溶液，然后冷卻至室溫；然后將(1)中所得負載活性物質的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液以2:1的體積比進行混合，攪拌均勻；

(4)將殼層紡絲液和核層紡絲液分別注入含有同軸針頭的靜電紡絲裝置中,在室溫下進行同軸靜電紡絲,其中殼層紡絲液的流速為0.35ml/h,核層紡絲液的流速為0.3ml/h,內層針頭直徑0.5mm，外層針頭直徑1mm，施中加電壓為17kv，接收距離為15cm。紡絲過程中溶劑揮發，得到負載納米粒子的核-殼結構納米纖維膜。其中核層纖維直徑為200nm，殼層纖維直徑為320nm。

上述工藝條件下制備的納米纖維膜的SEM及TEM圖見圖2。

實施例2

本實施例與實施例1的不同之處在于紡絲電壓為10kv。

上述工藝條件下制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖見圖3。

實施例3

本實施例與實施例1的不同之處在于紡絲電壓為25kv。

上述工藝條件下制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖見圖4。

實施例4

本實施例與實施例1的不同之處在于接收距離為10cm。

上述工藝條件下制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖見圖5。

實施例5

本實施例與實施例1的不同之處在于接收距離為18cm。

上述工藝條件下制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖見圖6。

實施例6

本實施例與實施例1的不同之處在于殼層紡絲液的流速為0.65ml/h,核層紡絲液的流速為0.6ml/h。

上述工藝條件下制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖見圖7。

實施例7

本實施例與實施例1的不同之處在于殼層溶液：配制質量分數為14％的聚合物溶液(海藻酸鈉：聚氧化乙烯＝8:2,w/w)。

上述工藝條件下制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖見圖8。

實施例8

本實施例與實施例1的不同之處在于核層溶液中負載活性物質的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為1:1。

上述工藝條件下制備的結腸靶向控釋體系的SEM圖見圖9。

實施例9

結腸靶向控釋體系在體外模擬胃腸道環境下釋放率的考察，具體步驟如下：

(1)按照實施例1中的方法，制備負載牛血清白蛋白的結腸靶向控釋體系；

(2)參考中國藥典2010版二部附錄體外釋放度測定法第二法(漿法)并作適當修改，條件溫度為37±0.5℃，釋放介質為模擬人工胃液750ml,人工腸液1000ml,人工結腸液900ml,將纖維膜分別置于胃液2h,隨后放入小腸液中4h，最后放入結腸液16h,于設定的時間點取樣,同時補加等量等溫的溶出介質,取出樣品用0.45μm微孔濾膜濾過,采用福林酚法測蛋白濃度,平行做三組,計算累積溶出率。

同時，取特定時間段的纖維膜通過SEM觀察纖維形貌的變化。

部分溶液的配制如下：

A人工胃液：量取濃鹽酸適量,利用pH計,加水稀釋至pH1.2，然后加入10mg/ml胃蛋白酶即得。

B人工腸液:配置pH6.8的磷酸緩沖液，然后加入10mg/ml胰蛋白酶即得。

C人工結腸液：配置pH7.4的磷酸緩沖液，然后加入5U/mlβ-葡萄糖苷酶即得。

參考藥典規定的釋放度模擬試驗,模擬胃、小腸及結腸部位的環境,并根據食物在各段胃腸道內的轉運時間,研究蛋白質的釋放。結果如圖10所示,由圖可知,納米纖維膜在模擬胃液中基本不釋放(<4％),在模擬小腸液中有部分蛋白釋放(<約14％),在模擬結腸液中緩慢釋放,累積釋放率約75％。結果表明制備的納米纖維膜有良好的結腸靶向性。

進一步通過SEM觀察響應時間段的纖維形貌可知(圖11)，在模擬胃液2h后(圖11b)，所得纖維膜形貌與原纖維膜(圖11a)無明顯變化；而在模擬小腸液中，由于殼層的溶解及核層聚乙烯醇的溶脹，纖維膜表面變得粗糙且纖維直徑變大(圖11c)；在模擬結腸液中(圖11d,e,f)，由于β-葡萄糖苷酶對殼聚糖的降解作用，纖維形貌發生明顯的改變，纖維直徑變細且有大量孔洞產生，并且隨著時間延長,孔洞增大，最終纖維膜崩解。

實施例10

結腸靶向控釋體系靶向釋放機制的研究，具體步驟如下：

(1)按照實施例1中的方法，制備負載牛血清白蛋白的結腸靶向控釋體系；

(2)按照實施例2中的方法測定結腸靶向控釋體系在體外模擬胃腸道環境下釋放率，不同之處在于分別考察在不同模擬液中的釋放度，胃液10h，小腸液10h，結腸液16h；

(3)采用一級釋放動力學模型，Higuchi模型，Weibull模型和Ritger-peppas模型對纖維膜在不同模擬液中的累積釋放率(圖12a)進行數學模型擬合(圖12b)，研究釋放機制。

根據擬合相關系數選擇相應的釋放模型，由圖12b可知，在模擬胃液和小腸液中，釋放數據更接近Higuchi模型，說明是釋放機制是Fickian擴散；而在模擬結腸液中，釋放數據接近Weibull模型，說明釋放機制是Complex機制，其包括擴散、溶脹和溶蝕等作用。

實施例11

(1)按照實施例1中的方法，制備負載牛血清白蛋白的結腸靶向控釋體系；

(2)按照實施例2中的方法將結腸靶向控釋體系放置在不同模擬胃腸道環境下，取特定時間段的纖維膜并冷凍干燥。

(3)將(2)所得的納米纖維膜進行紅外光譜掃描，結果見圖(13)。

由于所制備的納米纖維膜其殼層組成為海藻酸鈉和聚氧化乙烯，由圖5可知，海藻酸鈉的紅外特征吸收峰(1606cm^-1為-COO-的不對稱伸縮振動，1412cm^-1為-COO-對稱伸縮振動，1031cm^-1為C-O-C不對稱伸縮振動)與PEO的特征吸收峰(958,1102和1148cm^-1為-C-O-C的伸縮振動三重吸收峰，1342,1240，1275和850cm^-1為C-H的吸收峰)均在纖維膜中呈現；當纖維膜進入模擬胃液后，由于聚氧化乙烯可溶于水其特征峰消失，而海藻酸鈉不溶于酸性環境其特征峰仍存在隨著纖維膜進入模擬小腸液，殼層全部溶解，而核層殼聚糖的特征吸收峰可被檢測到(1610cm^-1為酰胺I帶的彎曲振動吸收峰，1415cm^-1為酰胺II帶的特征吸收峰，酰胺III帶吸收峰在1339cm^-1，1094cm^-1為C-O的伸縮振動峰，845cm^-1為β-糖苷鍵的特征吸收峰；而在模擬結腸液中，殼聚糖的特征峰下降或消失，表明由于β-葡萄糖苷酶對殼聚糖的降解作用，從而實現結腸靶向性。

實施例12

(1)按照實施例1中的方法，制備負載牛血清白蛋白的結腸靶向控釋體系；

(2)按照實施例2中的方法將結腸靶向控釋體系放置在不同模擬胃腸道環境下，取特定時間段的纖維膜并冷凍干燥。

(3)將(2)所得的納米纖維膜進行熱重分析,溫度范圍為室溫至700℃,所得數據轉化熱重曲線的一階微分圖(DTG)。見圖(14)。

由圖14可知，經過不同模擬液處理的纖維膜其DTG圖有明顯差別。實施例1和經過模擬胃液處理的纖維膜具有相近的降解溫度(228℃ vs 221℃,395℃ vs 402℃),說明模擬胃液對纖維膜影響不大；而經過模擬小腸液和模擬結腸液處理的纖維膜，其DTG圖與實施例1有明顯區別，可以看到經過小腸液處理的纖維膜呈現了殼聚糖和聚乙烯醇的降解溫度，而由于結腸液中β-葡萄糖苷酶對殼聚糖的降解作用，經過結腸液處理的纖維膜其DTG圖的峰面積下降，表明殼聚糖已被降解，間接證明纖維膜的結腸靶向性。