本發明涉及一種高產肝素前體的重組枯草芽孢桿菌及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(HS)屬于一類高度硫酸化的糖胺聚糖(GAGs)，糖胺聚糖是一類由重復的二糖單元組成的不分支的帶負電荷的多糖，由于其獨特的生理功能，糖胺聚糖組成了一類具有巨大治療應用潛力的化合物。肝素作為一種抗凝血和抗血栓藥物，在深部靜脈血栓形成、腎透析和留置導管分流術、及術后血栓控制等醫療措施中使用。同時還具有抗血脂，抗炎、抗腫瘤、抑制細菌粘附等作用，自1918年被發現后被廣泛應用于臨床作為抗凝血藥物。其結構復雜、生物活性多樣等特點，研發以肝素和硫酸乙酰肝素為骨架的新藥已成為近年來多糖藥物研究的熱點。

肝素主要通過動物提取法獲得，然而該方法存在種間疾病感染和過硫酸軟骨素污染等風險，且提取過程往往造成環境污染。另外，通過化學法也可從頭合成低分子量的肝素，但因原料昂貴、步驟繁多和產量極低等缺點難以進行大規模制備。近年來，以肝素前體為合成起點進行硫酸化的化學酶法逐漸受到研究者的重視，因此，在微生物中實現肝素前體的高產成為了重要環節。

技術實現要素：

本發明提供了一種高產肝素前體的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌B.subtilis 168基因組整合表達KfiC和KfiA基因的基礎上，以pP43NMK為表達載體共表達肝素前體合成途徑的關鍵酶基因。

在本發明的一種實施方式中，所述共表達是指共表達UDP-GlcUA途徑的關鍵酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表達UDP-GlcNAc途徑的關鍵酶基因glmS、glmM、glmU。

在本發明的一種實施方式中，所述共表達是指組合共表達，所述組合共表達是共表達tuaD和glmU，或共表達tuaD、glmU、gtaB、glmM、glmS。。

本發明的第二個目的是提供所述重組枯草芽孢桿菌的構建方法，是以整合共表達KfiC和KfiA基因的B.subtilis 168為宿主，以pP43NMK為表達載體共表達肝素前體合成途徑的關鍵酶基因；所述共表達是指共表達UDP-GlcUA途徑的關鍵酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表達UDP-GlcNAc途徑的關鍵酶基因glmS、glmM、glmU。

在本發明的一種實施方式中，所述共表達是指組合共表達，所述組合共表達是共表達tuaD和glmU，或共表達tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS。

本發明的第三個目的是提供一種發酵生產肝素前體的方法，所述方法是將所述重組菌接種至發酵培養基中，在37℃下培養24～60h。

在本發明的一種實施方式中，所述發酵培養基以蔗糖為碳源。

在本發明的一種實施方式中，所述發酵培養基的組成成為分：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，3.9g/L硫酸鉀，1.5g/L硫酸鎂，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.5-7.5。

在本發明的一種實施方式中，所述發酵培養基的組成成為分：20g/L酵母粉，15g/L蔗糖，3.9g/L硫酸鉀，1.5g/L硫酸鎂，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.5-7.5。

本發明還提供所述重組枯草芽孢桿菌在醫藥、保健品領域的應用，所述應用具體是制備含肝素的藥品、醫藥配制品。

有益效果：本發明通過在產肝素前體的枯草芽孢桿菌中進行合成途徑優化，即共表達UDP-GlcUA途徑和UDP-GlcNAc途徑中的關鍵酶基因，提高了肝素前體的產量，且重組質粒pP43-DU-PBMS的轉入并沒有成為菌體生長的負擔，菌體量反而比對照菌提高了17.3％，具有較大的應用價值。首先，本發明過程中使用的宿主為食品級，可滿足醫療衛生和食品安全的要求，無內毒素和病原感染的風險；其次，共表達tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS基因導致兩前體物供應充足且比例平衡，并進一步通過3L罐補料分批培養，使肝素前體的積累達到最高，為7.25g/L，分子量為46.66kD。本研究為高產肝素前體提供了新策略，一方面可應用于其它糖胺聚糖，另一方面為工業化大規模生產肝素前體奠定了基礎。

附圖說明

圖1為共表達途徑基因的重組質粒構建示意圖；

圖2為PCR驗證重組枯草芽孢桿菌的構建，M為5000bp的Marker，1-4分別表示含有質粒pP43-DBA，pP43-UMS，pP43-DU和pP43-DU-PBMS的重組菌；

圖3為共表達途徑基因后重組菌的肝素前體產量；

圖4為重組菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS與對照株B.subtilis E168H在搖瓶培養中的細胞生長與產量曲線；

圖5為重組菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS在3L罐中的補料分批培養。

具體實施方式

肝素前體發酵產物分子量檢測分析方法：采用高效體積排阻色譜-多角度激光散射進行分析，選擇示差折光檢測器RI，使用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear進行分析。流動相選擇0.1M硝酸鈉進行洗脫，流速為0.5mL/min，柱子溫度設定為50℃，進樣量為20μL，每個樣品洗脫時間為20min，利用軟件計算平均分子質量和多分散性系數。

實施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)SEQ ID NO.1序列信息為枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖磷酸變位酶的基因pgcA編碼序列；

(2)SEQ ID NO.2序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB編碼序列；

(3)SEQ ID NO.3序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶基因tuaD編碼序列；

(4)SEQ ID NO.4序列信息為枯草芽孢桿菌來源的酰胺轉移酶的基因glmS編碼序列；

(5)SEQ ID NO.5序列信息為枯草芽孢桿菌來源的氨基葡糖磷酸變位酶的基因glmM的編碼序列；

(6)SEQ ID NO.6序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU的編碼序列；

實施例1共表達途徑基因的重組枯草芽孢桿菌的構建

首先制備B.subtilis E168H感受態細胞，所需試劑為無機鹽母液(g/L)：K₂HPO₄140，KH₂PO₄ 60，(NH₄)₂SO₄ 20，(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)10，MgSO4·7H₂O 2；GMI溶液(每100mL)：無機鹽母液9.6mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.4mL，10％酵母汁1mL；GMII溶液(每100mL)：無機鹽母液9.7mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.08mL，10％酵母汁0.04mL，1M MgCl₂0.25mL，1M CaCl₂0.05mL。將B.subtilis E168H單菌落接種于5mL GMI溶液，30℃、125rpm培養16h，取2mL培養液轉接到18mL GMI溶液，37℃、200rpm培養3.5h，再取10mL培養液轉接到90mL GMII溶液，37℃、200rpm培養90min，在4℃、5000g離心10min收集菌體，僅保留10mL液體重懸菌體，以500μL為單位分裝。

以pP43NMK為表達載體，共表達肝素前體合成途徑基因的4個重組型質粒pP43-DBA，pP43-UMS，pP43-DU和pP43-DU-PBMS(圖1)為先前構建(公開于Production of specific-molecular-weight hyaluronan by metabolically engineered Bacillus subtilis 168，Metabolic Engineering，2016，Jinpeng)，通過化轉方式轉化入B.subtilis E168H感受態細胞中，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的篩選平板，挑選轉化子進行PCR驗證。轉化pP43-DBA，pP43-UMS，pP43-DU和pP43-DU-PBMS質粒的重組菌分別用引物gtaB-F/pgcA-R，glmM-F/glmS-R，tuaD-F/glmU-R和glmU-F/gtaB-R驗證，結果如圖2所示，并命名重組菌為B.subtilis E168H/pP43-DBA，B.subtilis E168H/pP43-UMS，B.subtilis E168H/pP43-DU，B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS。

引物序列信息：5’-3’方向

gtaB-F：ATGAAAAAAGTACGTAAAGCCATAA

pgcA-R：TTATTTTGCTGTTGACTCAACAA

glmM-F：ATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACG

glmS-R：TTACTCCACAGTAACACTCTTCGCA

tuaD-F：GTGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAAC

glmU-R：TTATTTTTTATGAATATTTTTCACATAATC

glmU-F：ATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG

gtaB-R：TTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAAC

實施例2重組枯草芽孢桿菌的搖瓶發酵

分別挑取上述構建的4株重組枯草芽孢桿菌及對照菌B.subtilis E168H單菌落，接種于種子培養基，置于200rpm 37℃過夜培養16h。按體積比為10％的接種量轉接于25mL發酵培養基中(250mL搖瓶)，發酵培養基為：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，硫酸鉀3.9g/L，硫酸鎂1.5g/L，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，其中重組菌培養液中需添加50μg/mL卡那霉素。置于200rpm 37℃培養54h，并于接種后第2h添加木糖母液使其終濃度為20g/L進行誘導。

搖瓶培養中取樣的發酵液經10000g離心5min后，向上清液中加入3倍體積的無水乙醇，混勻并于4℃放置1h，再次經10000g離心5min，收集沉淀，加入蒸餾水重新溶解沉淀，該純化步驟重復三次。肝素前體的含量采用Bitter-Muir硫酸咔唑比色法測定，在比色管中加入1mL硼砂硫酸試劑和200μL經一定倍數稀釋后的肝素前體樣品，混勻并在沸水中煮15min，冷卻至室溫，再加入50μL咔唑試劑，混勻并再在沸水中煮15min，冷卻后測定530nm處的吸光值，根據標準曲線計算產量。

根據附圖3中第48h肝素前體產量，較對照菌株B.subtilis E168H(1.71g/L)，含重組質粒的4株重組菌在搖瓶上產量均有提高，其中B.subtilis E168H/pP43-DBA產量為2.37g/L，B.subtilis E168H/pP43-UMS產量為2.20g/L，B.subtilis E168H/pP43-DU產量為2.52g/L，E168H/pP43-DU-PBMS產量最高，為2.89g/L，提高幅度最大，為69.01％。說明兩前體物UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的比例平衡對加快肝素前體的聚合速度非常有利。并且，如圖4所示，重組菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS在第12-24h進入菌體生長穩定期，OD₆₀₀最高為22.4，而對照菌OD₆₀₀最高為19.1，提高17.3％。與對照株相比，重組質粒pP43-DU-PBMS的轉入并沒有成為菌體生長的負擔，菌體量反而稍有提高，另外，根據MALLS-SEC結果(表1)，上述4株重組菌所產肝素前體的M_w分別為53.65kDa，73.83kDa，58.79kDa和75.90kDa，較對照菌(39.72kDa)也均增大。同時，產物的多分散性系數I_p在1.09-1.42之間，尤其是當前體物平衡時，產物分子量分布范圍更集中，說明可通過途徑優化實現更統一分子量的肝素前體的生產。

表1搖瓶中重組菌與對照菌在第48h時所產肝素前體的分子量比較

^a數量平均分子量(M_n)；^b質量平均分子量(M_w)；^c聚合度(I_p＝M_w/M_n).

實施例3重組枯草芽孢桿菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS的3L罐補料分批培養

將重組菌單菌落接種至150mL種子培養基中，37℃、200r/min培養16h，將種子培養液按體積比為10％的接種量轉接至含1.35L發酵培養基的3L發酵罐中，并添加50μg/mL卡那霉素。在接種后第2h添加木糖溶液使終濃度為20g/L進行誘導。使用5M NaOH溶液控制pH為7.0，溫度為37℃，攪拌轉速在接種后8h內為600r/min，8h后為800r/min，通氣量為2.0vvm。補料料液為800g/L的蔗糖母液，當發酵液中蔗糖濃度低于5g/L時開始補料，維持殘糖濃度在0-5g/L。在8-12h期間流加速度分別為7.5、7.5、15、10g/L/h，此后保持5g/L/h的流速至發酵結束。同時采用HPSEC-MALLS測定發酵終點肝素前體的質量平均分子量(M_w)，數量平均分子量(M_n)和分散系數I_p。

如圖5所示，可以看出大量的肝素前體的積累主要集中于菌體生長的穩定期，即細胞生長與產物生成非偶聯。在發酵64h時，肝素前體的產量達到最高，為7.25g/L，是搖瓶水平的2.51倍，此后產量保持穩定。產物的M_w為46.66kDa，較搖瓶培養時降低，可能因為攪拌槳機械剪切力的作用使糖鏈切斷，但I_p值1.28卻顯示3L罐發酵仍較好地保持了相對集中的分子量分布。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種高產肝素前體的重組枯草芽孢桿菌及其應用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacttgga gaaagagcta tgaacgctgg aaacagacag aacatttaga tctggaatta 60

aaagagcgcc ttattgaatt agagggagat gaacaggccc ttgaggactg tttctataaa 120

gaccttgaat tcggtaccgg cggaatgcgc ggggaaatcg gcgccgggac aaatcggatg 180

aatatttaca ctgtgcgcaa agcatcggcc gggtttgcgg catacatctc gaagcaaggt 240

gaggaagcga aaaaacgggg cgttgtcatt gcttatgatt cccgccataa gtctccggag 300

ttcgcgatgg aagcggcaaa aacacttgcg acacaaggca tccaaacata cgtgtttgat 360

gagcttcgcc cgacgccaga gctgtcattc gctgttagac agctgaacgc ttatggtgga 420

attgtggtaa cggcaagcca taacccgcct gaatataacg gctacaaagt atacggggat 480

gatggcggcc agctgcctcc aaaggaagcg gacatcgtca ttgagcaggt aaacgcgatt 540

gaaaatgagc tgacgatcac agtggacgaa gaaaataagt taaaagaaaa aggcttaatc 600

aaaatcatcg gtgaagatat tgataaagtt tatacagaaa aactgacgtc catttctgta 660

catcctgaat tatcggaaga agtagatgta aaggttgttt tcacaccgct gcatggaact 720

gcaaataaac cggtcagacg cggtcttgaa gcactcggct acaaaaatgt aacggttgtc 780

aaagaacagg aactgccgga ttcaaacttc tccactgtta catcgccgaa cccggaagag 840

catgcggcat tcgaatatgc cattaagctt ggggaggagc agaatgcaga tattctcatc 900

gcgacagatc ctgatgctga ccgcctcggc atcgcggtga aaaacgatca aggcaaatat 960

acagtgctga caggaaacca aaccggagcg ttgctgcttc attacctgct ttctgaaaag 1020

aaaaaacaag gcatcctgcc tgataacggt gttgttctca aaacgatcgt cacaagcgaa 1080

atcggccgtg ctgtagcttc ttcattcggc cttgatacga ttgatacgct gacaggcttt 1140

aagtttatcg gtgaaaagat taaggaatac gaagcatcag gccagtatac cttccaattc 1200

ggttatgaag agagctacgg ttatttaatc ggggattttg cccgcgataa ggacgccatt 1260

caggctgcgc ttttggcagt tgaagtttgc gcgttctata aaaaacaggg aatgtcattg 1320

tatgaggcgc tcatcaatct ctttaacgaa tatggttttt atcgtgaagg gctgaaatcc 1380

ctgacgctga aaggcaaaca aggagcagag caaattgaag cgattcttgc ttccttcaga 1440

caaaatccgc cgcagaaaat ggcgggcaaa caggttgtca cagcagaaga ttacgctgta 1500

agcaaacgga cgcttctgac tgaaagcaaa gaagaagcca tcgacttgcc aaaatcaaat 1560

gtattgaaat acttcctgga agacgggtct tggttctgtc tccgtccttc tggaactgag 1620

ccgaaggtta aattttattt cgccgtaaaa gggtcatctt tggaagacag tgaaaagcga 1680

cttgccgtcc tttctgaaga tgtaatgaag acggtggatg aaattgttga gtcaacagca 1740

aaataa 1746

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<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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ataattgaag aagctgttga agccggtatt gaagatatta ttatcgtaac aggaaaaagc 180

aagcgtgcga ttgaggatca ttttgattac tctcctgagc ttgaaagaaa cctagaagaa 240

aaaggaaaaa ctgagctgct tgaaaaagtg aaaaaggctt ctaacctggc tgacattcac 300

tatatccgcc aaaaagaacc taaaggtctc ggacatgctg tctggtgcgc acgcaacttt 360

atcggcgatg agccgtttgc ggtactgctt ggtgacgata ttgttcaggc tgaaactcca 420

gggttgcgcc aattaatgga tgaatatgaa aaaacacttt cttctattat cggtgttcag 480

caggtgcccg aagaagaaac acaccgctac ggcattattg acccgctgac aagtgaaggc 540

cgccgttatc aggtgaaaaa cttcgttgaa aaaccgccta aaggcacagc accttctaat 600

cttgccatct taggccgtta cgtattcacg cctgagatct tcatgtattt agaagagcag 660

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caaagagtgt ttgcttacga ttttgaaggc aagcgttatg atgttggtga aaagctcggc 780

tttatcacaa caactcttga atttgcgatg caggataaag agcttcgcga tcagctcgtt 840

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<212> DNA

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ttagagaagc ttgagtatcg cggttatgac tctgctggta ttgctgttgc caacgaacag 120

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taa 1803

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ccaaaagtgc tgataggccg cgatacacgc atctccggcc atatgctgga gggagccctt 180

gtcgccggac ttttatccat tggcgcagaa gtcatgcgcc tgggtgtcat ttctacacca 240

ggtgtatctt atttgacaaa agcgatggat gcagaggcgg gcgtcatgat ttccgcttct 300

cataacccag tgcaggataa cggcatcaaa ttctttgggg gagatggatt taagctttct 360

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