本發明提供了一種來源于兩棲動物云南臭蛙降血糖肽及制備方法及其應用，屬生物醫學領域。

背景技術：

在自然界漫長的進化過程中，很多動物都產生了具有特定生物學活性的肽類分子，作為高效能的防御和捕食的分子武器，如蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒素、蛙皮毒素等。自然界億萬年的“加速進化選擇”賦予動物多肽類活性分子具有高活力(較其它類型化合物活性高10³-10⁶倍)和高選擇性的特征(可有效區分膜離子通道亞型)；另一方面，在協同進化驅使下，動物多肽類活性分子廣泛存在多拷貝基因家族和高進化速率，從而呈現驚人的分子水平生物多樣性，如每種蜘蛛毒素至少有300種活性多肽、每種蝎子至少有100種以上的活性多肽，估計自然界中的有毒動物含有3000萬種以上的活性多肽。天然活性多肽已成為新藥作用靶點發現與確認的有力工具以及新藥創制先導化合物的重要來源,在基礎科學研究、新興生物產業、創新藥物研發中具有獨特和不可替代的作用。

艾塞那肽Exenatide(商品名Byetta)是由Amylin Pharmaceuticals與禮來(Eli Lilly)公司共同開發的新型2型糖尿病治療藥物。Exendin-4最初是由被稱為“希拉巨蜥”的美國大毒蜥(Heloderma suspectum)分離純化得到的，是一種含有39個氨基酸的GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)類似物，其一級結構與人GLP-1有53％的同源性，但顯示出更強的穩定性和更長效的作用。艾塞那肽最終被禮來公司開發成化學合成藥物，其氨基酸序列與天然純化的Exendin-4完全相同，化學合成的Exendin-4被稱為Exenatide。2009年8月艾塞那肽在我國上市，國內商品名為“百泌達”。百泌達具有全新的降糖機制，用于二甲雙胍、磺酰脲類或二甲雙胍與磺酰脲類聯合應用不能充分控制血糖的2型糖尿病患者，已成為生物醫藥中連續多年銷售額超過十億美元的“重磅炸彈”。艾塞那肽的成功表明了從天然動物肽類活性分子發掘新型2型糖尿病治療藥物的現實可行性。

兩棲類動物皮膚分泌物中含有大量未知功能的活性多肽。蛙科臭蛙屬在整個兩棲類動物的進化中占有重要位置，是蛙科動物從真蛙類向水蛙類進化的重要過渡類群。我們從云南、貴州、四川等地采集到了中國特有的9種臭蛙，通過蛋白質組學和基因組學手段，從這9種臭蛙皮膚里面識別了728條不同的成熟活性肽分子，其中662條為首次報道。這些活性肽被分為97個家族，其中71個家族為首次命名。臭蛙活性肽具有抗菌、抗氧化、免疫調節和促進胰島素釋放等多種生物學活性(Yang X,Lee WH,Zhang Y.Extremely abundant antimicrobial peptides existed in the skins of nine kinds of Chinese odorous frogs.J Proteome Res.2012，11:306-319.)

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種云南臭蛙(Odorrana andersonii)降血糖肽及其制備方法，本發明還提供云南臭蛙降血糖肽在促進胰島β細胞增殖藥物和糖尿病治療中的應用。云南臭蛙降血糖肽具有促進胰島β細胞增殖及胰島素釋放的顯著特點，可明顯降低2型糖尿病模型動物的血糖。云南臭蛙降血糖肽具有結構簡單、人工合成方便的有益特點。可應用于促進胰島β細胞增殖藥物和糖尿病治療藥物的制備。

為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案：

云南臭蛙Odorrana andersonii降血糖肽OA-A1，所述降血糖肽具有下述序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：Leu Val Gly Lys Leu Leu Lys Gly Ala Val Gly Asp Val Cys Gly Leu Leu Pro Ile Cys。

本發明同時提供了云南臭蛙降血糖肽前體及成熟肽的核苷酸序列或其互補序列，所述核苷酸序列編碼本發明的云南臭蛙降血糖肽前體及成熟肽。

本發明的云南臭蛙降血糖肽的制備方法，從云南臭蛙皮膚分泌液中分離得到，純化的云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，即從云南臭蛙皮膚分泌物通過生物化學分離手段，通過分子篩、高壓液相反相C18柱分離純化得到。

本發明的云南臭蛙降血糖肽的制備方法，采用固相化學法合成，合成的云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。所述的固相化學法合成即根據分離純化、活性測定、質譜分子量測定、蛋白質序列測定結合編碼云南臭蛙降血糖肽OA-A1前體蛋白的完整開放閱讀框(ORF)得到天然云南臭蛙降血糖肽的氨基酸序列，用全自動多肽合成儀合成其全序列；通過高壓液相HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化；然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，用全自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。

本發明云南臭蛙降血糖肽也可以使用本領域技術人員熟知的方法，還可以通過遺傳工程的方法制備。

云南臭蛙降血糖肽作為制備促進胰島β細胞增殖及降血糖藥物的應用。

將本發明的云南臭蛙降血糖肽氨基酸序列經蛋白質數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同的降血糖肽前體及成熟肽序列。

因此，云南臭蛙降血糖肽具有顯著的促進胰島β細胞增殖和胰島素釋放的作用，在2型糖尿病動物模型上能顯著降低模型動物的血糖。與其它來源降血糖肽相比，該降血糖肽具有結構簡單、人工合成方便、降血糖作用明確的有益特點。

附圖說明

圖1為本發明的云南臭蛙降血糖肽開放閱讀框核酸序列及其編碼的蛋白質序列，其中斜體加框序列為本發云南臭蛙降血糖肽的成熟序列。

圖2為本發明的云南臭蛙降血糖肽分子篩層析圖譜，圖中橫線部分為具有促進胰島素分泌的活性成分。

圖3為本發明的云南臭蛙降血糖肽的HPLC層析圖譜，圖中箭頭標示部分為最終分離純化得到的云南臭蛙降血糖肽。

圖4為純化得到的云南臭蛙降血糖肽質譜分子量測定圖譜。

圖5為云南臭蛙降血糖肽對小鼠胰島β細胞增殖和胰島素釋放的影響。A)對小鼠胰島β細胞增殖的作用；B)對小鼠胰島β細胞分泌胰島素的作用。

圖6為云南臭蛙降血糖肽對2型糖尿病小鼠血糖及葡萄糖耐受能力(OGTT)的影響。A)對2型糖尿病小鼠血糖的影響；B)對2型糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力(OGTT)的影響。

圖7為云南臭蛙降血糖肽對小鼠胰島細胞的影響。A)正常小鼠對照；B)糖尿病小鼠生理鹽水對照；C)糖尿病小鼠云南臭蛙降血糖肽1nmol/kg；D)糖尿病小鼠云南臭蛙降血糖肽10nmol/kg。I代表胰島細胞。

具體實施方式

實施例1云南臭蛙降血糖肽的分離純化、活性測定及質譜和蛋白質序列測定。

1)云南臭蛙皮膚分泌物的制備：用電理療儀刺激蛙皮膚，蛙產生大量皮膚分泌物，然后用0.1M pH7.4PBS緩沖液(稱取13.97g K₂HPO₄和2.69g KH₂PO₄溶于蒸餾水中，定容到1000ml)沖洗皮膚，并收集沖洗液，合并沖洗液經Christ凍干機(型號Alpha 1-4)冰凍干燥得到云南臭蛙皮膚分泌物。

2)云南臭蛙降血糖肽的分離純化：

2.1分子篩柱層析：將凍干的皮膚分泌物1g用2ml蒸餾水溶解，然后將溶解的分泌物12000轉/分離心10分鐘，去除沉淀后上清液通過Sephedex-G 75分子篩柱(2.6×100cm)進行分離。緩沖液為：25mM Tris-HCl，pH 7.8，含0.1M的NaCl。流速為3ml/10min，每10min收集1管，并使用分光光度計檢測280nm處的吸光值，分子篩柱層析圖譜見圖2。圖2橫線部分標示的組分具有促進胰島素釋放活性。

2.2高壓液相HPLC柱層析：合并圖2具有促進胰島素釋放活性的組分并凍干后，凍干粉用蒸餾水溶解后利用HPLC C₁₈柱(250×4.6mm,kromasil 100-5c18)進行分離純化。A液為水(含0.1％三氟乙酸)，B液為乙腈(含0.1％三氟乙酸)，分離圖譜見圖3，具有促進胰島素釋放活性的組分見圖3箭頭所示。

3)促胰島素釋放活性檢測：小鼠胰腺β細胞株(Beta-Tc-6)培養于含10％胎牛血清(Biological Industries公司)的DMEM高糖培養基(Biological Industries公司)中，將1×10⁵cell/ml密度的細胞按照100μl每孔接種于96孔細胞培養板(Corning公司產品)，37℃，5％CO₂恒溫培養。待細胞貼壁后，棄去含血清的培養基，每孔內加入用無胎牛血清培養基溶解的相應濃度的多肽樣品100μl，空白對照加同體積的無胎牛血清培養基。培養24h后收集培養液，于3000轉/min離心30min,收集上清，按照RayBiotech公司胰島素測定試劑盒方法檢測上清液中的胰島素含量，試劑盒為RayBiotech公司小鼠胰島素測定試劑盒(貨號：ELM-Insulin-1)。

4)云南臭蛙降血糖肽質譜和蛋白質序列測定：

4.1云南臭蛙降血糖肽的質譜測定：上述步驟2.2得到的活性成分按儀器操作說明進行處理，利用德國布魯克公司autoflex^TMspeed進行云南臭蛙降血糖肽的MALDI-TOF質譜分子量測定，測定得到的云南臭蛙降血糖肽的[M+H]⁺分子量為1968.127道爾頓，表示云南臭蛙降血糖肽的實際分子量為1967.127道爾頓，見圖4。云南臭蛙降血糖肽分子內形成二硫鍵的理論分子量為1966.49道爾頓，表明天然純化的云南臭蛙降血糖肽分子內2個Cys形成了分子內二硫鍵。

4.2云南臭蛙降血糖肽的N-端蛋白質序列測定：上述步驟2.2得到的活性成分凍干粉按儀器操作說明進行處理，利用SHIMADZU公司PPSQ-31A全自動蛋白質序列儀進行云南臭蛙降血糖肽的N-端蛋白質序列測定，測定得到的云南臭蛙降血糖肽的N-端12個氨基酸殘基與序列表SEQ ID NO:2所示的前12個氨基酸序列完全相同，均為：Leu Val Gly Lys Leu Leu Lys Gly Ala Val Gly Asp。

云南臭蛙降血糖肽質譜和蛋白質序列測定結果表明其氨基酸序列與本發明序列表SEQ ID NO:2所示的序列完全相同。

實施例2編碼云南臭蛙降血糖肽開放閱讀框的核酸序列確定。

1)云南臭蛙皮膚總RNA的提取。剝離云南臭蛙皮膚，立即放入液氮中。4小時后取出液氮中保存的皮膚30mg于液氮中研磨至粉末狀。加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國Invitrogen公司產品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。然后加入等體積的酚/氯仿溶液，劇烈混勻。室溫放置10分鐘后，4℃,12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清液加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘。4℃,12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為云南臭蛙皮膚總RNA。

2)云南臭蛙皮膚轉錄組測定。制備的云南臭蛙皮膚總RNA干冰運輸至北京諾禾致源科技股份有限公司，采用Illumina Hiseq平臺進行轉錄本拼接、注釋、全方位分析基因表達水平和結構信息，完成云南臭蛙皮膚轉錄組測定。

云南臭蛙降血糖肽開放閱讀框的核酸序列確定。將云南臭蛙降血糖肽N-端12個氨基酸殘基序列與云南臭蛙皮膚轉錄組測定數據進行核酸翻譯后蛋白質序列的氨基酸序列比對，得到云南臭蛙降血糖肽編碼基因，其開放閱讀框(ORF)由216個核苷酸組成，自5’端至3‘端序列為(SEQ ID NO:2)：

云南臭蛙降血糖肽開放閱讀框(ORF)編碼的前體蛋白命名為云南臭蛙降血糖肽前體蛋白OA-A，其氨基酸序列為(SEQ ID NO:3)：

云南臭蛙降血糖肽前體蛋白OA-A的活性天然產物為云南臭蛙降血糖肽OA-A1，所述降血糖肽具有下述序列表中的氨基酸序列SEQ ID NO:1：

實施例3云南臭蛙降血糖肽OA-A1的合成與鑒定。

1、云南臭蛙降血糖肽的制備：

根據云南臭蛙降血糖肽OA-A1的氨基酸序列，利用全自動多肽合成儀進行合成，使得其中的2個Cys形成分子內的一對二硫鍵。通過HPLC反相C₁₈柱層析脫鹽、純化。

2、分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油：間硝基芐醇：二甲亞砜(1:1:1,V:V:V，體積比)為底物，Cs⁺作為轟擊粒子，電流為1μA，發射電壓為25Kv。

3、純化的云南臭蛙降血糖肽OA-A1用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質譜法，用全自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。結果表明所合成云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

4、促胰島素釋放活性檢測結果表明：天然純化和合成的云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有相同的生物學功能。

實施例4云南臭蛙降血糖肽OA-A1對小鼠胰島β細胞增殖和胰島素分泌的作用。

1)細胞增殖活性檢測：利用常規的MTT法進行檢測，小鼠胰島β細胞株(Beta-Tc-6)培養于含10％胎牛血清的培養基中，將1×10⁵cell/ml密度的Bea-Tc-6細胞100μl每孔接種于96孔細胞培養板內，待細胞貼壁后，棄去含血清的培養基，每孔內加入用無胎牛血清培養基溶解的相應濃度的OA-A1樣品100μl，空白對照加同體積的培養基。繼續培養24小時后，每孔內加入MTT(Promega產品)染液10μl，繼續培養4h，可觀察到藍紫色結晶物。吸棄培養液后，每孔加入150μl DMSO(Sigma產品)，振搖10min，Tecan公司酶標儀(型號：M200pro)上測定OD_570nm，結果見圖5A。

2)細胞水平的促胰島素釋放實驗：小鼠胰腺β細胞株(Beta-Tc-6)培養于含10％胎牛血清(Biological Industries公司)的DMEM高糖培養基(Biological Industries公司)中，將1×10⁵cell/ml密度的細胞按照100μl每孔接種于96孔細胞培養板(Corning公司產品)，37℃，5％CO₂恒溫培養。待細胞貼壁后，棄去含血清的培養基，每孔內加入用無胎牛血清培養基溶解的相應濃度的多肽樣品100μl，空白對照加同體積的無胎牛血清培養基。培養24h后收集培養液，于3000轉/min離心30min,收集上清，按照RayBiotech公司胰島素測定試劑盒方法檢測上清液中的胰島素含量，試劑盒為RayBiotech公司小鼠胰島素測定試劑盒(貨號：ELM-Insulin-1)，結果見圖5B。

云南臭蛙降血糖肽OA-A1對小鼠胰島β細胞增殖和胰島素分泌的作用結果見圖5，實驗結果表明：云南臭蛙降血糖肽OA-A1在6.25μg/ml-100μg/ml劑量下能顯著促進小鼠胰島β細胞(Beta-Tc-6)的增殖；并在低濃度下(1nM-10nM)可以顯著促進Beta-Tc-6細胞胰島素的釋放。

實施例5云南臭蛙降血糖肽OA-A1對糖尿病模型小鼠的作用。

1)昆明小鼠2型糖尿病模型的建立:4周齡的雄性昆明小鼠用高脂飼料連續喂養四周，然后空腹過夜，鼠尾取血，監測血糖(歐姆龍血糖儀及配套試紙)，腹腔注鏈脲佐菌素(STZ，Sigma)65mg/kg連續七天，空腹血糖值大于11.1mmol/L即為造模成功的2型糖尿病小鼠。

2)云南臭蛙降血糖肽OA-A1對2型糖尿病小鼠血糖的影響：2型糖尿病小鼠空腹12小時，實驗組皮下注射不同濃度的云南臭蛙降血糖肽OA-A1，陽性對照組皮下注射Exenatide-4(寧波康貝合成，純度>95％)，空白對照皮下注射生理鹽水，分別于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h監測血糖，并繪制血糖曲線，結果見圖6A。

3)云南臭蛙降血糖肽OA-A1對2型糖尿病小鼠葡萄糖耐受能力(OGTT)的影響：2型糖尿病小鼠小鼠空腹12小時，然后實驗組皮下注射不同濃度的云南臭蛙降血糖肽OA-A1，陽性對照組注射Exenatide-4，空白對照注射生理鹽水，注射完30min后，鼠尾取血測血糖，同時灌胃葡萄糖(湖南科倫制藥有限公司)2g/kg，以灌胃葡萄糖起始為0h,隨后分別于0.5h、1h、2h、4h測血糖，并繪制血糖變化曲線，結果見圖6B。

云南臭蛙降血糖肽OA-A1對糖尿病模型小鼠的作用結果表明：云南臭蛙降血糖肽皮下注射后2-6小時能有效降低未進食糖尿病模型小鼠的血糖(圖6A)，葡萄糖耐受能力(OGTT)檢測結果揭示不同濃度(1nmol/kg-1μmol/kg)云南臭蛙降血糖肽皮下注射均能有效降低進食后糖尿病模型小鼠的血糖，在所有的測試時間點云南臭蛙降血糖肽注射組模型動物的血糖值均低于生理鹽水對照組，特別是灌胃葡萄糖后的最初2小時時間段的血糖值(圖6B)。

實施例6云南臭蛙降血糖肽OA-A1對糖尿病模型小鼠胰腺的作用。

云南臭蛙降血糖肽OA-A1對小鼠胰腺胰島細胞的影響:STZ誘導的造模成功2型糖尿病小鼠，隨機分組。藥物組連續21天皮下注射不同濃度的云南臭蛙降血糖肽OA-A1，對照組連續21天皮下注射生理鹽水。第22天動物斷頸處死，快速取出胰腺，并用10％甲醛固定，逐級脫水，石蠟包埋切片，常規伊紅-蘇木精染色，光鏡下拍照并染色，結果見圖7。

云南臭蛙降血糖肽OA-A1對糖尿病模型小鼠胰腺的作用結果揭示：不同劑量云南臭蛙降血糖肽OA-A1(1nmol/kg-10nmol/kg)能顯著促進胰島細胞的增殖。由于胰島細胞主要由：1)胰島β細胞，約占胰島細胞的60％～80％，可分泌胰島素，降低血糖；2)胰島α細胞，約占胰島細胞的24％～40％，分泌胰高血糖素，胰高血糖素作用同胰島素相反，可增高血糖；3)胰島δ細胞，約占胰島細胞總數的6％～15％，分泌生長抑素以及4)胰島PP細胞，約占胰島細胞的1％，分泌胰多肽組成。結合云南臭蛙降血糖肽OA-A1具有顯著的促進胰島β細胞(Beta-Tc-6)增殖的作用(本發明實施例4)，提示云南臭蛙降血糖肽OA-A1可通過促進胰島β細胞的增殖，在整體動物上具有修復受到損傷胰島細胞的作用，使得因STZ選擇性損傷胰腺β-細胞造成2型糖尿病動物模型有顯著的胰島大小恢復正常的趨勢(圖7，C&D)，而2型糖尿病動物模型生理鹽水對照胰島大小(圖7，B)與正常小鼠胰島大小(圖7，A)相比則明顯萎縮。

<110> 中國科學院昆明動物研究所

<120> 云南臭蛙降血糖肽及制備方法及其應用

<160> 10

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 云南臭蛙（Odorrana andersonii）

<400> 1

Leu Val Gly Lys Leu Leu Lys Gly Ala Val Gly Asp Val Cys

1 5 10

Gly Leu Leu Pro Ile Cys

15 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 云南臭蛙（Odorrana andersonii）

<400> 2

atgtttaccc tgaaaaaaag cctgtttctg gtgttttttc tgggc 45

atggtgagcc tgagcctgtg caaacatgaa cgccatgcgg aagaa 90

acccgcgatg atccgaccga agaagaaatt accgcgcgca acgaa 135

gaaaacgtgg aaaaacgcct ggtgggcaaa ctgctgaaag gcgcg 180

gtgggcgatg tgtgcggcct gctgccgatt tgctaa 216

<210> 3

<211> 216

<212> PRT

<213> 云南臭蛙（Odorrana andersonii）

<400> 3

Met Phe Thr Leu Lys Lys Ser Leu Phe Leu Val Phe Phe Leu Gly

-50 -45 -40

Met Val Ser Leu Ser Leu Cys Lys His Glu Arg His Ala Glu Glu

-35 -30 -25

Thr Arg Asp Asp Pro Thr Glu Glu Glu Ile Thr Ala Arg Asn Glu

-20 -15 -10

Glu Asn Val Glu Lys Arg Leu Val Gly Lys Leu Leu Lys Gly Ala

-5 -1 1 5

Val Gly Asp Val Cys Gly Leu Leu Pro Ile Cys

10 15 20