發明領域本發明涉及用于生產l-草銨膦(“l-ga”或“lga”)或其磷酸酯的酶促催化方法。該方法包括其中活化的l-高絲氨酸ha與選自甲基次膦酸和甲基次膦酸的酯的底物s反應的步驟。硫化氫解酶e1用于酶促催化。本發明在l-草銨膦及其磷酸酯的酶促生產中可使新的底物可用。發明背景有機磷光體化合物，即包含碳-磷光體鍵的化學試劑，在植物保護領域被廣泛應用作除草劑。試劑如除草劑草甘膦和草銨膦以及生長調節劑草甘二膦用于此目的(例如由g.rev.environ.containm.toxicol.1994，138，73-145描述)。p-甲基次膦酸的酯(例如p-甲基次膦酸丁酯；“mpbe”；cas-no：6172-80-1)在合成非選擇性除草劑草銨膦時具有作為構建要素的關鍵作用。這些酯可通過兩個基本合成途徑(在k.haack，chem.unserer?zeit?2003，37，128-138的文章的第130頁，圖3a和3b中概述)獲得：a.用ch3mgcl與二乙基氯亞磷酸酯[clp(oc2h5)2]反應提供甲基二乙氧基膦[h3cp(oc2h5)2；“demp”；cas-no.15715-41-0]，其部分水解，得到相應的甲基次膦酸乙酯(mpee；cas-nr：16391-07-4)。b.或者，甲烷可以在500℃下與磷光體三氯化物反應，以得到甲基二氯膦烷h3cpcl2。然后可以在醇中將后者溶劑分解以得到相應的甲基次膦酸酯。p-甲基次膦酸的酯區域選擇性地(regioselectively)加入碳-碳雙鍵。此性質用于合成用于形成第二磷光體-碳鍵的草銨膦。例如，h3cph(o)or(r＝烷基)在加成反應中與1-氰基烯丙基乙酸酯反應以提供中間體。隨后乙酸取代基與氨的交換以及次膦酸部分的酯基和氰基的水解得到草銨膦。丙烯酸酯是更便宜的替代起始材料。它可以與p-甲基次膦酸的酯反應生成3-[烷氧基(甲基)氧膦基]丙酸烷基酯。該二酯與草酸二乙酯的克萊森反應、水解和脫羧提供相應的α-酮酸，其可以被還原胺化以得到草銨膦。本領域中(例如在wo?1999/009039?a1，ep?0508296?a1中)也描述了l-草銨膦的這些合成路線和進一步的合成路線。wo?2020/145513?a1和wo?2020/145514?a1描述了合成l-草銨膦的化學途徑。在此途徑中，高絲氨酸衍生物如o-乙酰高絲氨酸或o-琥珀酰高絲氨酸用作起始材料，并且l-草銨膦通過包括內酯化和鹵化的一系列反應獲得。wo?2020/145627?a1描述了類似的途徑，其中在鹵化期間獲得溴衍生物。cn?106083922?a公開的途徑類似，但從l-甲硫氨酸開始。ep?2402453?a2描述了通過將甲基硫醇和二甲基硫化物的混合物與o-乙酰高絲氨酸或o-琥珀酰高絲氨酸進行酶促反應來生產甲硫氨酸的酶促方法。cn108516991?a描述了另一合成l-草銨膦的合成途徑，從l-高絲氨酸的共沸脫水開始，以得到l-3,6-雙(2-鹵乙基)-2,5-二酮哌嗪，隨后進行甲基亞膦酸鹽二酯基團的引入和水解。所有草銨膦合成路線的一般缺點是所獲得的草銨膦是外消旋混合物。然而，由于d-對映體沒有除草活性，l-草銨膦是經濟上感興趣的對映體。對于l-草銨膦的對映選擇性合成，在本領域中描述了酶促途徑。wo?2017/151573?a1公開了由d-草銨膦進行l-草銨膦的兩步酶促合成。在第一步驟中，將d-草銨膦氧化脫氨以得到2-氧代-4-[羥基(甲基)膦酰基]丁酸(“ppo”)，隨后將ppo特異性氨基化為l-草銨膦作為第二步驟。第一步通過d-氨基酸氧化酶的催化進行，第二步通過轉氨酶催化。wo?2020/051188?a1公開了將外消旋草銨膦轉化成l-草銨膦對映體的類似方法。另外，公開了其中在用胺供體對ppo的氨基化期間形成的α-酮酸或酮副產物通過酮戊二酸脫羧酶轉化以進一步將平衡轉移至l-草銨膦的步驟。wo?2019/018406?a1公開了從包含l-草銨膦和谷氨酸酯的混合物中純化l-草銨膦的方法。通過谷氨酰胺酰基-肽基細胞環轉移酶將谷氨酸酯酶促轉化為焦谷氨酸酯，然后通過離子交換從所得混合物中純化l-草銨膦。本發明的目的是提供一種進一步的酶促過程，用于產生高對映體過量的l-草銨膦。特別地，此類方法應允許使用迄今未用于l-草銨膦的酶促合成的新底物。發明概述本發明通過提供用于從之前沒有在l-草銨膦的酶促生產中使用的底物生產l-草銨膦的方法來解決上述問題。特別地，本發明提供了使用酶促催化途徑由甲基次膦酸及其酯生產l-草銨膦或l-草銨膦的磷酸酯的方法。因此，這些磷光體化合物在l-草銨膦的生產中用作替代的底物，從而允許其中不依賴當前用于l-草銨膦生產的已知底物的生產靈活性。特別地，此目的由本發明實現，其涉及用于產生l-草銨膦或其磷酸酯的酶促催化方法，包括步驟(a)，其中活化的l-高絲氨酸ha與底物s反應以產生這些化合物。因此，本發明涉及用于生產l-草銨膦或其磷酸酯的酶促催化方法，包括步驟(a)，其中活化的l-高絲氨酸ha與以下結構(i)的底物s反應以產生以下結構(iii)的化合物，其中r1選自氫、烷基、烯基、炔基、羥烷基、芳基，并且其中活化的l-高絲氨酸ha具有以下結構(ii)：其中r2是具有1-15個碳原子的烴基，其任選地包含至少一個選自oh、cooh、nh的官能基團。并且其中步驟(a)中的反應由硫化氫解酶e1酶促催化，其中所述硫化氫解酶e1的多肽序列選自seq?id?no:5和seq?id?no:5的變體、seqid?no:6和seq?id?no:6的變體、seq?id?no:7和seq?id?no:7的變體、seq?id?no:8和seq?idno:8的變體。發明詳述令人驚訝地發現，某些含磷光體的化合物，即甲基次膦酸和甲基次膦酸的酯，可以在酶促催化下與活化的l-高絲氨酸反應，從而打開了l-草銨膦和l-草銨膦磷酸酯的新合成途徑。這尤其令人驚訝，因為類似的化合物如demp不在與活化的l-高絲氨酸的類似反應中進行反應。因此，本發明涉及用于生產l-草銨膦或其磷酸酯的酶促催化方法，其包括步驟(a)，其中活化的l-高絲氨酸ha與以下結構(i)的底物s反應以產生以下結構(iii)的化合物，其中r1選自氫、烷基、烯基、炔基、羥烷基、芳基。根據本發明的表示為“l-草銨膦或其磷酸酯”的化合物由結構(iii)表示。當結構(iii)中r1＝氫時，化合物為l-ga。當結構(iii)中r1選自烷基、烯基、炔基、羥基烷基、芳基時，化合物是l-ga的磷酸酯。活化的l-高絲氨酸ha具有以下結構(ii)：其中r2是具有1-15個碳原子的烴基，其任選地包含至少一個選自oh、cooh、nh的官能基團。步驟(a)中的反應由酶催化，所述酶為硫化氫解酶e1。4.1底物s根據本發明的底物s選自甲基次膦酸和甲基次膦酸的酯。底物s具有結構(i)。在結構(i)中，r1選自氫、烷基、烯基、炔基、羥烷基、芳基，優選選自氫、烷基，優選選自氫、具有1至6個、優選1至4個碳原子的烷基，更優選選自氫、甲基、乙基、異丙基、正丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基，甚至更優選選自氫、甲基、乙基、正丁基，甚至更優選選自氫、甲基、正丁基，優選選自甲基、正丁基。最優選地，r1是正丁基。當結構(i)中r1＝氫時，化合物是甲基次膦酸(也稱為“p-甲基次膦酸”，“pmea”)。當結構(i)中r1選自烷基、烯基、炔基、羥基烷基、芳基時，化合物是甲基次膦酸的酯。結構(i)和結構(iii)中的r1相同。4.2活化的l-高絲氨酸ha根據本發明的反應中的另一反應伴侶是活化的l-高絲氨酸ha。本領域技術人員知曉活化的l-高絲氨酸ha(有時也表示為“l-甲硫氨酸前體”，例如wo?2008/013432a1)，其特別是指o-酰基l-高絲氨酸。4.2.1活化的l-高絲氨酸ha活化的l-高絲氨酸具有以下化學結構(ii)：其中r2是具有1-15個碳原子的烴基，其任選地包含至少一個選自oh、cooh、nh的官能基團。更優選地，活化的l-高絲氨酸選自o-乙酰-l-高絲氨酸[結構(ii-a)]、o-琥珀酰-l-高絲氨酸[結構(ii-b)]、o-丙酰-l-高絲氨酸[結構(ii-c)]、o-乙酰乙酰-l-高絲氨酸[結構(ii-d)]、o-香豆酰-l-高絲氨酸[結構(ii-e)]、o-丙二酰-l-高絲氨酸[結構(ii-f)]、o-羥甲基戊二酰-l-高絲氨酸[結構(ii-g)]和o-庚二酰-l-高絲氨酸[結構(ii-h)]。甚至更優選地，活化的l-高絲氨酸選自o-乙酰-l-高絲氨酸[結構(ii-a)]、o-琥珀酰-l-高絲氨酸[結構(ii-b)]。最優選地，活化的l-高絲氨酸是o-乙酰-l-高絲氨酸[結構(ii-a)]。4.2.2活化的l-高絲氨酸ha的化學合成用于本發明的方法的活化的l-高絲氨酸ha可以通過本領域技術人員已知的有機化學合成途徑獲得。例如，m.flavin，c.slaughter，biochemistry?1965，4，1370-1375中描述了o-琥珀酰高絲氨酸的合成。nagai，m.flavin，methods?in?enzymology，metabolism?ofamino?acids?and?amines?part?b?1971，17(part?b)，423-424中描述了o-乙酰-高絲氨酸的合成。例如通過m.d.armstrong，j.am.chem.soc.1948，70，1756-1759描述了潛在前體的化學合成。4.2.3活化的l-高絲氨酸ha的生物技術合成替代地并且優選地，本發明中使用的活化的l-高絲氨酸ha通過生物技術手段獲得。例如，這在wo?2008/013432?a1中或通過h.kase，k.nakayama，agr.bioi.chem.1974，38，2021-2030描述。產生活化的l-高絲氨酸ha的菌株優選選自埃希氏桿菌屬(escherichia?sp.)、歐文氏菌屬(erwinia?sp.)、沙雷氏菌屬(serratia?sp.)、普羅威登斯菌屬(provideia?sp.)、棒狀桿菌屬(corynebacterium?sp.)、假單胞菌屬(pseudomonas?sp.)、鉤端螺旋體屬(leptospira?sp.)、沙門氏菌屬(salmonella?sp.)、短桿菌屬(brevibacterium?sp.)、生絲單胞菌屬(hypomononassp.)、色桿菌屬(chromobacterium?sp.)、諾卡氏菌屬(norcardiasp.)、真菌(其特別是酵母)。本領域中(例如在us?3,598,701、us?6,303,348?b1、ep?0994190?a2、ep?1149911a2、wo?2004/067757a1中)也描述了用于獲得l-高絲氨酸的生物技術過程。4.3酶根據本發明的方法是酶促催化的。術語“酶”意指完全或大部分由或多或少特異性催化或促進一種或多種化學或生化反應的蛋白質或多肽組成的物質。根據本發明的任何方面使用的任何酶可為分離的酶。特別地，根據本發明的任何方面使用的酶可在活性狀態和在所有輔因子、底物、輔助和/或活化多肽或其活性必需的因子的存在下使用。特別地，這也意味著術語“硫化氫解酶”，特別是“o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶”或“o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶”包括各自的酶與它們的功能所必需的所有輔因子的組合。特別地，此輔因子是吡哆醛5’-磷酸(“plp”)。“多肽”是被稱為氨基酸的化學結構單元的鏈，其通過被稱為肽鍵的化學鍵連接在一起。包括酶的蛋白質或多肽可為“天然的”或“野生型”，這意味著其天然地發生或具有天然蛋白質的氨基酸序列。這些術語有時可互換使用。多肽可糖基化或可不糖基化。根據本發明的任何方面使用的酶可為重組的。如本文所用的術語“重組的”是指分子或由這樣的分子編碼的特別是多肽或核酸不天然存在但為基因工程化的結果，或指包含重組分子的細胞。例如，如果核酸分子包含在功能上與編碼催化活性多肽的序列連接的啟動子并且該啟動子已被工程化使得催化活性多肽相對于包含原始未改變的核酸分子的相應野生型細胞中的多肽水平過表達，則核酸分子是重組的。作為進一步的實例，如果多肽與天然存在的多肽序列相同但是經工程化以含有一個或多個將其與天然存在的任何多肽序列區分開的點突變，則多肽是重組的。如本文所使用的術語“過表達”意為編碼或表達的相應多肽以比在為增加表達而進行的遺傳修飾不存在的相同條件下在細胞中(例如在相應的野生型細胞中)通常發現的更高的水平或更高的活性表達。如本文所用的術語“分離的”意為感興趣的酶與其天然存在于其中的細胞相比被富集。酶可以通過sds聚丙烯酰胺電泳和/或活性測定來富集。例如，如通過用考馬斯藍染料染色后的聚丙烯酰胺凝膠的目測來判斷的，感興趣的酶可構成在制劑中存在的所有多肽的5％、10％、20％、50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。4.3.1酶e1根據本發明的方法的步驟(a)通過硫化氫解酶e1酶促催化。本領域技術人員已知硫化氫解酶作為催化以下反應<1a>、<1b>中至少一種的酶：<1a>o-乙酰-l-高絲氨酸+甲硫醇→l-甲硫氨酸+乙酸鹽。<1b>o-琥珀酰-l-高絲氨酸+甲硫醇→l-甲硫氨酸+琥珀酸鹽。對于反應<1a>比對于反應<1b>具有更高的催化活性的硫化氫解酶可表示為“o-乙酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶”。對于反應<1b>比對于反應<1a>具有更高的催化活性的硫化氫解酶可表示為“o-琥珀酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶”。根據本發明的方法的步驟(a)由硫化氫解酶e1(其甚至更優選o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶或o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶，最優選o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶)催化。可在根據本發明的方法的步驟(a)中使用的硫化氫解酶來源于迷蹤菌屬(elusimicrobia?sp.)，特別是迷蹤細菌(elusimicrobia?bacterium)；生絲單胞菌屬；分枝桿菌屬(myobacterium?sp.)；假諾卡氏菌屬(pseudonocardia?sp.)，特別是嗜熱假諾卡氏菌(pseudonocardia?thermophila)。可用于根據本發明的方法中的硫化氫解酶可為歸類在ec類ec?2.5.149中的o-乙酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶或歸類在ec類ec?2.5.1中的o-琥珀酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶。這些酶是甲硫氨酸生物合成的直接硫酰化(sulfurylation)途徑的部分并且是pmp依賴性的。它們例如由m.p.ferla和w.m.patrick，microbiology?2014，160，1571-1584描述。wo?02/18613a1、wo?2007/024933?a2、ep?2657345?a1、ep?2657250?a2、wo?2015/165746a1和wo?2008/013432?a1公開了根據本發明的具有o-乙酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶和o-琥珀酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶活性的酶的實例。適用于根據本發明的方法的o-乙酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶可源自迷蹤菌屬特別是迷蹤細菌；分枝桿菌屬；假諾卡氏菌屬特別是嗜熱假諾卡氏菌。適用于根據本發明的方法的o-琥珀酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶可源自生絲單胞菌屬。相應的序列可來源于數據庫，如braunschweig酶數據庫(brenda，germany，在www.benda-enzyme.org/index.php下可獲得)、國家生物技術信息中心(ncbi，在https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/下可獲得)或kyoto基因和基因組百科全書(kegg，japan，在www.https://www.genome.jp/keg/下可獲得)。下表1給出了可在根據本發明的方法的步驟(a)中使用的硫化氫解酶的優選實例。編碼硫化氫解酶的基因對于o-乙酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶(“ahs”)表示為“met43”、“met46”和“met52”，并且對于o-琥珀酰-l-高絲氨酸硫化氫解酶(“shs”)表示為“met17”。表1 菌株 基因名稱 ncbi登錄號 多肽的seq?id?no: 生絲單胞菌屬 met17 wp_011647651.1 seq?id?no:5 分枝桿菌屬 met43 mcb0926676.1 seq?id?no:6 嗜熱假諾卡氏菌 met46 wp_073459782.1 seq?id?no:7 迷蹤細菌 met52 mbi4397379.1 seq?id?no:8 步驟(a)至少由硫化氫解酶e1催化，其中硫化氫解酶水解酶e1的多肽序列選自seqid?no:5和seq?id?no:5的變體、seq?id?no:6和seq?id?no:6的變體、seq?id?no:7和seq?idno:7的變體、seq?id?no:8和seq?id?no:8的變體。在本發明的方法的甚至更優選的實施方式中，步驟(a)中的反應由選自seq?idno:6和seq?id?no:6的變體、seq?id?no:7和seq?id?no:7的變體、seq?id?no:8和seq?idno:8的變體的o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶以及選自seq?id?no:5和seq?id?no:5的變體的o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶的硫化氫解酶e1催化。下文進一步解釋了術語“變體”(項4.3.3.1)。在本技術的上下文中，應理解其意指與相應多肽序列具有至少80％序列相同性的多肽序列。4.3.2用于獲得酶的方法可用于根據本發明的方法中的酶可通過本領域技術人員已知的方法合成。一種途徑是在微生物如大腸桿菌(escherichia?coli)(＝“e.coli”)、釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)、畢赤酵母(pichia?pastoris)等中表達酶，并將整個細胞作為全細胞生物催化劑添加至反應。另一途徑是表達酶、裂解微生物并添加細胞裂解物。又另一途徑是純化或部分純化來自裂解物的酶并將純的或部分純的酶添加到反應中。如果反應需要多種酶，則酶可在一種或數種微生物中表達，包括在單個微生物內表達所有酶。例如，本領域技術人員可通過在細胞中表達、特別是過表達(在下文中，“表達，特別是過表達”縮寫為(過)表達”)本發明的酶及其后續分離來獲得這些酶，例如在de10031999a1中所述。例如，采用脂質體質粒來增加相應基因的表達。在此類質粒中，待(過)表達或編碼待(過)表達的多肽或酶的核酸分子可置于位于基因上游的強誘導型啟動子如lac啟動子的控制下。啟動子是由約40-50個堿基對組成的dna序列，其構成rna聚合酶全酶的結合位點和轉錄起始點(m.pátek，j.hollátko，t.busche，j.kalinowski，j.needera，microbial?biotechnology?2013，6，103-117)，由此受控制的多核苷酸或基因的表達強度可能受到影響。“功能性連接”通過啟動子與基因的順序布置獲得，這導致基因的轉錄。用于增加表達的此類啟動子的合適的強啟動子或方法從文獻(例如s.liser&h.margalit，nucleic?acid?research?1993，21，1507-1516；m.patho和j.nesvera?inh.yukawa?and?m?inui(eds.)，corynebacterium?gluticum，microbiology?monograph?23，springer?verlag?berlin?heidelberg?2013，51-88；b.j.eikmanns，e.kleinertz，w.liebl，h.sahm，gene1991，102，93-98)中已知。例如，可通過就增加功能上連接至天然啟動子的基因的表達而言在已知共有序列的方向上改變啟動子序列來優化這些啟動子(m.pátek，b.j.eigkmann，j.pátek，h.saham，microbiology?1996，142，1297-1309；m.pátek，j.hollátko，t.busche，j.kalinowski，j.needera，microbial?biotechnology?2013，6，103-117)。組成型啟動子也適用于(過)表達，其中編碼酶活性的基因在啟動子例如葡萄糖依賴性deo啟動子的控制下連續表達。化學誘導的啟動子也是合適的，如tac、lac或trp。用于誘導啟動子的最廣泛的系統是大腸桿菌的lac操縱子。在此情況下，使用乳糖或異丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作為誘導劑。此外，使用阿拉伯糖(例如pbad系統)或鼠李糖(例如大腸桿菌krx)的系統作為誘導劑是常見的。用于物理誘導的系統是例如基于來自takara或lambda?pl的大腸桿菌cspa啟動子的溫度誘導的冷休克啟動子系統以及滲透誘導型啟動子例如osmb的(例如wo95/25785a1)。合適的質粒或載體原則上是本領域技術人員出于此目的可用的所有實施方式。本領域的狀態描述了可用于此目的的標準質粒，例如以pet-3a或pet-28a(+)(可商購自novagen)為典型的載體pet系統。進一步的質粒和載體可例如從公司novagen、promega、newengland?biolabs、clontech或gibco?brl的手冊中取得。進一步優選的質粒和載體可以在glover，d.m.(1985)dna?cloning:a?practical?approach，vol.i-iii，irl?press?ltd.，oxford；rodriguez，r.l.and?denhardt，d.t(eds)(1988)vectors:asurvey?of?molecularcloning?vectors?and?their?uses，179-204，butterworth，stoneham；goeddel，d.v.(1990)systems?for?heterologous?gene?expression，methods?enzymol.185，3-7；sambrook，j.；fritsch，e.f.and?maniatis，t.(1989)，molecular?cloning:alaboratorymanual，2nd?ed.，cold?spring?harbor?laboratory?press，new?york中找到。然后將含有待擴增的基因的質粒載體例如通過綴合或轉化轉變為期望的菌株。共軛方法例如由a.j.kalinowski，a.pühler，applied?and?environmentalmicrobiology1994，60，756-759描述。用于轉化的方法例如在g.thierbach，a.schwarzer，a.pühler，applied?microbiology?and?biotechnology?1988，29，356-362，l.k.dunican&e.shivnan，bio/technology?1989，7，1067-1070and?a.tauch，o.kirchner，l.wehmeier，j.kalinowski，a.pühler，fems?microbiology?letters?1994，123，343-347中描述。在通過“交叉(cross-over)”事件進行同源重組后，所得菌株含有至少兩個有關基因的拷貝。可通過以本領域技術人員已知的方式破壞含有期望的活性的細胞來分離期望的酶，例如借助于球磨機、法式壓濾壺(french?press)或超聲波粉碎機，隨后通過在13000rpm和4℃下離心10分鐘來分離細胞、細胞碎片和破碎輔助物例如玻璃珠。然后可使用所得無細胞粗提取物進行產物的酶測定和隨后的lc-esi-ms檢測。或者，酶可通過色譜方法(如鎳-次氮基三乙酸親合色譜法、鏈霉抗生物素親和層析、凝膠過濾色譜或離子交換色譜)以本領域技術人員已知的方式富集，或純化為同質。核酸或多肽是否(過)表達可通過定量pcr反應(在核酸分子的情況下)、sds聚丙烯酰胺電泳、蛋白質印跡或比較活性測定(在多肽的情況下)來確定。遺傳修飾可涉及在選定和/或指定的培養條件下導致酶活性和/或選擇性的改變的轉錄、翻譯和/或翻譯后修飾。4.3.3定義4.3.3.1“變體”在本發明的上下文中，關于多肽序列的術語“變體”是指與參考序列的相同性程度為至少80％，更優選至少81％，更優選至少82％，更優選至少83％，更優選至少84％，更優選至少85％，更優選至少86％，更優選至少87％，更優選至少88％，更優選至少89％，更優選至少90％，更優選至少91％，更優選至少92％，更優選至少93％，更優選至少94％，更優選至少95％，更優選至少96％，更優選至少97％，更優選至少98％，更優選至少99％的多肽序列。在又進一步的特定實施方式中，相同性程度為至少98.0％，更優選至少98.2％，更優選至少98.4％，更優選至少98.6％，更優選至少98.8％，更優選至少99.0％，更優選至少99.1％，更優選至少99.2％，更優選至少99.3％，更優選至少99.4％，更優選至少99.5％，更優選至少99.6％，更優選至少99.7％，更優選至少99.8％，或至少更優選至少99.9％。不言而喻，某些多肽序列的“變體”與多肽序列不相同。此類變體可通過引入缺失、插入、取代或其組合(特別是氨基酸序列)，以及包含此類大分子或其變體的融合來制備。對給定多肽序列的氨基酸殘基的修飾對給定多肽的性質和功能沒有顯著改變是本領域技術人員已知的。由此例如許多氨基酸經常可以彼此交換而沒有問題；此類合適的氨基酸取代的實例是：ala至ser；arg至lys；asn至gln或his；asp至glu；cys至ser；gln至asn；glu至asp；gly至pro；his至asn或gln；ile至leu或val；leu至met或val；lys至arg或gln或glu；met至leu或ile；phe至met或leu或tyr；ser至thr；thr至ser；trp至tyr；tyr至trp或phe；val至ile或leu。還已知修飾，特別是在例如以氨基酸插入或缺失形式在多肽的n-或c-末端進行的修飾經常不對多肽的功能施加顯著影響。與此一致，本發明的根據seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7和seq?id?no:8中任一項的變體分別具有包含對于功能(例如蛋白質的催化活性或蛋白質的折疊或結構)必需的相應序列的氨基酸的多肽序列。其它氨基酸可被刪除、被插入取代或替換，或者必需氨基酸以保守方式被替換為酶(特別是硫化氫解酶)的活性被保留的效果。4.3.3.2“序列相同性”本領域技術人員知曉多種計算機程序可用于計算兩個核苷酸或氨基酸序列之間的相似性或相同性。用于確定相同性的優選方法最初生成待比較序列之間的最大程度對齊。用于確定相同性的計算機程序包括但不限于gcg程序包，包括-gap[j.]deveyy等，nucleic?acid?research?1984,12，第387頁，geneticscomputer?group?university?of?wisconsin，medicine(wi)]，和-blastp、blastn和fasta(s.altschul等，journal?of?molecular?biology?1990，215，403-410)。blast程序可以從national?center?for?biotechnology?information(ncbi)和從其它來源(blast?handbook，s.altschul等，ncbi?nlm?nih?beethesdand22894；s.altschul等，上方)獲得。例如，兩個氨基酸序列之間的百分比相同性可以通過由s.b.needleman和c.d.wunsch，j.mol.biol.1970，48，443-453開發的算法確定，其已使用blosum62矩陣或pam250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的間隙權重和1、2、3、4、5或6的長度整合到gcg軟件包中的gap程序中。本領域技術人員將認識到使用不同的參數將導致稍微不同的結果，但兩個氨基酸序列之間的百分比相同性總體上不會顯著不同。blosum62矩陣通常用于應用默認設置(間隙權重：12，長度權重：1)。在本發明的上下文中，根據上述算法的80％的序列相同性意味著80％的同源性。同樣結論適用于更高的相同性。最優選地，在本發明的上下文中，序列之間的相同性程度通過程序“needle”使用置換矩陣blosum62、10的缺口打開懲罰和0.5的缺口延伸懲罰來確定。needle程序實現了s.b.needleman和c.d.wunsch，j.mol.biol.1970，48，443-453中描述的全局對齊算法。根據本發明使用的置換矩陣是blosum62，間隙打開懲罰是10，并且間隙擴展懲罰是0.5。在本發明的上下文中使用的優選版本是由f.madeira，y.m.park，j.lee，n.buso，t.gur，n.madhusoodanan，p.basutkar，a.r.n.tivey，s.c.potter，r.d.finn，nucleic?acidsresearch?2019，47，w636–w641，web?server?issue呈現的(優選版本在2021年3月31日通過https://www.ebio.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/在線可訪問)。在一個特定實施方式中，通過以下確定多肽的氨基酸序列與參考多肽序列的相同性百分比：i)使用needle程序以blosum62置換矩陣、缺口打開懲罰10和缺口延伸懲罰0.5將兩個氨基酸序列對齊；ii)將對齊中的精確匹配的數目進行計數；iii)將精確匹配的數目除以兩個氨基酸序列中最長的長度，以及iv)將iii)的除法的結果轉換成百分比。4.3.3.3“鑒定特定活性變體的優選測定”4.3.3.3.1測定a在本發明的上下文中，seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7和seq?id?no:8中任一項的尤其優選的多肽變體可分別被本領域技術人員識別為在以下測定(“測定a”)中顯示活性的那些。測定a通過以下步驟進行：a1)首先，通過以下步驟a1.1)、a1.2)和a1.3)如下確定待測試的變體的活性：a1.1)制備含有磷酸鹽緩沖液(0.1m，ph?7.5)、3mm?o-乙酰l-高絲氨酸-hcl、10μm吡哆醛5’-磷酸一水合物和1.0nmol待測試的多肽的反應溶液990μl并加熱至50℃。a1.2)通過加入10μl?200mm丁基-p-甲基次膦酸鹽(mpbe，cas#6172-80-1)溶液開始反應。反應溶液中mpbe的濃度為2mm。a1.3)加入mpbe后，反應在50℃下進行120分鐘。然后，通過添加10μl?1％甲酸鹽溶液和在冰上冷卻停止反應。a2)然后通過以下步驟a2.1)、a2.2)和a2.3)如下進行空白測試：a2.1)制備含有磷酸鹽緩沖液(0.1m，ph?7.5)、3mm?o-乙酰l-高絲氨酸-hcl、10μm吡哆醛5’-磷酸一水合物的反應溶液990μl并加熱至50℃。a2.2)通過加入10μl?200mm丁基-p-甲基次膦酸鹽(mpbe，cas#6172-80-1)溶液開始反應。a2.3)加入mpbe后，反應在50℃下進行120分鐘。然后，通過添加10μl?1％甲酸鹽溶液和在冰上冷卻停止反應。a3)最終，優選通過在項5.7下描述的lc-ms分析測定并比較分別在a1.3)和a2.3)的反應溶液中獲得的l-ga的丁基-磷酸酯(即根據式(iii)的化合物，r1＝正丁基)的量(以摩爾計)。a4)如果針對a1.3)確定的l-ga的丁基-磷酸酯的量大于針對a2.3)確定的丁基-磷酸酯的量，則待測試的變體在測定a中顯示活性。如果針對a1.3)確定的l-ga的丁基-磷酸酯的量與針對a2.3)確定的丁基-磷酸酯的量相同或小于針對a2.3)確定的丁基-磷酸酯的量，則待測試的變體在測定a中不顯示活性。步驟a1.3)和a2.3)中優選的甲酸鹽溶液是甲酸銨或甲酸鈉溶液。或者，也可以通過加入甲醇(優選1ml甲醇)停止步驟a1.3)和a2.3)中的反應。4.3.3.3.2測定b在進一步的測定(“測定b”)中，可確定seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7和seq?id?no:8中任一種的多肽變體分別相對于所述多肽的活性。測定b通過以下步驟進行：b1)首先，“標準”多肽標準(即選自seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7和seqid?no:8的一個多肽序列)的活性通過以下步驟b1.1)、b1.2)和b1.3)如下確定：b1.1)制備含有磷酸鹽緩沖液(0.1m，ph?7.5)、3mm?o-乙酰l-高絲氨酸-hcl、10μm吡哆醛5’-磷酸一水合物和1.0nmol待測試的“標準”多肽的反應溶液990μl并加熱至50℃。b1.2)通過加入10μl?200mm丁基-p-甲基次膦酸鹽(mpbe，cas#6172-80-1)溶液開始反應。反應溶液中mpbe的濃度為2mm。b1.3)加入mpbe后，反應在50℃下進行120分鐘。然后，通過添加10μl?1％甲酸鹽溶液和在冰上冷卻停止反應。b2)然后，用變體重復步驟b1.1)、b1.2)和b1.3)：b2.1)制備含有磷酸鹽緩沖液(0.1m，ph?7.5)、3mm?o-乙酰l-高絲氨酸-hcl、10μm吡哆醛5’-磷酸單水合物和1.0nmol的待測試的“變體”多肽的反應溶液990μl并加熱至50℃。b2.2)通過加入10μl?200mm丁基-p-甲基次膦酸鹽(mpbe，cas#6172-80-1)溶液開始反應。反應溶液中mpbe的濃度為2mm。b2.3)加入mpbe后，反應在50℃下進行120分鐘。然后，通過添加10μl?1％甲酸鹽溶液和在冰上冷卻停止反應。b3)最終，優選通過在項5.7下描述的lc-ms分析測定并比較在b1.3)和b2.3)的反應溶液中獲得的l-ga的丁基-磷酸酯(即根據式(iii)的化合物，r1＝正丁基)的量。b4)然后，將b2.3)中獲得的l-ga的丁基-磷酸酯的量(以摩爾計)除以b1.3)中獲得的l-ga的丁基-磷酸酯的量(以摩爾計)得到比率。然后將該比率乘以因子100，給出變體多肽相對于“標準”多肽的相對活性的百分比。步驟b1.3)和b2.3)中優選的甲酸鹽溶液是甲酸銨或甲酸鈉溶液。或者，也可以通過加入甲醇(優選1ml甲醇)停止步驟b1.3)和b2.3)中的反應。4.3.3.4“優選變體”4.3.3.4.1“seq?id?no:5的變體”特別地，seq?id?no:5的變體是與多肽序列seq?id?no:5具有≥80％，更優選≥85％，更優選≥90％，更優選≥91％，更優選≥92％，更優選≥93％，更優選≥94％，更優選≥95％，更優選≥96％，更優選≥97％，更優選≥98％，更優選≥99％，更優選≥99.9％的序列相同性的多肽。優選的seq?id?no:5的變體在項4.3.3.3.1下的測定a中顯示活性。甚至更優選地，seq?id?no:5的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:5的活性的至少1％，優選至少10％，更優選至少20％，更優選至少30％，更優選至少40％，更優選至少50％，更優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選至少99％。甚至更優選地，seq?id?no:5的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:5的活性的1至1000％的范圍內，優選地5至500％的范圍內，更優選地10至400％的范圍內，更優選地40至200％的范圍內，更優選地50至150％的范圍內，更優選地60至140％的范圍內，更優選地70％至130％的范圍內，更優選地80％至120％的范圍內，更優選地90％至110％的范圍內，更優選地100％。4.3.3.4.2“seq?id?no:6的變體”特別地，seq?id?no:6的變體是與多肽序列seq?id?no:6具有≥80％，更優選≥85％，更優選≥90％，更優選≥91％，更優選≥92％，更優選≥93％，更優選≥94％，更優選≥95％，更優選≥96％，更優選≥97％，更優選≥98％，更優選≥99％，更優選≥99.9％的序列相同性的多肽。優選的seq?id?no:6的變體在項4.3.3.3.1下的測定a中顯示活性。甚至更優選地，seq?id?no:6的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:6的活性的至少1％，優選至少10％，更優選至少20％，更優選至少30％，更優選至少40％，更優選至少50％，更優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選至少99％。甚至更優選地，seq?id?no:6的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:6的活性的1至1000％的范圍內，優選地5至500％的范圍內，更優選地10至400％的范圍內，更優選地40至200％的范圍內，更優選地50至150％的范圍內，更優選地60至140％的范圍內，更優選地70％至130％的范圍內，更優選地80％至120％的范圍內，更優選地90％至110％的范圍內，更優選地100％。4.3.3.4.3“seq?id?no:7的變體”特別地，seq?id?no:7的變體是與多肽序列seq?id?no:7具有≥80％，更優選≥85％，更優選≥90％，更優選≥91％，更優選≥92％，更優選≥93％，更優選≥94％，更優選≥95％，更優選≥96％，更優選≥97％，更優選≥98％，更優選≥99％，更優選≥99.9％的序列相同性的多肽。優選的seq?id?no:7的變體在項4.3.3.3.1下的測定a中顯示活性。甚至更優選地，seq?id?no:7的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:7的活性的至少1％，優選至少10％，更優選至少20％，更優選至少30％，更優選至少40％，更優選至少50％，更優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選至少99％。甚至更優選地，seq?id?no:7的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:7的活性的1至1000％的范圍內，優選地5至500％的范圍內，更優選地10至400％的范圍內，更優選地40至200％的范圍內，更優選地50至150％的范圍內，更優選地60至140％的范圍內，更優選地70％至130％的范圍內，更優選地80％至120％的范圍內，更優選地90％至110％的范圍內，更優選地100％。4.3.3.4.4“seq?id?no:8的變體”特別地，seq?id?no:8的變體是與多肽序列seq?id?no:8具有≥80％，更優選≥85％，更優選≥90％，更優選≥91％，更優選≥92％，更優選≥93％，更優選≥94％，更優選≥95％，更優選≥96％，更優選≥97％，更優選≥98％，更優選≥99％，更優選≥99.9％的序列相同性的多肽。優選的seq?id?no:8的變體在項4.3.3.3.1下的測定a中顯示活性。甚至更優選地，seq?id?no:8的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:8的活性的至少1％，優選至少10％，更優選至少20％，更優選至少30％，更優選至少40％，更優選至少50％，更優選至少60％，更優選至少70％，更優選至少80％，更優選至少90％，更優選至少99％。甚至更優選地，seq?id?no:8的相應變體的活性為相對于在項4.3.3.3.2下的測定b中確定的seq?id?no:8的活性的1至1000％的范圍內，優選地5至500％的范圍內，更優選地10至400％的范圍內，更優選地40至200％的范圍內，更優選地50至150％的范圍內，更優選地60至140％的范圍內，更優選地70％至130％的范圍內，更優選地80％至120％的范圍內，更優選地90％至110％的范圍內，更優選地100％。4.4方法條件根據本發明的方法的步驟a)中的反應可以在本領域技術人員已知的條件下進行。活化的l-高絲氨酸ha與底物s反應的反應介質優選是水性的，更優選是水性緩沖液。通常在生物轉化反應中使用并且有利地在本文中使用的示例性緩沖劑包括tris、磷酸鹽或good's緩沖劑中的任一種，如2-(n-嗎啉代)乙磺酸(“mes”)、n-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(“ada”)、哌嗪-n,n'-雙(2-乙磺酸)(“pipes”)、n-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(“aces”)、p-羥基-4-嗎啉丙磺酸(“mopso”)、氯化胺、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(“mops”)、n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(“bes”)、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(“tes”)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(“hepes”)、3-(雙(2-羥乙基)氨基)-2-羥丙基-1-磺酸(“dipso”)、乙酰氨基甘氨酸、3-(n-三(羥甲基)甲基氨基(2-羥丙基)磺酸(“tapso”)、哌嗪-n,n’-雙(2-羥基丙磺酸)(“popso”)、4-(2-羥乙基)哌嗪-1-(2-羥基丙磺酸)(“heppso”)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(“hepps”)、tricine、甘氨酰胺、二甘氨酸或3-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]氨基]丙基-1-磺酸(“taps”)。在一些實施方式中，銨可以充當緩沖劑。也可以向反應中加入一種或多種有機溶劑。優選地，根據本發明的方法的步驟a)在磷酸鹽緩沖液中進行。該方法的步驟a)中反應介質的ph優選為2-10，更優選為5-8，最優選為7.5。根據本發明的方法優選在20℃-70℃，更優選30℃-55℃，最優選50℃的溫度下進行。4.5l-草銨膦磷酸酯根據本發明的方法的產物是以下結構(iii)的化合物：根據結構(iii)的化合物是l-草銨膦(r1＝h)或l-草銨膦磷酸酯(r1＝烷基、烯基、炔基、羥烷基或芳基)。根據結構(iii)的化合物(其中r1＝正丁基)縮寫為“l-ga-bu”或“lga-bu”。本領域技術人員理解根據結構(iii)的化合物中殘基r1的身份(identity)取決于底物結構(i)中殘基r1的身份。如果r1為氫，根據本發明的方法直接得到l-草銨膦。在優選的實施方式(其中r1選自烷基、烯基、炔基、羥基烷基、芳基，優選烷基，更優選甲基、乙基、正丁基)中，化合物(iii)是l-草銨膦磷酸酯。在這些實施方式中，進一步優選的是根據本發明的方法包含進一步的步驟b)，其中在步驟(a)中獲得的結構(iii)的化合物(并且其中r1選自烷基、烯基、炔基、羥烷基、芳基，優選烷基，更優選甲基、乙基、正丁基)被皂化以得到l-草銨膦。這可以通過本領域技術人員已知的方法進行。優選地，這樣的皂化在酸性條件下進行，更優選通過將1體積的含有結構(iii)化合物(其在步驟(a)中獲得)的反應介質和4體積的6n?hcl混合2h，并在50℃至150℃的溫度下(優選在100℃下)孵育所得混合物。或者，可以進行酶促皂化。實施例測試了不同來源的編碼硫化氫解酶(ec2.5.1.-和ec2.5.1.49)的基因的與活化的高絲氨酸衍生物和不同的根據結構(i)的底物反應以形成草銨膦衍生物的能力。5.1合適的酶的鑒定和質粒的構建5.1.1檢查的酶在表2中概述了在實施例中使用的編碼o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶(“shs”)或o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶(“ahs”)的基因的書目細節(bibliographic?details)(“aa”＝多肽)。表25.1.2基因表達質粒的制備5.1.2.1來源于生絲單胞菌屬的o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶met17來源于生絲單胞菌屬的met17基因編碼o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶。編碼的多肽序列可以在ncbi以ncbi參考序列wp_0116476511找到：為實現酶的表達，使用表達載體pet-28a(+)(novagen?emd?millipore)。因此，根據seq?id?no:9的met17_hy多核苷酸由geneart(thermo?fisher?scientific(waltham，usa))合成。為組裝表達載體pet-28a(+)_met17_hy，載體pet-28a(+)和met17_hy多核苷酸都用ndei和xhoi處理，連接，并且連接混合物用于轉化大腸桿菌。表達載體pet-28a(+)_met17_hy的dna與轉化體分離。5.1.2.2來源于分枝桿菌屬的o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶met43來源于分枝桿菌屬的met43基因編碼o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶。編碼的多肽序列可以在ncbi以ncbi參考序列mcb0926676.1找到。為實現酶的表達，使用表達載體pet-28a(+)(novagen?emd?millipore)。因此，根據seq?id?no:10的met43_ms多核苷酸由geneart(thermo?fisher?scientific(waltham，usa))合成。為組裝表達載體pet-28a(+)_met43_ms，載體pet-28a(+)和met43_ms多核苷酸都用ndei和xhoi處理，連接，并且連接混合物用于轉化大腸桿菌。表達載體pet-28a(+)_met43_ms的dna與轉化體分離。5.1.2.3來源于嗜熱假諾卡氏菌的o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶met46來源于嗜熱假諾卡氏菌的met46基因編碼o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶。編碼的多肽序列可以在ncbi以ncbi參考序列wp_073459782.1找到。為實現酶的表達，使用表達載體pet-28a(+)(novagen?emd?millipore)。因此，根據seq?id?no:11的met46_pt多核苷酸由geneart(thermo?fisher?scientific(waltham，usa))合成。為組裝表達載體pet-28a(+)_met46_pt，載體pet-28a(+)和met46_pt多核苷酸都用ndei和xhoi處理，連接，并且連接混合物用于轉化大腸桿菌。表達載體pet-28a(+)_met46_pt的dna與轉化體分離。5.1.2.4來源于迷蹤細菌的o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶met52來源于迷蹤細菌的met52基因編碼o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶。編碼的多肽序列可以在ncbi以ncbi參考序列mbi4397379.1找到。為實現酶的表達，使用表達載體pet-28a(+)(novagen?emd?millipore)。因此，根據seq?id?no:12的met52_eb多核苷酸由geneart(thermo?fisher?scientific(waltham，usa))合成。為組裝表達載體pet-28a(+)_met52_eb，載體pet-28a(+)和met52_eb多核苷酸都用ndei和xhoi處理，連接，并且連接混合物用于轉化大腸桿菌。表達載體pet-28a(+)_met52_eb的dna與轉化體分離。5.2o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶或o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的轉化和表達在大腸桿菌bl21(de3)(new?england?biolabs)中分別轉化攜帶o-琥珀酰高絲氨酸硫化氫解酶或o-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶基因的這些載體，其隨后在37℃下在具有50mg/l卡那霉素的lb培養基瓊脂平板上培養16h。攜帶沒有任何插入物的載體pet-28a(+)的菌株bl21用作陰性對照。得到的菌株分別命名為ec?bl21pet-28a(+)_met17-hy、ec?bl21pet-28a(+)_met43-ms、ec?bl21pet-28a(+)_met46-pt和ec?bl21pet-28a(+)_met52-eb。在每種情況下已選擇了菌落，其接種到10ml具有50mg/l卡那霉素的lb培養基中并在37℃、250rpm下培養6小時。50μl?lb培養基隨后用50mg/l卡那霉素處理并用50μl生長細胞培養物接種并在28℃、250rpm下孵育16h。用含有50μg/l卡那霉素的200ml新鮮lb培養基在2l燒瓶中將此細胞培養物稀釋至od為0.15，并在相同條件下進一步培養直至達到od為0.5(circa?4h)。然后通過添加200μl?300mm?iptg原液(終濃度300μm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，sigma-aldrich，germany)來影響基因表達誘導的起始點。在28℃、250rpm下進行誘導4h。然后收獲培養物(8ml標準化至od＝1)，通過離心除去上清液(20分鐘，4000rpm，4℃)，并用800μl的0.1m磷酸鉀緩沖液(ph?7.5)洗滌沉淀的細胞兩次，并在1ml緩沖液中取出。在fastprep?fp120儀器(qbiotene，heidelberg)中進行機械細胞消化，其中用300mg玻璃珠在消化容器中以6.5m/s搖動細胞30s四次。然后將粗提取物在12000rpm、4℃下離心20分鐘以除去未消化的細胞和細胞碎片。使用hispur?cobalt?resin(thermo?fischer?scientific，germany)純化含有histag序列的所述蛋白。使用從thermo?fischer?scientific可獲得的標準程序進行純化過程。新鮮純化的蛋白質裂解物用于酶測定。裂解液中多肽的濃度由sds?page測定，并通過軟件(biochem?lab?solutions)分析相應條帶。5.3發明實施例i1至i4進行以下測定以確定相應的多肽是否催化相應的含磷光體的底物和活化的l-高絲氨酸的反應。o-乙酰l-高絲氨酸用作活化的l-高絲氨酸底物。向含1nmol的待測試的多肽的880μl磷酸鹽緩沖液(0.1m，ph?7.5)中加入100μl的30mm?o-乙酰高絲氨酸-hcl水溶液，10μl的1mm吡哆醛5’-磷酸一水合物水溶液(1mm)，和10μl?200mm丁基p-甲基次膦酸鹽(cas-no.6172-80-1；“mpbe”)水溶液。反應在50℃下進行120分鐘。然后，將100μl分批溶液在100μl甲醇中稀釋并應用在lc-ms?qqq(項5.7)上以分析lga-bu。5.4發明實施例i5和i6進行以下測定以確定根據seq?id?no:5和seq?id?no:8的多肽是否催化p-甲基-次膦酸[“pmea”；結構(i)與r1＝h]和活化的l-高絲氨酸的反應。o-乙酰l-高絲氨酸用作活化的l-高絲氨酸底物。向含1nmol的此多肽的880μl磷酸鹽緩沖液(0.1m，ph?7.5)中加入100μl的30mm?o-乙酰高絲氨酸-hcl水溶液，10μl的1mm吡哆醛5’-磷酸一水合物水溶液(1mm)，和10μl的200mm?pmea水溶液。反應在50℃下進行120分鐘。然后，將100μl分批溶液在100μl甲醇中稀釋并應用在lc-ms?qqq(項5.7)上以分析lga-bu。結果概括在下表3中。所用縮寫為“mpbe”＝丁基p-甲基次膦酸鹽(cas-no.6172-80-1)；“pmea”＝p-甲基次膦酸(cas-no.4206-94-4)。表3 實例 酶 多肽 底物 產物 i1 met17 seq?id?no:5 mtbe 是 i2 met43 seq?id?no:6 mtbe 是 i3 met46 seq?id?no:7 mtbe 是 i4 met52 seq?id?no:8 mtbe 是 i5 met17 seq?id?no:5 pmea 是 i6 met52 seq?id?no:8 pmea 是 5.6結果表3中概述的結果表明，所測試的多肽接受甲基次膦酸化合物，例如mpbe和pmea作為底物，并催化它們與活化的l-高絲氨酸反應至相應的lga的正丁基p-酯或游離的lga。此發現甚至更令人驚訝，因為本領域技術人員不期望這些酶催化這些反應，因為其它磷酸化合物如demp不作為底物起作用。該發現為lga及其衍生物開放了新的酶促途徑。5.7分析方法已通過lc-ms?qqq系統上的掃描進行了實驗的所有分析測量。將樣品在甲醇中稀釋(v:v＝1:2)。應用的hplc屬于來自agilent的1260infinity系列，其連接到具有電噴射電離的質譜儀6420三重四極。通過陽性檢測模式中的保留時間和分子質量進行峰值檢測。通過沒有零的二次校準和峰面積進行數據評估。獲取方法細節離子源esi(電噴霧電離)時間參數質量范圍?m/z＝50-300每秒掃描?400分段?40v極性?正(掃描模式)源參數氣體溫度?350℃氣流?12升/分鐘噴霧器?50psi毛細管?4000v二元泵注入體積2.00μl流0.60ml/min溶劑組合物溶劑a?h2o中的100mm乙酸銨+0.1％(v/v)甲酸溶劑b乙腈中的0.1％甲酸梯度見表4。表4 時間(min) 溶劑a(％) 溶劑b(％) 0.5 5 95 1.2 45 55 4.0 45 55 4.1 95 5 7.0 95 5 7.1 5 95 10.0 5 95 柱類型?luna?hilic；100×2mm；3μm；phenomenex?00d-4449-bo溫度?30.0℃6.序列概述下表提供了本技術上下文中提到的dna和蛋白質序列的概述：

背景技術：

技術實現思路