本發明涉及一株具有抑菌作用的格式乳桿菌及其在治療婦科炎癥中的應用，特別是涉及該格式乳桿菌在制備治療陰道炎的藥物中的應用，屬于生物醫藥
技術領域：
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背景技術：
：婦科炎癥是婦科門診常見的疾病，各個年齡段皆有發生，世界衛生組織(who)發布的數據表明，發展中國家90％以上的婦女患有婦科炎癥，中國女性有70％患有不同程度的生殖道感染，由于醫療資源、經濟條件、文化知識的不平衡，使得農村已婚婦女婦科炎癥發病率更高達95％以上；85％以上的婦女至少患有兩種以上的生殖道疾病。據統計，2004年全國14家，2005年全國62家，2006年全國81家醫院婦科和計劃生育門診5萬多人的流調資料顯示，女性所有疾病中婦科感染疾病(陰道炎、盆腔炎、宮頸炎)占到百分之五十五，由此產生的醫療費用每年高達200多億元。據此估算，中國每年至少有2億女性患生殖道感染及相關疾病，全球數以萬計的婦女一直被這種陰道病困擾著。生殖道感染具有發病率高、復發率高、流行范圍廣的特點，嚴重影響女性的身心健康，表現出白帶異常黃綠色，異味(魚腥味、惡臭味)、瘙癢、灼燒感、下腹部疼痛、性交痛，如果得不到及時正確的治療，會上行感染，引起宮頸炎、子宮內膜炎、盆腔炎等，導致不孕不育、異位妊娠，孕婦導致流產、死胎、死產、先天感染及新生兒感染等，可使艾滋病(aids)和宮頸癌的發生風險增加，嚴重影響女性的身心健康，影響家庭的幸福以及社會的安定。目前，治療陰道感染的措施主要是運用抗生素，抗生素是某些微生物通過酶促反應將初級代謝產物轉變為結構性的次級代謝產物。抗生素不合理的大量使用、濫用，加上缺乏嚴格的監管，導致死亡、耐藥微生物及超級耐藥菌株的產生，抗生素的誤用也置病人于不必要的抗藥性風險中；北京大學第一醫院婦產科廖秦平教授在中國女性陰道微生態研究進展一文中說，陰道內正常菌群是陰道微生態研究的核心內容，早在1892年，dederlein首次發表了關于人類陰道微生態菌群的研究，dederlein認為陰道微生物僅有革蘭氏染色陽性桿菌構成，即乳桿菌。隨著對陰道菌群研究的不斷深入，發現正常狀態下陰道內存在著多種微生物，其中，最重要、數量最多的是乳桿菌，在健康女性的陰道分泌物中分離率高達50％-80％，現在已確定定植于正常陰道內的微生物主要由細菌、真菌、原蟲、病毒、支原體等，這些菌群的存在維持著生態的平衡并不發病。在維持陰道生態平衡中，以產生過氧化氫(h2o2)的乳桿菌為優勢菌，它能夠產生多種抑菌物質，如乳酸、硬脂酸、過氧化氫等酸化陰道環境，降低陰道ph、通過粘附占位保護、刺激免疫系統等方式抑制病原菌的大量繁殖，在維持陰道的生態平衡中起著非常重要的作用。陰道生態平衡一旦被打破或外源病原體侵入，即可導致炎癥發生。在傳統的抗生素治療過程中，抗生素在殺死致病菌的同時也會把陰道中的優勢菌殺死，使陰道處于少菌或無菌狀態，又加上抗生素的使用導致體免疫力下降，一旦遇到病原菌很容易引起感染，二重感染。現在，抗生素的副作用已被醫、藥界科學工作者認可，國家也已逐步限制使用。治療陰道感染除了口服抗生素全身用藥外，還有中醫中藥的辯證施治，中醫通過補氣養血、疏肝理氣、消毒逐瘀、祛濕熱、通經絡等來全身用藥，但是效果緩慢，難以忍受的瘙癢使人坐臥不寧，很難堅持服用中藥來止癢。目前市面上的外用藥也琳瑯滿目，栓劑、膠囊、酸化洗劑、凝膠劑、中藥熏洗、泡騰片等，據調查很多藥物效果不佳，主要是用于抗菌藥物的輔助治療，不能根治，容易反復，特別是外陰陰道假絲酵母菌病(vvc)、復發性念珠陰道病(recurrentvulvovaginalcandidiasis，rvvc)，治療療程長極易反復。綜上，抗生素、中醫中藥及各種外用藥治療陰道感染的效果均不理想，其根源在于沒有恢復陰道微生態的平衡，但由于陰道菌群是一個大的生態系統，若盲目的采用外源微生態制劑進行調節，很容易引起新發菌群的失調。因此，如何通過調節陰道菌群平衡來治療陰道感染仍是目前的難點所在。技術實現要素：針對上述現有技術，本發明的目的是提供一株具有抑菌作用的格式乳桿菌及其在婦科炎癥中的應用。本發明以微生態療法作為指導，從正常健康女性陰道中分離、純化得到一株格式乳桿菌，并與另一株植物乳桿菌一起進行擴大培養發酵，利用其代謝產物與優選的中草藥提取物進行復配，從而開發得到無毒、無副作用、安全高效的治療婦科炎癥的產品。為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：本發明的第一方面，提供一株具有抑菌作用的格式乳桿菌，其為格式乳桿菌(lactobacillusgasseri)dfnxc2-0121，已于2017年3月31日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc)，地址為：中國武漢，武漢大學，其保藏編號為cctccno:m2017162。該菌株是從正常健康女性陰道中分離得到的，菌株的生理生化特征為：菌落形態為乳白色、圓形、片形；革蘭氏染色陽性，無芽孢，硝酸鹽還原反應、h2o2酶試驗陰性，不液化明膠，不產吲哚。本發明的第二方面，提供一種菌劑，其活性成分為上述格式乳桿菌的發酵產物。本發明還提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：發酵上述的格式乳桿菌，得到發酵產物。上述制備方法中，發酵采用的發酵培養基為：mrs培養基。上述制備方法中，發酵的條件為：37℃，靜置培養18-24h。本發明的第三方面，提供上述格式乳桿菌和/或菌劑在制備治療婦科炎癥的產品中的應用。本發明的第四方面，提供一種益生菌代謝物組合物，所述的益生菌代謝物組合物包含：上述的格式乳桿菌的發酵培養物和保藏編號為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發酵培養物。所述格式乳桿菌的發酵培養物中的活菌數為1.0×108-10.0×108cfu/ml；所述保藏編號為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發酵培養物中的活菌數為8.0×108-20.0×108cfu/ml。所述格式乳桿菌的發酵培養物和所述保藏編號為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發酵培養物可以以任意比混合；作為優選的方案，所述格式乳桿菌的發酵培養物和所述保藏編號為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發酵培養物以體積比1：1進行混合。進一步的，上述益生菌代謝物組合物中還可以包含：卡波姆、甘油和薄荷油等組分，并以常規方法制成凝膠劑等各種藥物劑型。上述益生菌代謝物組合物在制備治療婦科炎癥的產品中的應用也是本發明的保護范圍。經試驗發現，本發明的益生菌代謝物組合物對于引起陰道炎的致病菌具有明顯的抑制作用，特別是對于引起陰道炎的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌的抑菌效果更為顯著。上述應用中，所述產品包括：功能性食品、保健品、消毒劑和藥品等多種產品形式。本發明的第五方面，提供一種治療婦科炎癥的中藥益生菌組合物。本發明的治療婦科炎癥的中藥益生菌組合物，由以下重量份的組分制成：益生菌代謝物組合物30-40份、中藥提取物40-55份；所述中藥提取物是由以下重量份的原料藥制成：黃芩32-40份、苦參25-30份、黃柏6-10份、地膚子4-10份、桑葉4-10份。本發明的第六方面，提供上述中藥益生菌組合物的制備方法，步驟如下：(1)益生菌代謝物組合物的制備：分別將本發明的格式乳桿菌和保藏編號為cctccno:m2010150的植物乳桿菌進行活化，將活化后的菌株接種于發酵培養基中進行培養，至格式乳桿菌發酵培養物的菌體濃度達到1.0×108-10.0×108cfu/ml，保藏編號為cctccno:m2010150的植物乳桿菌發酵培養物的菌體濃度達到8.0×108-20.0×108cfu/ml，將格式乳桿菌發酵培養物和保藏編號為cctccm2010150的植物乳桿菌發酵培養物混合，備用；(2)中藥提取物的制備：將黃芩、苦參、黃柏、地膚子和桑葉混合，加水煎煮，煎煮液濃縮至密度為1.10-1.20g/ml，離心，取上清液，備用；(3)將益生菌代謝組合物和中藥提取物混合均勻，即制備得到中藥益生菌組合物。步驟(1)中，所述發酵培養基為：mrs培養基；培養條件為：37℃，靜置培養。步驟(2)中，加水煎煮的具體方法為：將黃芩、苦參、黃柏、地膚子和桑葉混合，置于10倍水中浸泡40-60min，煎煮，水開后繼續煎煮50-60min，過濾得到第一濾液；藥渣用8倍水進行二次煎煮，水開后繼續煎煮30-40min，過濾得到第二濾液與第一濾液混合均勻，通過真空減壓濃縮中藥液，至藥液的密度為1.10-1.20g/ml，3000轉/min離心10min，取上清備用。進一步的，本發明的中藥益生菌組合物還可以結合藥學上接受的輔料制備成各種類型的產品，包括：功能性食品、保健品、消毒劑和藥品(如：洗劑、凝膠劑和栓劑等)。本發明的有益效果：(1)本發明首次從健康女性的陰道中分離、純化得到一株格式乳桿菌，該菌株具有產酸高，產抑菌活性物質、抑菌能力強的特點。菌株發酵后能夠產生酸性物質如乳酸、甲酸及硬脂酸等，這些酸性物質能夠降低生殖道的ph值，抑制病原菌的生長；還能產生過氧化氫，進一步的抑制其他菌和致病微生物的生長。(2)本發明的益生菌代謝物組合物是由本發明的格式乳桿菌和保藏編號為cctccm2010150的植物乳桿菌的發酵培養物復配而成，其中，保藏編號為cctccm2010150的植物乳桿菌記載在專利“一株可用于生物防腐保鮮的乳酸菌及其應用”(cn101914475a)中，該乳酸菌原有的作用是防治果皮褐變，降低果實發病率。本發明將該乳酸菌與格式乳桿菌聯合，發現這兩株菌配合使用具有顯著的協同增效作用，對于引起陰道炎的致病菌具有明顯的抑制作用，特別是對于引起陰道炎的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌的抑菌效果更為顯著。(3)本發明的中藥益生菌制劑是由益生菌代謝物組合物和中藥提取物經科學配伍而成，實現了益生菌和中藥提取物的完美結合，經過體外抑菌實驗驗證，本發明的中藥益生菌制劑安全有效，較目前市場現有的產品單純的益生菌產品或單純的中藥產品具有抑菌譜廣、止癢排毒效果更加明顯。其中：中藥提取物具有明顯的抑制金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作用，及清熱燥濕、消腫止癢的作用；益生菌能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的作用，并能夠酸化陰道的ph，有利于乳桿菌的增值和陰道黏膜修復，中藥和益生菌的結合，即具有中藥的治療作用又具有益生菌的調節陰道微生態平衡的作用，并擴大了抑菌譜，二者具有協同作用。經試驗驗證，效果優于任何一種單一的原料。附圖說明圖1：氨基脫羧酶活性檢測結果；其中，圖1a為組氨酸脫羧酶活性檢測結果，圖1b為酪氨酸脫羧酶活性檢測結果，圖1c為鳥氨酸脫羧酶活性檢測結果，圖1d為賴氨酸脫羧酶活性檢測結果。圖2：優勢乳桿菌的篩選結果。圖3：菌株c2-0121的系統發育樹。圖4：菌株c2-0121發酵生長曲線。圖5：試驗組陰道組織圖片及he染色切片圖；其中，圖5a為陰性對照組，圖5b為染毒組，圖5c為陽性對照組。圖6：造模期間家兔陰道分泌物菌群變化。圖7：陰道分泌物鏡檢圖片；其中，圖7a為正常組陰道分泌物鏡檢圖片，圖7b為灌注抗生素后陰道分泌物鏡檢圖片，圖7c為攻毒之后的鏡檢圖片。圖8：治療7天后家兔的飲食變化趨勢。圖9：治療期間家兔陰道分泌物菌群變化。圖10：家兔各試驗組陰道分泌物鏡檢涂片；其中，圖10a為自然恢復組，圖10b為混合治療組，圖10c為陽性對照組，圖10d為中藥組，圖10e為益生菌組。圖11：造模期間陰道組織切片；其中，圖11a為正常對照組，圖11b為模型組，圖11c為混合治療組，圖11d為中藥組，圖11e為益生菌組，圖11f為陽性對照組。具體實施方式應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬
技術領域：
的普通技術人員通常理解的相同含義。正如
背景技術：
所介紹的，如何通過調節陰道菌群平衡來治療陰道感染仍是目前的難點所在，基于此，本申請提出了一株具有抑菌作用的格式乳桿菌及其在治療陰道感染中的應用。為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本申請的技術方案，以下將結合具體的實施例與對比例詳細說明本申請的技術方案。實施例1：菌株的篩選與鑒定1.試驗材料1.1分離源：健康婦女陰道分泌物1.2培養基：改良mrs培養基(菌株分離時mrs培養基中添加1％的碳酸鈣)，明膠液化培養基(常規的市售產品)。h2o2鑒定mrs培養基：mrs瓊脂培養基中包含0.25mg/ml的四甲基聯苯胺、0.lmg/ml的辣根過氧化物酶。乳桿菌鑒定試驗的培養基：杭州天和微生物試劑有限公司生產的細菌微量生化反應管。1.3實驗菌株：金黃色葡萄球菌atcc6538、大腸桿菌8099購于中國醫學細菌包藏管理中心，變形桿菌及沙門氏菌購于中國農業大學。1.4其他細菌基因組提取試劑盒，藥敏紙片，16srrna引物。2.試驗方法2.1陰道分泌物的采集：泰安市88醫院婦科體檢處醫生協助取樣，用無菌棉拭于陰道后1/3處一次性順時針刮抹，須避免接觸到外陰部和陰道口以防污染。取出后立即放至mrs液體培養基中，并編號記錄。2.2菌株的分離純化及鑒定將各分離源置于無菌水(帶玻璃珠)中震蕩，將樣品充分打散混勻，取振蕩液依次稀釋至10-2，10-3，10-4，10-5，各稀釋度取0.1ml涂平板(mrs+caco3)，2個重復，于37℃培養箱培養。挑取培養基上具有明顯鈣溶圈的菌落于斜面，革蘭氏染色、鏡檢，直至確定為純菌，將純化后的乳桿菌菌株接種到mrs培養基培養后，置4℃冰箱中保存備用。2.2.1產酸性能的測定及傳代穩定性將分離的菌種以2％接種量接種于改良的mrs培養基中，37℃靜置培養，測定發酵液的ph值。菌株連續轉接10天看其穩定性及發酵液的ph值。2.2.2乳桿菌的初步鑒定凡是革蘭氏染色陽性，h2o2酶試驗陰性的菌株可初步確定為乳桿菌。2.2.3乳桿菌屬的鑒定通過生長溫度試驗(15℃，45℃)、運動性試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗對疑似菌株進行屬的鑒定。2.2.4乳桿菌種的鑒定通過碳水化合物發酵產酸試驗進行種的鑒定。各種碳水化合物發酵試驗的培養基均采用細菌微量生化反應管。2.3菌株的生物學性能研究及優勢乳桿菌篩選2.3.1耐酸試驗鹽酸調節mrs培養基使其ph值分別為1.5、2.5、3.5，分別接種培養好的發酵液，1％的接種量，37℃培養。取培養0h及4h的菌液平板計數。計算存活率(％)。2.3.2耐膽鹽試驗在mrs培養基中加入豬膽酸鹽，使其質量分數分別為0.1％、0.2％、0.3％，菌液按2％的接種量接種，37℃培養。取培養0h及4h的菌液平板計數，計算存活率(％)。2.3.3體外抑菌試驗牛津杯法2.3.4抗生素的敏感試驗紙片擴散法2.3.5氨基脫羧酶活性檢測將供試菌種活化后，接種于液體脫羧酶培養基中檢測，空白培養基對照試驗。37℃，培養4d后，觀察顏色變化。2.3.6優勢乳桿菌的篩選應用h2o2鑒定mrs培養基篩選產h2o2的乳桿菌。接種后厭氧37℃，培養72h，之后將培養基暴露于空氣中，產過氧化氫的菌落會于20min內變為藍色。2.416srdna分子鑒定pcr擴增引物：1492r5’-ggttaccttgttacgactt-3’；27f5’-agagttgatcctggctcag-3’。菌落pcr反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25個循環，72℃延伸10min。pcr產物經salt-free純化后，pcr產物測序由博尚生物技術有限公司完成，要求雙向測通。將拼接后的序列結果輸入www.ncbi.nlm.nih.gov/blast，與genbank數據庫中的序列進行同源性比對。2.5生長曲線的測定以2％接種量將菌株接種于改良的mrs培養基中，37℃靜置培養，于0h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、20h、24h、28h、30h、32h、34h、36h、40h、44h、48h、50h取樣測定od值及ph值，以培養時間為橫坐標，相應的od值與ph值為縱坐標，繪制生長曲線，找出最佳培養時間。3.結果與分析3.1分離純化各菌株的形態學特征將多次挑取單菌落、分離純化的菌株進行革蘭氏染色，各株菌的菌落形態皆為乳白色、圓形、片形，通過革蘭氏染色挑選革蘭氏陽性的、菌體形態均為桿狀的菌株，分別標記為，e-1、g5-7、c2-0109、c2-0121、l-7-3、g5-5、g5-3、h5-2、g5-4、g5-3、h5-3。3.2產酸性能、傳代穩定性及發酵液ph值(10代)表1產酸性能的測定結果(測定20h發酵液的ph值)由表1看出：c2-0109及c2-0121與其它菌株比較，其發酵液的ph較低，都小于4，說明其產酸能力較其它菌株強。表2傳代穩定性及發酵液ph值(10代)經連續培養傳代和對比試驗，該菌株的分類學形狀、形態特征等理化形狀未發現可見變化，說明該菌株的形狀穩定遺傳，兩菌株的產酸能力比較穩定。3.2乳桿菌屬的鑒定所分株菌均為革蘭氏染色陽性，無芽孢，硝酸鹽還原反應、h2o2酶試驗陰性，不液化明膠，不產吲哚，其他見表3表3硫化氫實驗結果由表3可以看出：各株菌都不產生硫化氫，綜合各個指標，菌株c2-0121及其他菌株皆為乳桿菌屬。3.3氨基脫羧酶活性檢測在氨基脫羧酶檢測試驗中使用的四種氨基酸為酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸和賴氨酸。經脫氨后分別形成酪胺、組胺、腐胺和尸胺，均是引起中毒癥狀的主要生物胺類物質。根據氨基脫羧酶培養基初步檢測結果可知：所測菌株均不產生鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸和酪氨酸脫羧酶活性，即不產生物胺。即不會引起中毒癥狀。組氨酸脫羧酶活性檢測結果如圖1a所示(圖1a中，從左到右分別為：空白、c2-0109、fng5-5、fng5-4、c2-0121、fng5-3、h5-2)，酪氨酸脫羧酶活性檢測結果如圖1b所示(圖1b中，從左到右：空白、fng5-3、fng5-5、c2-0121、c2-0109、h5-2、fng5-4)，鳥氨酸脫羧酶活性檢測結果如圖1c所示(圖1c中從左到右分別為空白、fng5-5、c2-0109、fng5-3、c2-0109/c2-0121、h5-2、fng5-4)，賴氨酸脫羧酶活性檢測結果如圖1d所示(圖1d中，從左到右分別為空白、c2-0109、c2-0121、fng5-4、fng5-5、c2-0109、fng5-3)。3.4菌株的生物學性能研究及優勢乳桿菌的篩選3.4.1耐酸試驗結果鹽酸調節mrs培養基使其ph值分別為1.5、2.5、3.5，分別接種培養好的發酵液，1％的接種量，37℃培養。取培養0h及4h的菌液平板計數，計算存活率(％)見表4.表4在不同ph條件放置4h的存活率(％)菌株/ph度1.52.53.5c2-0109——108％c2-0121—2.1％93.5％c2-0071—1.0％90.5％g5-7—0.8％88.2％g5-5——91.2％g5-4——90.5％g5-3—1.05％90.5％h5-2—1.32％91.8％h5-3——88.6％l-3-2——78％由表4看出：各株菌在ph1.5環境中都不耐受，菌株c2-0121在ph3.5環境中耐受，存活率為93.5％，除了低于菌株c2-0109外，高于其他菌株。3.4.2耐膽鹽試驗在mrs培養基中加入豬膽酸鹽，使其質量分數分別為0.1％、0.2％、0.3％，，菌液按2％的接種量接種，37℃培養0h及4h的菌液平板計數，計算存活率(％)，其結果見表5。表5在不同濃度膽鹽條件放置4h的存活率(％)由表5看出：菌株c2-0109、c2-0121、c2-0071fng-3在膽鹽濃度為0.1％的溶液中4h后能夠存活85％以上，其中c2-0109、c2-0121耐膽鹽的能力較強，在0.1％的膽鹽溶液中37℃培養4h其存活率大于95％，而其他各菌株存活率皆小于90％。3.4.3體外抑菌試驗用牛津杯法分別對大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌atcc6538、沙門氏菌及變形桿菌的抑菌性能檢測，并且與實驗室中保存的格式乳桿菌c2-0071抑菌比較好的菌株進行比較，結果見表6。表6各株乳桿菌的抑菌性結果(單位：mm)由表6可以看出：各菌株對致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌都有一定的抑菌性，而菌株c2-0109、c2-0121、c2-0071對致病菌的抑菌性較好，其中以菌株c2-0121最好，比其他幾株菌的抑菌性都好，比實驗室保存的格式乳桿菌c2-0071的抑菌圈都大，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌的抑菌性分別大14.3％、59.6％、21.7％、7.4％。在下面的實驗中挑選性能較好的兩株菌c2-0109、c2-0121進行經一步的實驗。3.4.4抗生素的敏感試驗將性能較好的菌株c2-0109、c2-0121進行抗生素的敏感實驗，結果見表7.表7兩菌株對9種抗生素的敏感試驗(抑菌圈直徑：mm)由表7可以看出：菌株c2-0121對頭孢曲松、頭孢氨芐及磺胺異惡咗不敏感，對其他多種抗生素敏感。3.4.5生化鑒定試驗結果通過碳水化合物發酵產酸試驗進行種的鑒定。各種碳水化合物發酵試驗的培養基均采用細菌微量生化反應管，發酵結果見表8。表8糖發酵實驗結果試驗結果表明，c2-0121與格式乳桿菌的生化特性相一致，依據伯杰氏手冊，初步鑒定為格式乳桿菌。3.4.6優勢乳桿菌的篩選通過優勢乳桿菌的篩選，其中c2-0121菌落變為藍色，結果見圖2，說明能夠產過氧化氫。在正常陰道菌群中，乳桿菌占優勢，乳桿菌對維持陰道內的正常的菌群起著重要的作用，一方面，乳桿菌能夠利用糖原產生乳酸，降低生殖道的ph值，抑制病原菌的生長；另外，乳桿菌還能夠產生過氧化氫，細菌素及類細菌素和生物表面活性劑等抑制其他菌和致病微生物的生長，從而維持陰道微生態的平衡；通過以上實驗看出：菌株c2-0121產過氧化氫、產酸能力強而且抑菌性比其他菌株都好，因此，這株菌用于女性的生殖道的感染有非常好的作用，對維護陰道微生態平衡有促進作用。3.5分子鑒定結果為確定c2-0121是乳酸菌的種類，進一步做了分子生物學鑒定，將菌株c2-0121進行液體發酵，提取dna，pcr擴增，16srdna的序列測定如seqidno.1所示，然后同源性比對，構建系統發育樹，見圖3。通過對菌株c2-0121的16srdna的序列測定和同源性比對，發現它與lactobacillushominiscrbip24.179fr681902菌種的16srdna有高達99％的同源性，結合形態，將其鑒定為格式乳桿菌(lactobacillusgasseri)，命名為格式乳桿菌(lactobacillusgasseri)dfnxc2-0121，并于2017年3月31日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc)，地址為：中國武漢，武漢大學，其保藏編號為cctccno:m2017162。3.6菌株發酵生長曲線的繪制菌株接種后在不同時間段分別取樣，檢測在波長600nm處測定其od值及ph，以培養時間為橫坐標，相應的od值與ph值為縱坐標，繪制生長曲線見圖4。由圖4看出：菌株c2-0121在8h左右進入對數生長期，此時菌株生長最快，此時ph下降也最快由6.5下降到5.3，至16h時，od600達到最大，此時ph為3.99，通過平板計數得知此時活菌數達13.5×108cfu/ml，16h后進入穩定期。實施例2：益生菌代謝物組合物的制備(1)乳酸菌種子液的制備：取出菌種保藏管，用乳酸菌斜面固體培養基分別劃線進行復蘇，37℃培養24-36h。挑取斜面培養基上的菌落結晶紫染色鏡檢，為短桿菌或長桿菌。挑取菌落接種100ml乳酸菌培養基中，在37℃培養箱中培養24h。種子采用2％-5％的接種量，接種至3l大三角瓶中，37℃培養24h-36h，檢測其菌液濃度，植物乳桿菌(保藏編號為cctccm2010150)的菌含量超過10億/毫升和菌株c2-0121的菌含量超過2億/毫升，即可作為乳桿菌液體菌種接種。(2)將活化后的菌株接種于mrs培養基中進行培養，發酵培養至格式乳桿菌發酵培養物的菌體濃度達到1.0×108-10.0×108cfu/ml，保藏編號為cctccm2010150的植物乳桿菌發酵培養物的菌體濃度達到8.0×108-20.0×108cfu/ml。所述的mrs培養基：葡萄糖2.0％、檸檬酸銨0.2％、乙酸鈉0.5％、磷酸氫二鉀0.5％、硫酸錳0.02％、硫酸鎂0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐溫800.1％，調節ph至6.0；固體培養基加1.5％瓊脂粉。培養基滅菌條件為：0.10-0.15mpa，121℃滅菌20min。(3)分別計數，將步驟(2)的發酵培養物用生理鹽水稀釋至其活菌數皆為1×107cfu/ml；取同體積的菌液混合備用。實施例3：中藥提取物的制備將黃芩35份、苦參30份、黃柏8份、地膚子6份、桑葉8份混合，將混合物置于10倍水中浸泡40-60min，煎煮，水開后繼續煎煮50-60min，過濾得到第一濾液；藥渣用8倍水進行二次煎煮，水開后繼續煎煮30—40min，過濾得到第二濾液與第一濾液混合均勻，通過真空減壓旋轉蒸發儀濃縮中藥液，至中藥液的密度為1.1g/ml-1.2g/ml，靜止過夜，3000轉離心10min，收集上清液，備用。實施例4：中藥益生菌制劑的制備將實施例2制備的益生菌代謝物組合物40份和實施例3制備的中藥提取物45份混合均勻，即制備得到中藥益生菌制劑。實施例5：治療陰道炎的凝膠劑的制備稱取卡波姆9422.5g，量取實施例4制備的中藥益生菌制劑850ml，加入到盛有卡波姆的容器中，過夜，攪勻，直至細膩均勻無顆粒，用質量濃度為10％的氫氧化鈉調節ph值至5.0，加入甘油5g及薄荷油0.2g，加水至1000g攪勻，即得。應用例1：益生菌的體外抑菌實驗1.試驗材料：1.1供試菌株：植物乳桿菌blcc2-0001(保藏編號為cctccm2010150)、格式乳桿菌dfnxc2-0121(實施例1篩選得到)。1.2指示菌：白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062，各指示菌均為市售產品。2.方法與結果：牛津杯法取菌株植物乳桿菌blcc2-0001、格式乳桿菌dfnxc2-0121的發酵液10000rpm離心10min，取上清液，進行抑菌性試驗；選取的指示菌分別為白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062。試驗結果見表9。表9菌株對各指示菌的抑菌圈的直徑(單位：mm)注：-表示沒有明顯的抑菌圈。試驗結果表明：菌株blcc2-0001、dfnxc2-0121對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌都有較強的抑菌性，對干酪乳桿菌1.0062、嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109無抑菌性。因此，此菌株是選擇性抑制致病菌大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌較強的菌株。應用例2：中藥提取物的體外抑菌實驗1.試驗材料：1.1供試中藥：實施例3制備的中藥提取物1.2指示菌：白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062，各指示菌均為市售產品。2.方法與結果2.1方法：牛津杯法2.2結果：中藥提取物對各指示菌的抑菌性結果，見表10.表10：中藥提取物對各指示菌的抑菌性結果由實驗結果看出：中藥對金黃色葡萄球菌及白色念珠菌具有很強的抑菌性，而對大腸桿菌及沙門殺菌則無抑菌性，對乳酸菌同樣也沒有抑菌性。應用例3：中藥益生菌制劑的體外抑菌實驗1.試驗材料：1.1供試中藥：實施例4制備的中藥益生菌制劑1.2指示菌：白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062，各指示菌均為市售產品。2.方法與結果2.1方法：牛津杯法2.2結果：中藥益生菌制劑對各指示菌的抑菌性結果，見表11.表11中藥益生菌制劑對各株菌的抑菌結果由表11可以看出：中藥和乳桿菌發酵液混合后對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌、沙門氏菌都有很強的抑菌性，但是對乳桿菌仍然沒有抑菌性，說明混合后擴大了抑菌譜，二者具有協同性，抑菌效果更加廣譜。應用例4：家兔陰道刺激試驗(依據2002消毒產品檢驗技術規范-陰道黏膜刺激試驗)1.試驗動物：選用健康、初成年的非動情期的雌性白色家兔，比利時兔，體重2.5kg。試驗前檢查動物陰道口有無分泌物、充血、水腫和其它損傷情況。如有炎癥或(和)損傷，應棄用。2.試驗分組：分為染毒組、陰性對照組和陽性對照組，每組3只。其中，染毒組采用本發明實施例5制備的凝膠劑，陰性對照組灌入生理鹽水，陽性對照組灌入市售產品吉林一正藥業集團生物科技有限公司的抑菌凝膠3.試驗操作方法3.1將長度為8cm左右的鈍頭軟管與5ml的注射器連接。注射器和導管注滿受試液備用。每只動物各準備一套。3.2黏膜刺激試驗的染毒方法：將動物仰面固定，將導管用受試液或對照液濕潤后輕柔地插入陰道(4cm-5cm)，并用注射器緩慢注入2ml受試液，抽出導管，完成染毒。陰性對照組動物用生理鹽水作同樣處理。3.3多次陰道黏膜刺激試驗的染毒方法：按上述3.2染毒方法，每隔24h重復染毒一次，連續5d。陰性對照組動物用生理鹽水作同樣處理，陽性對照用市售產品吉林一正藥業集團生物科技有限公司的抑菌凝膠3.4受試液注入后可能有溢出，可用消毒棉或軟紙拭去。3.5末次染毒后24h，采用氣栓法處死動物，剖腹取出完整的陰道，縱向切開，肉眼觀察是否有充血、水腫等表現，供病理取材時參考。然后將陰道放入10％福爾馬林溶液中固定24h以上，選取陰道的兩端和中央3個部位的組織制片，he染色后，進行組織病理學檢查。4結果評價組織病理學檢查結果，按表12定對陰道黏膜的刺激反應進行評分。將試驗組3只動物3個部位的刺激反應積分相加后，再除以觀察總數(動物數×3)，得出試驗組陰道黏膜刺激反應的平均積分，最大記分為16(見表12)。對照組評分方法同上。將試驗組平均積分減去對照組平均積分得出刺激指數后，按表13進行刺激強度分級。4.1陰道黏膜刺激反應評分標準見表12。表12陰道黏膜刺激反應評分標準刺激反應積分＝a+b+c+d.表13陰道黏膜刺激強度分級4.2各試驗組陰道組織圖片及he染色切片圖陰性對照組陰道上皮完整，無細胞壞死、脫落及炎癥細胞浸潤，染毒組及陽性對照組也是同樣的，結果見圖5a-圖5c。4.3各試驗組陰道黏膜刺激得分結果見表14。表14各試驗組陰道黏膜刺激指數試驗結果表明：試驗干預組的陰道黏膜刺激指數＜1，根據陰道黏膜刺激強度分級標準可知，試驗組對家兔陰道黏膜無刺激性，由陰道組織圖片及he染色切片也可以看出，陰道無充血、水腫及炎性細胞，陰道黏膜完整、無細胞壞死、脫落現象。應用例5：益生菌和中藥組合物對家兔陰道炎的抑制作用研究1.材料與方法1.1實驗材料1.1.1試驗動物健康雌性家兔，體重為3.0kg，以生產2次以上，由道朗鎮魚池村龐性養殖戶提供，共30只。1.1.2藥物及試劑鹽酸林可霉素(購于泰安市同仁堂大藥房)，白色念珠菌cmcc(f)98001(購于中國藥品生物制品鑒定所)，一正抑菌凝膠(購于泰安市萬寧大藥房)武漢新生態生物工程有限公司生產1.1.3培養基選擇性培養基：emb，lbs，tsa，cq、mrs，均購于青島海波生物技術有限公司。1.2實驗方法將家兔先分為兩組，a組正常對照組5只，b組模型組25只，預飼3天后，隨機取陰道分泌物鏡檢并計數大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、乳酸菌數。a組外陰部消毒后用18號大鼠灌胃器注入生理鹽水1ml，灌注11天后，氣拴法殺死家兔，取陰道組織10％甲醛固定制片，he染色后，進行病理學檢查評分、分級。b組灌注鹽酸林可霉素注射液1ml，每天1次，灌注5天，恢復1天，然后用白色念珠菌活菌數1.5×107cfu/ml灌注0.5ml，每天1次，4天后，隨機取陰道分泌物鏡檢并計數大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、白色念珠菌和乳酸菌數，確定造模成功后，模型組家兔氣拴法殺死家兔5只，取陰道組織10％甲醛固定制片，he染色后，進行病理學檢查并參照表評分。然后家兔重新分組，分為5組，b1組為自然恢復組，b2組為混合(中藥和益生菌)治療組，b3組為中藥組，b4組為益生菌組、b5組陽性對照組，每組5只，開始治療。b1組灌注不含任何藥物的空白凝膠1.5g/只，b2組灌注實施例5的凝膠劑1.5g/只，b3組為實施例3的中藥液1.5ml，b4實施例2的益生菌液1.5ml，b5組一正抑菌凝膠1.5g/只，治療期間每天稱取飼料重量，治療6天后，全部取陰道分泌物鏡檢并計數大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、白色念珠菌和乳酸菌數，7天后氣拴法殺死家兔，取陰道組織10％甲醛固定制片，he染色后，進行病理學檢查并參照表4、表5評分、分級。2結果與分析2.1試驗期間各試驗組家兔的體征變化2.1.1造模期間家兔的體征變化預飼5天后，模型組家兔被毛潔白光滑，飲食正常，精神良好。用抗生素之后，精神沉郁，食量下降，匍匐狀，輕微拉稀，3只死亡，白色念珠菌攻毒后，精神沉郁，不思飲食，匍匐狀，拉稀，有1只死亡。2.1.2造模期間家兔陰道分泌物菌群變化結果見圖6。由圖6可以看出：家兔正常情況下，陰道中有大量的菌株，其中以乳酸桿菌為主要優，數量較多；在使用抗生素之后，各種菌都大量減少，而攻毒之后，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌等致病菌繁殖增多，為主要菌株，而乳酸桿菌相應的減少，這說明家兔陰道炎的模型的建立成功。圖7a為正常組陰道分泌物鏡檢圖片，可見有大量的桿菌，圖7b為灌注抗生素后陰道分泌物鏡檢圖片，菌群數量很少；圖7c為攻毒之后的鏡檢圖片，有大量的白色念珠菌、滴蟲、球菌等致病菌，這也說明模型建立成功。2.2治療后各項指標2.2.1造模后治療期間各組家兔的體征變化：結果見表15。表15造模后治療期間各組家兔的體征變化2.2.2治療7天后家兔的飲食變化趨勢結果見圖8。試驗結果表明：第一天治療組飲食量最多、自然恢復組最少，但是，隨著時間的延長自然恢復組飲食量是逐漸增多的，混合治療組、中藥組、益生菌組及對照組飲食量一直處于較高水平，混合治療組最高，說明混合治療組對家兔的腸胃刺激最小。2.2.3治療期間家兔陰道分泌物菌群變化結果見圖9，由圖9看出：正常組的乳酸菌最高，為優勢菌；混合治療組治療后乳酸菌大幅度的升高為優勢菌，跟正常組的相比無顯著性差異，益生菌組、中藥組、陽性對照組與自然恢復組比較其乳桿菌數量有所增多，但是與混合組比較都少于混合組的乳桿菌數量，而自然恢復組乳酸菌數量最少，仍處于弱勢，因此，炎癥未消失，由此看出，混合治療組(中藥與益生菌)治療后，乳酸菌數量大幅度的提高，處于優勢地位，恢復至正常水平，說明組合物對患有陰道炎的實驗家兔具有非常顯著的治療作用。2.3家兔各試驗組陰道分泌物鏡檢涂片結果見圖10a-圖10e。自然恢復組(圖10a)可見有極少量桿菌，而混合治療組(圖10b)有大量的桿菌，陽性對照組(圖10c)有大量的桿菌但也有白色念珠菌，中藥組(圖10d)菌群數量較少，益生菌組(圖10e)雖有乳桿菌但是致病菌也較多，特別是白色念珠菌，各組比較，說明實施例4制備的中藥益生菌制劑對混合感染引起陰道炎治療具有很好的抑制病原菌作用的。2.4造模期間陰道組織切片，見圖11a至圖11f。由圖11a可以看出，正常對照組陰道皺褶清晰完整，粘膜的上皮細胞無病變及壞死現象；模型組(圖11b)陰道皺褶淺，粘膜上層組織不完整，肌層潰爛，萎縮，細胞脫落、壞死；混合治療組(圖11c)陰道皺褶深而多，粘膜的上層黏膜細胞比較完整清晰，無脫落、壞死現象。中藥組(圖11d)、益生菌組(圖11e)、陽性對照組(圖11f)都有清晰可見的陰道皺褶、黏膜上層完整，無潰瘍面、上皮脫落現象，說明混合治療組、中藥組、益生菌組及陽性對照組對陰道炎的實驗家兔都有治療作用，而混合治療組與中藥組、益生菌組比較，陰道壁皺褶多而深，黏膜上層完整，說明益生菌與中藥組合物比單一的中藥或者益生菌對陰道炎的實驗家兔治療效果顯著。混合治療組既包括中藥的清熱解毒、抑菌，對金黃色葡萄球菌及白色念珠菌的進行抑制，添加益生菌，既能補充乳桿菌定值于陰道產生抑菌素、有機酸及過氧化氫等抑制病原菌的生長，能夠促進陰道微生態的平衡，快速修復陰道的黏膜，因此，中藥與益生菌組合物對陰道炎的實驗家兔有很好的治療作用。3結論3.1用鹽酸林可霉素注射液1ml，每天灌注1次，共5天，恢復1天，然后用白色念珠菌活菌數1.5×107cfu/ml灌注0.5ml，每天1次，灌注4天，通過鏡檢陰道分泌物、陰道黏膜刺激指數可以看出模型成立。3.2用實施例4制備的中藥益生菌制劑灌注，1.5g/只，治療6天后，通過鏡檢陰道分泌物中的菌群、查看陰道病變情況、以及陰道組織切片都可以看出：模型組陰道嚴重充血，上皮細胞不完整，黏膜層出現病變、脫落等現象，而用實施例4制備的中藥益生菌制劑灌注的治療組、陽性對照組與正常組的陰道上皮組織完整，黏膜光滑，無病變等現象；總結以上實驗說明：益生菌代謝物與中藥組合物安全無刺激，不影響其飲食；對引起陰道炎的致病菌有很好的抑制作用，促進患有陰道炎的實驗家兔陰道中的菌群恢復，并且能夠快速的修復受損的陰道黏膜。應用例6：臨床實驗(一)陰道炎及宮頸炎1材料1.1受試樣品：將實施例5制備的凝膠劑，為棕褐色或深褐色的凝膠。推薦用量3g/人、天，推注，6天為一個小療程。1.2受試人群受試者納入標準：陰道炎(細菌性陰道炎、霉菌性陰道炎及滴蟲性陰道炎)160例，宮頸炎160例，年齡18歲～65歲，均有性生活史。非月經期；臨床癥狀符合臨床上細菌性陰道炎的診斷標準，患者排除有重大精神疾病的患者，1w內禁性生活；試驗前1w內未使用其藥及陰道清潔劑，或使用其他藥物無效。1.3治療方法對照組80例患者采取甲硝唑400mg，每天2次，口服7天，觀察組80例患者采用實施例的凝膠劑，每天1次，每次3g，患者清洗外陰后，每天晚上推入3g凝膠，兩組患者連續用藥1周后觀察臨床效果。1.4觀察指標療效分為三個指標，a治愈：患者的臨床癥狀消失，檢測結果為陰性；b有效：患者的臨床癥狀基本得到改善，檢測結果為陰性；c無效：患者的臨床癥狀沒有改善或者病情加重，在治療3個月后有復發的現象。總有效率＝(治愈+有效)/總病例×100％1.5統計學方法統計軟件用spss16.0處理數據，p<0.05說明具有顯著性差異。2結果2.1兩組患者治療效果綜合比較觀察80例患者在治療后，治療總有效率明顯高于對照組，對比兩組患者的治療總有效率，具有顯著性差異，p<0.05有統計學意義，細菌性陰道炎詳見下表16，宮頸炎見表17表16陰道炎兩組患者藥物治療效果比較分析(％)兩組有效率(治愈+好轉)經統計學比較。p<0.05，差異有統計學意義表17宮頸炎兩組患者藥物治療效果比較分析(％)組別例數治愈有效無效總有效率觀察組8060(75％)14(17.5％)6(7.5％)92.5％對照組8052(65％)16(20％)12(15％)88％p--<0.05<0.052.2兩組患者的復發率比較觀察組80例患者經過治療后，臨床復發率顯著低于對照組，兩組患者復發率差異顯著p<0.05，有統計學意義。表18兩組陰道炎患者復發率比較(％)組別例數復發人數復發率觀察組8022.5％對照組801215％p-<0.05<0.05表19兩組宮頸炎患者復發率比較(％)組別例數復發人數復發率觀察組8045％對照組801518.8％p-<0.05<0.05由表18、表19可以看出：益生菌與中藥組合物在治療不同病原菌引起的陰道炎及宮頸炎方面與甲硝唑比較，治愈率高，復發率低。(二)附件炎、盆腔炎及盆腔積液附件炎8例：小腹墜脹疼痛，左側按壓痛，伴有白帶增多異味、腰疼、月經失調等癥狀。使用實施例5制成的凝膠一個療程后，排除很多的灰白色及膿性分泌物，疼痛減輕，異味消失；使用發明的產品2周后，排出帶有黑褐色血塊，疼痛消失。復檢6例痊愈。盆腔炎并帶有盆腔積液12例：醫院檢查患有盆腔炎并伴有盆腔積液，下腹部疼痛并發燒、腹部按壓痛，腰骶部酸痛，使用實施例5制成的凝膠2天后，開始排出膿性分泌物及水樣物，6天后，分泌物增加，不再發燒，使用12天后，腰痛減輕，次月再次使用12天后，疼痛消失，確診痊愈9例。3.結論在本次實驗中，用中藥來清熱排毒，消炎祛濕，止癢祛除異味等作用，而用益生菌在抑制致病菌的同時，并能夠定植于生殖道中繁殖生長，其代謝產物乳酸和過氧化氫等物質能保持生殖道正常酸性環境，抑制并消除致病菌的生長。從而調節并恢復生殖道的微生態平衡。因此，對婦科炎癥方面的疾病有很好的治療效果，并且復發率低。以上所述僅為本申請的優選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領域的技術人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護范圍之內。sequencelisting<110>泰安大凡神農制藥有限公司<120>具有抑菌作用的格式乳桿菌與中藥復方及其在治療婦科炎癥中的應用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1442<212>dna<213>菌株c2-0121<400>1gcaagtcgagcgagcttgcctagatgaatttggtgcttgcaccaaatgaaactagataca60agcgagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccaagagactgggataacac120ctggaaacagatgctaataccggataacaacactagacgcatgtctagagtttaaaagat180ggttctgctatcactcttggatggacctgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggc240ttaccaaggcaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgaga300cacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtct360gatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttggtagtg420aagaaagatagaggtagtaactggcctttatttgacggtaattacttagaaagtcacggc480taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgg540gcgtaaagcgagtgcaggcggttcaataagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgga600gaattgcatcagaaactgttgaacttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgta660gcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgc720aactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtcca780tgccgtaaacgatgagtgctaagtgttgggaggtttccgcctctcagtgctgcagctaac840gcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgg900gggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacca960ggtcttgacatccagtgcaaacctaagagattaggtgttcccttcggggacgctgagaca1020ggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgag1080cgcaacccttgtcattagttgccatcattaagttgggcactctaatgagactgccggtga1140caaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctaca1200cacgtgctacaatggacggtacaacgagaagcgaacctgcgaaggcaagcggatctctga1260aagccgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagctggaatcgctag1320taatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtc1380acaccatgagagtctgtaacacccaaagccggtgggataacctttataggagtcagccgt1440ct1442當前第1頁12