本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：枯草芽孢桿菌，是芽孢桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無(wú)莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常形成皺醭。需氧菌，可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，對(duì)此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機(jī)制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。枯草芽孢桿菌是一種多功能的微生物，目前在有機(jī)肥發(fā)酵或發(fā)酵床制作中有一定的應(yīng)用，但并非所有的枯草芽孢桿菌株在以上領(lǐng)域是有效的。堆肥是利用含有肥料成分的動(dòng)植物遺體和排泄物，加上泥土和礦物質(zhì)混合堆積，在高溫、多濕的條件下，經(jīng)過(guò)發(fā)酵腐熟、微生物分解而制成的一種有機(jī)肥料。自然堆肥發(fā)酵過(guò)程長(zhǎng)，而且在堆積發(fā)酵過(guò)程中，溫度升高，pH升高，容易造成氨氣溢出，總氮減少，以NH3形式揮發(fā)損失的氮含量有時(shí)高達(dá)氮損失總量的92％，需要解決氨氣的揮發(fā)問(wèn)題，減少氮的損失，保護(hù)肥效。我國(guó)是牲畜養(yǎng)殖大國(guó)，畜牧業(yè)發(fā)展的同時(shí)，由于牲畜飼料基數(shù)大，每天因自然死亡和病害死亡的牲畜數(shù)量相當(dāng)龐大。根據(jù)動(dòng)物死亡原因，動(dòng)物尸體的來(lái)源可以分為自然淘汰或自然死亡，病害死亡兩種形式。自然死亡淘汰危害較小，因疫病死亡的動(dòng)物尸體不當(dāng)處理不但對(duì)水源、土壤、大氣污染嚴(yán)重，還容易造成疫病的傳播和蔓延。患有口蹄疫、豬瘟、高致病性禽流感等具有強(qiáng)傳染性的染疫動(dòng)物尸體，甚至嚴(yán)重威脅到人類的生命與健康。傳統(tǒng)的動(dòng)物死尸處理主要有填埋法、消毒法、焚燒法、化制法、生物降解法(發(fā)酵法)。其中，利用生物降解法處理動(dòng)物尸體，但處理尸體的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，處理過(guò)程有惡臭產(chǎn)生。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌的研究、篩選和驗(yàn)證，提供了一種在微好氧環(huán)境中具有較強(qiáng)產(chǎn)酶能力的枯草芽孢桿菌，該枯草芽孢桿菌株制劑和含有其成分的組合物，可有效運(yùn)用于有機(jī)肥發(fā)酵、病死畜禽尸體無(wú)害化處理、生物發(fā)酵床。為本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址為：湖北省武漢市，洪山區(qū)八一路，武漢大學(xué)；分類命名為：枯草芽孢桿菌3號(hào)，BacillusSubtilis3號(hào)；保藏編號(hào)為：CCTCCM2016443，保藏日期為：2016年9月1日的枯草芽孢桿菌。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌在微好氧環(huán)境中有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，所產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶的活力較強(qiáng)。為達(dá)到本發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌在有機(jī)肥發(fā)酵上的應(yīng)用。所述枯草芽孢桿菌在有機(jī)肥的后熟階段中大量繁殖，抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌等有害菌繁殖，同時(shí)可減少有機(jī)肥發(fā)酵過(guò)程中的氨氣排放量，保護(hù)肥效。為達(dá)到本發(fā)明的第三個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于有機(jī)肥發(fā)酵的組合物，所述組合物中含有保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌作為有效成分。所述枯草芽孢桿菌在有機(jī)肥的后熟階段中大量繁殖，有效抑制大腸桿菌等致病菌繁殖。同時(shí)可減少有機(jī)肥發(fā)酵過(guò)程中的氨氣排放量，保護(hù)肥效。為達(dá)到本發(fā)明的第四個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于養(yǎng)殖場(chǎng)糞便污水處理的組合物，所述組合物中含有保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌作為有效成分。保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌可在生物發(fā)酵床中的糞便和尿液發(fā)酵過(guò)程中快速繁殖，可抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌等有害菌繁殖，同時(shí)可減少有機(jī)肥發(fā)酵過(guò)程中的氨氣排放量，保護(hù)肥效。為達(dá)到本發(fā)明的第五個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于畜禽尸體無(wú)害化處理的組合物，所述組合物中含有保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌作為有效成分。保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌可快速分解尸體中的油脂，降低空氣中氨氣濃度，減少環(huán)境污染。同時(shí)所述枯草芽孢桿菌具有快速的繁殖能力，可極大減少致病菌的數(shù)量。為達(dá)到本發(fā)明的第六個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于生物發(fā)酵床的組合物，所述組合物中含有保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌作為有效成分。進(jìn)一步地，用于生物發(fā)酵床的組合物，包括100質(zhì)量份保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌，100質(zhì)量份保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌的和800質(zhì)量份的沸石粉。其中保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為1.0×108CFU/g～5.0×108CFU/g，保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為5.0×109CFU/g～1.0×1010CFU/g。所述保藏編號(hào)為：CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址為：湖北省武漢市，洪山區(qū)八一路，武漢大學(xué)；分類命名為：枯草芽孢桿菌1號(hào)，BacillusSubtilis1號(hào)；保藏日期為：2016年09月1日。保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌可強(qiáng)烈抑制環(huán)境中的有害微生物，特別是大腸桿菌的繁殖，調(diào)整環(huán)境生態(tài)平衡，有益養(yǎng)殖環(huán)境健康。為達(dá)到本發(fā)明的第七個(gè)發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于養(yǎng)殖場(chǎng)除臭抑菌的組合物，所述組合物中含有保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌作為有效成分。保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌可強(qiáng)烈抑制環(huán)境中的有害微生物，特別是大腸桿菌的繁殖，調(diào)整環(huán)境生態(tài)平衡，有益養(yǎng)殖環(huán)境健康。具體實(shí)施方式為詳細(xì)說(shuō)明技術(shù)方案的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合具體實(shí)施例詳予說(shuō)明。保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌為發(fā)明人在禽畜糞便污水中分離篩選出，其能耐高溫(在100℃可存活10分鐘以上)、耐酸(可在pH值為2.5的環(huán)境中存活)、耐膽鹽(在膽鹽中存活率在90％以上)。所述枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和甘露醇，形成酸，不產(chǎn)氣，不分解乳糖，不形成吲哚、硫化氫；產(chǎn)酶有淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶；形成的菌落表面粗糙，不透明，成灰白色，邊緣不擴(kuò)張，呈不規(guī)則略帶狀，菌落整體呈大致圓形；細(xì)胞桿狀，有芽孢，芽孢橢圓形中生或近中生，芽孢囊不明顯膨大，在7％氯化鈉中生長(zhǎng)，V-P測(cè)定陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，能從D-甘露醇產(chǎn)酸，不利用丙酸鹽。該枯草芽孢桿菌具有極強(qiáng)的污水處理能力，降低氨氣排放量，從而減少環(huán)境污染。在分離篩選中，所用的樣品為禽畜糞便污水，所用培養(yǎng)基按1L蒸餾水、0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、1.6％瓊脂、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖的配方配置，并在121℃滅菌20分鐘，pH控制在7.2～7.4。用滅菌后的NaCl溶液，稀釋樣品，得到樣品液。將樣品液涂布在以上培養(yǎng)基后，在37℃、培養(yǎng)48h后，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好、菌落形態(tài)相似且數(shù)目最多的菌落，分離純化直至菌落形態(tài)一致的單菌。將分離出的單菌進(jìn)行淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶的檢測(cè)試驗(yàn)，篩選出可分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶的單菌；對(duì)篩選出的10個(gè)菌株再進(jìn)一步進(jìn)行糞便污水處理試驗(yàn)進(jìn)行篩選，選出糞便污水處理能力最強(qiáng)的菌種，糞便污水的主要污染成分是粗蛋白、粗脂肪和少量淀粉等，且微生物所處的環(huán)境是微好氧環(huán)境，因此篩選菌株的目標(biāo)是在微好氧環(huán)境中的產(chǎn)酶能力，該菌株在微好氧情況下其菌液淀粉酶活力可達(dá)10.3U/ml，蛋白酶活力可達(dá)65.5U/ml，脂肪酶活力可達(dá)739.5U/ml。篩選出的單菌為保藏于CCTCC，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌。篩選出的菌種保存在砂土管、冷凍干燥管中，將處于休眠狀態(tài)。使用時(shí)需要進(jìn)行活化、培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量的純種菌。枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：a、菌種活化：將處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化b、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：將菌種依次經(jīng)過(guò)一級(jí)種子搖床培養(yǎng)、二級(jí)種子罐培養(yǎng)、三級(jí)種子罐培養(yǎng)、發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。所述菌種擴(kuò)大培養(yǎng)用培養(yǎng)基包括如下組分：玉米淀粉、豆粕粉、玉米漿、酵母浸粉、K2HPO4、蛋白胨、MgSO4.7H20；所述培養(yǎng)基的pH值為7.5。實(shí)施例1有機(jī)肥發(fā)酵試驗(yàn)本試驗(yàn)設(shè)2個(gè)對(duì)照組和1個(gè)測(cè)試組。每組按85％豬糞、15％秸稈的重量比例堆制3組有機(jī)肥，對(duì)照組1不添加任何菌種；對(duì)照組2在每立方堆肥原料中添加了保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌100g(活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g)；測(cè)試組在每立方堆肥原料中添加了保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌100g(活菌數(shù)為1.0×1010CFU/g)和保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌100g(活菌數(shù)為1.0×109CFU/g)；3組有機(jī)肥混勻后堆積，每隔一天翻倒一次。對(duì)照組1發(fā)酵時(shí)間為28天，其中第3～12天為高溫期，高溫期溫度在58～70℃。對(duì)照組2發(fā)酵時(shí)間為20天，其中第3～8天為高溫期，高溫期溫度在65～72℃。測(cè)試組發(fā)酵時(shí)間為20天，其中第3～8天為高溫期，高溫期溫度在66～70℃。發(fā)酵堆肥結(jié)束后對(duì)3組的堆肥取樣并測(cè)定養(yǎng)分含量，結(jié)果如下：保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌與保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌合用，肥力得到鞏固。同時(shí)，在堆積發(fā)酵過(guò)程中，添加保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌與對(duì)照組相比可顯著降低翻堆時(shí)的氨臭味。堆積完成后，保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌在有機(jī)肥中檢測(cè)活菌含量達(dá)到1.0×107CFU/g。實(shí)施例2草莓種植試驗(yàn)選用二組大棚草莓，每組草莓種植面積為100平方米，草莓種植時(shí)施用，6個(gè)月后進(jìn)行采收。對(duì)照組施用實(shí)施例1中對(duì)照組2發(fā)酵的有機(jī)肥，試驗(yàn)組施用實(shí)施例1中測(cè)試組發(fā)酵的有機(jī)肥。在播種180天后，對(duì)草莓進(jìn)行采收，對(duì)照組草莓畝產(chǎn)量為430kg，試驗(yàn)組草莓畝產(chǎn)量為508kg，試驗(yàn)組草莓產(chǎn)量高出對(duì)照組18％。試驗(yàn)結(jié)果表明，在有機(jī)肥料堆中添加保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌具有明顯的增加堆肥和土壤肥效的作用。實(shí)施例3用于生物發(fā)酵床的組合物100g保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1.0×1010cfu/g)、100g保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為5.0×108cfu/g)，與800g沸石粉混合均勻，得到1000g生物發(fā)酵床組合物，生產(chǎn)時(shí)按照同比例擴(kuò)大。實(shí)施例4生物發(fā)酵床試驗(yàn)本試驗(yàn)使用生物發(fā)酵床對(duì)固液混合的豬排泄物進(jìn)行發(fā)酵，生物發(fā)酵床的墊料層采用鋸末、稻殼為發(fā)酵基質(zhì)，并添加0.2％發(fā)酵菌組合物，調(diào)水分到50％啟動(dòng)發(fā)酵，發(fā)酵床基質(zhì)厚度為1.5米。其中，對(duì)照組1使用100g保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC1.3358的市售枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1.0×1010cfu/g)與900g沸石粉混合均勻，制成組合物；對(duì)照組2使用100g保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1.0×1010cfu/g)與900g沸石粉混合均勻，制成組合物；測(cè)試組使用實(shí)施例3配置的組合物。測(cè)試組和對(duì)照組每天添加30kg/m3養(yǎng)豬糞污水，持續(xù)添加50天，每天翻動(dòng)墊料1次。到30天時(shí)對(duì)照組1發(fā)酵床溫度為即降到50℃以下，而對(duì)照組2和測(cè)試組50天時(shí)仍能正常運(yùn)行，發(fā)酵溫度為60℃以上；與對(duì)照組2不同的是，測(cè)試組的豬糞分解更徹底，翻堆時(shí)料堆散發(fā)的氨臭味更淡。測(cè)試結(jié)果表明在發(fā)酵床中添加保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌使得豬糞分解更為徹底，使用過(guò)程散發(fā)的氨氣等有害氣體減少。實(shí)施例5畜禽尸體無(wú)害化處理選取30只病死雞和15頭死豬尸體，分為相同質(zhì)量的3份，其中2份為對(duì)照組，1份為測(cè)試組，每份加入由鋸末、稻殼基質(zhì)組成的5立方米墊料中。對(duì)照組1向墊料中添加1000g沸石粉；對(duì)照組2向墊料中添加100g保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1.0×1010cfu/g)和900g的沸石粉；測(cè)試組向墊料中添加100g保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1.0×1010cfu/g)和100g保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為2.0×109cfu/g)和800g沸石粉；堆肥發(fā)酵完成后取樣測(cè)試，測(cè)試組和對(duì)照組2并未檢出沙門氏菌，雞瘟等病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性反應(yīng)；對(duì)照組1檢測(cè)含有沙門氏菌，雞瘟等病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。對(duì)照組1共需26天完成發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生惡臭味；對(duì)照組2需10天完成發(fā)酵，但墊料中存在的油脂只有少量分解，發(fā)酵過(guò)程中有氨臭味和臭氣產(chǎn)生；測(cè)試組需10天完成發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程可分解墊料中存在的油脂，墊料不油膩，發(fā)酵過(guò)程有較淡的氨臭味和臭氣。結(jié)果表明組添加保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌促進(jìn)了病死畜禽的分解，并能有效抑制病原微生物，促進(jìn)了畜禽尸體中油脂的分解。實(shí)施例6育肥豬圈舍噴霧試驗(yàn)在豬場(chǎng)選取3棟豬舍為測(cè)試對(duì)象，豬舍1為對(duì)照組1，豬舍2為對(duì)照組2，豬舍3為測(cè)試組，3棟豬舍面積和空間均相同，豬舍內(nèi)各有1000頭育肥豬。對(duì)照組1用清水噴霧；對(duì)照組2使用100g保藏號(hào)為CCTCCM2016441枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1×1010cfu/g)和900g蒙脫石粉混合均勻，配制成組合物1kg，溶于100L清水制備的對(duì)照溶劑2；測(cè)試組采用100g保藏號(hào)為CCTCCM2016441的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1×1010cfu/g)、100g保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌(活菌數(shù)為1×109cfu/g)，與800g蒙脫石粉混合均勻，溶于100L清水制備的對(duì)照溶劑3。用噴霧器均勻噴灑除臭溶劑在豬舍的地面、墻壁上，5天后進(jìn)行臭氣、氨氣氣體的濃度檢測(cè)，結(jié)果如下：臭味去除率氨氣去除率對(duì)照組100對(duì)照組280％50％測(cè)試組80％50％其中，臭氣濃度采用三點(diǎn)比較式臭袋法(GB/T14675),氨氣采用次氯酸鈉-水楊酸分光光度法(GB/T14679)。試驗(yàn)5天后對(duì)豬舍采食區(qū)、排糞區(qū)和豬欄墻壁進(jìn)行大腸菌群平板計(jì)數(shù)，取樣面積25cm2。結(jié)果如下表：檢測(cè)區(qū)域?qū)φ战M1對(duì)照組2測(cè)試組采食區(qū)1.5×106CFU3.3×105CFU1.6×103CFU排糞區(qū)6.1×106CFU9.7×105CFU3.2×104CFU豬欄墻壁3.9×105CFU5.2×104CFU8.7×102CFU試驗(yàn)結(jié)果表明：除臭抑菌劑中添加保藏號(hào)為CCTCCM2016443的枯草芽孢桿菌，可減少大腸菌群的數(shù)量，強(qiáng)烈抑制環(huán)境中的有害微生物，調(diào)整環(huán)境生態(tài)平衡，有益養(yǎng)殖環(huán)境健康。需要說(shuō)明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語(yǔ)僅僅用來(lái)將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開(kāi)來(lái)，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過(guò)程、方法、物品或者終端設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過(guò)程、方法、物品或者終端設(shè)備所固有的要素。在沒(méi)有更多限制的情況下，由語(yǔ)句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過(guò)程、方法、物品或者終端設(shè)備中還存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超過(guò)”等理解為不包括本數(shù)；“以上”、“以下”、“以內(nèi)”等理解為包括本數(shù)。盡管已經(jīng)對(duì)上述各實(shí)施例進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例做出另外的變更和修改，所以以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利保護(hù)范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3