本發(fā)明涉及用于人類或動物食用的培育肉的永生化原代非人動物細胞和制備此類細胞的方法。

背景技術(shù)：

1、在未來50年內(nèi)，世界人口將增加到近100億人。因此，到2050年，將有另外的近20億人需要養(yǎng)活。人口增長加上許多國家對肉類的需求不斷增加，到2050年，全球肉類需求將增加約73%。為了滿足這一需求，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)將不得不擴大生產(chǎn)，規(guī)模可能加倍。目前，地球上39%的可居住土地用于生產(chǎn)飼料，以飼養(yǎng)肉類工業(yè)所需的牲畜。飼養(yǎng)一頭用于屠宰的牛需要3年，飼養(yǎng)豬和家禽需要6-12個月。因此，需要大面積的耕地來飼養(yǎng)這些動物。目前，每年有800億只動物被屠宰用于肉類，僅在英國就有12億只動物被屠宰。

2、培育肉具有解決與牲畜養(yǎng)殖和肉類生產(chǎn)的環(huán)境影響以及動物福利、食品安全和人類健康相關(guān)的重大全球問題的潛力。培育肉是由動物細胞的體外細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的肉。這是細胞農(nóng)業(yè)的一種形式，在消費者對蛋白質(zhì)需求增加的背景下探索這種農(nóng)業(yè)方法。細胞農(nóng)業(yè)涉及從細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生動物來源的食品。

3、培育肉是使用傳統(tǒng)上用于再生醫(yī)學的組織工程技術(shù)生產(chǎn)的，并且需要細胞系，通常是干細胞。干細胞是未分化的細胞，其具有成為許多或所有所需的特化細胞類型的潛力。雖然多能干細胞經(jīng)常被認為是理想的起始細胞，但這一干細胞亞類中最突出的實例是胚胎干細胞，由于倫理問題，胚胎干細胞在研究中的使用存在爭議。因此，誘導(dǎo)多能干細胞（ipsc）已經(jīng)開發(fā)出來。ipsc是多能的血液和皮膚細胞，其被人工回歸成多能狀態(tài)，使它們能夠分化為更大范圍的細胞。ipsc的替代方案涉及使用多潛能成體干細胞，其產(chǎn)生可分化成肌肉細胞的肌肉細胞譜系或單能祖細胞。干細胞的有利特性使其適用于培育肉生產(chǎn)，包括永生、增殖能力增強、不依賴粘附、血清獨立性和容易分化為組織。

4、用于產(chǎn)生細胞系的干細胞可以從原始來源收集，即通過在局部麻醉下在動物上的活組織檢查收集，并且也可以從次級來源（例如冷凍保藏培養(yǎng)物）建立。然而，從農(nóng)業(yè)相關(guān)物種（例如豬、牛、雞）的經(jīng)常用于食品消費的組織/器官（如肌肉、脂肪和成纖維細胞）中分離出的體細胞在體外生長時具有有限的生命周期。雖然可以從豬分離出原代細胞系（成肌細胞、肌成纖維細胞、成纖維細胞、脂肪來源的干細胞和上皮細胞），但以有效的倍增時間和長期繁殖這些細胞系的能力是不可行的。

5、培養(yǎng)基是體外培養(yǎng)的必需組分，并且負責提供細胞增殖所必需的大分子、營養(yǎng)素和生長因子。獲取生長因子是制備培育肉的有效過程的障礙之一。傳統(tǒng)上，獲取生長因子涉及胎牛血清（fbs）的使用。fbs是從胎牛提取的血液制品。除了倫理考慮之外，fbs還確保培育肉并非完全不使用動物。fbs也是用于制備培育肉的過程中的最昂貴成分，價格為每升約1000美元。另外，fbs的化學組成在每種動物源之間差異很大，因此無法在化學上統(tǒng)一量化。使用fbs，是因為它方便地幫助模擬體內(nèi)肌肉發(fā)育過程。組織發(fā)育所需的生長因子主要通過動物的血流提供，除了fbs之外沒有單一流體可以單獨地遞送所有這些組分。目前替代fbs的方法是使用重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)單獨地生成每種生長因子。在該方法中，將編碼特定因子的基因整合到隨后發(fā)酵的細菌中。然而，由于該過程的增加的復(fù)雜性，該方法特別昂貴。

6、先前已經(jīng)表明，通過引入端粒酶催化亞基（htert）、h-ras基因的超活化的突變體（h-rasg12v）和來自猿猴病毒40的大t抗原（sv40?lt），可以使人成纖維細胞永生化，所述端粒酶催化亞基（htert）、h-ras基因的超活化的突變體（h-rasg12v）和來自猿猴病毒40的大t抗原（sv40?lt）結(jié)合和滅活細胞蛋白p53（由tp53編碼）和prb（由rb1編碼）以解聯(lián)細胞周期（hahn等人，nature，第?400卷，第464-468頁（1999））。其他人已經(jīng)證實，外源性引入htert和超活化的h-ras（或相對的，例如n-ras）在一些情況下與tp53失活組合，可以使人成纖維細胞和人上皮細胞兩者都永生化（yang等人，carcinogenesis，第28卷，第1期，2007年1月，第174-182頁；tooloui等人?oncogene，第21卷，第128-139頁（2002））。關(guān)于與細胞農(nóng)業(yè)相關(guān)的細胞類型（例如肌肉祖細胞），使用外源性htert和突變型細胞周期蛋白依賴性激酶4（cdk4）的組合已經(jīng)使人成肌細胞永生化（zhu等人，aging?cell，第6卷，第4期，2007年8月，第515-523頁）。這項工作已經(jīng)延伸到農(nóng)業(yè)相關(guān)物種中，其中通過引入外源性tert、突變型cdk4和細胞周期蛋白d1表達，已經(jīng)使豬和牛成纖維細胞永生化（donai等人，j?biotechnol.?2014apr?20;176:?第50-7頁）。

7、用于細胞永生化以制備用于細胞農(nóng)業(yè)的細胞系的方法的共同主題是添加外源性tert。另一個共性是需要引入外來基因（例如cdk4、細胞周期蛋白d1、sv40?lt）到細胞中以使它們永生化。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、需要建立永生化細胞系。本發(fā)明人通過提供修飾的動物細胞來解決該需要，所述修飾的動物細胞包含內(nèi)源性基因的修飾并且不需要外源性核酸構(gòu)建體的表達。

2、在第一方面，本發(fā)明涉及修飾的非人動物細胞，其在與基因組監(jiān)測、細胞周期控制和/或細胞死亡控制相關(guān)的一個或多個基因中具有基因修飾，并且其中所述動物是適合人類或動物食用的任選地用于農(nóng)業(yè)中的動物物種。

3、在一個實施方案中，所述修飾使所述細胞永生化。

4、在一個實施方案中，所述動物選自豬、牛、家禽、綿羊、山羊、魚、甲殼動物或軟體動物。

5、在一個實施方案中，所述修飾的細胞是體細胞。

6、在一個實施方案中，所述修飾的細胞選自以下細胞類型中的一種：成肌細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞、脂肪來源的干細胞、上皮細胞、間充質(zhì)干細胞、衛(wèi)星細胞或肝細胞。

7、在一個實施方案中，所述細胞不表達外源性核酸以操縱基因組監(jiān)測、細胞周期控制和/或細胞死亡控制通路。

8、在一個實施方案中，所述動物細胞在以下基因中的一個或多個中具有基因修飾：rb1、tp53和/或ras基因。

9、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1中具有基因修飾。

10、在一個實施方案中，所述動物細胞在tp53中具有基因修飾。

11、在一個實施方案中，所述動物細胞在ras基因中具有基因修飾。

12、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1和tp53中具有基因修飾。

13、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1和ras基因中具有基因修飾。

14、在一個實施方案中，所述動物細胞在tp53和ras基因中具有基因修飾。

15、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1、tp53和ras基因中具有基因修飾。

16、在一個實施方案中，所述ras基因是hras、nras或kras。

17、在一個實施方案中，所述ras基因是hras。

18、在一個實施方案中，所述修飾在一個或多個基因的啟動子區(qū)或編碼區(qū)中，或者是調(diào)節(jié)一個或多個基因的調(diào)節(jié)元件。

19、在一個實施方案中，使用靶向基因組修飾引入所述修飾。

20、在一個實施方案中，使用內(nèi)切核酸酶。

21、在一個實施方案中，所述內(nèi)切核酸酶選自talen、zfn或crispr/cas9。

22、在一個實施方案中，其中所述基因選自rb1和/或tp53中的一個或兩者，并且所述修飾是功能喪失修飾。

23、在一個實施方案中，所述功能喪失修飾包括基因的敲除。

24、在一個實施方案中，所述基因是ras基因，所述修飾是超活化修飾，任選地，其中所述ras基因是hras、nras或kras。

25、在一個實施方案中，所述超活化修飾包含一個或多個氨基酸置換。

26、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括置換在seq?id?no:46、47或48的位置12或13處的甘氨酸或者位置61處的谷氨酰胺。

27、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括置換在seq?id?no:46、47或48的位置12或13處的甘氨酸，其中所述一個或多個氨基酸選自包含丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、精氨酸、絲氨酸和纈氨酸的列表。

28、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括用纈氨酸置換seq?id?no:46、47或48的位置12或13處的甘氨酸。

29、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括置換在seq?id?no:46、47或48的位置61處的甘氨酸，其中所述一個或多個氨基酸選自包含谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸和精氨酸的列表。

30、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括用纈氨酸置換在seq?id?no:1的位置12處的甘氨酸。

31、在第二方面，本發(fā)明涉及制備培育肉或培養(yǎng)肉產(chǎn)品的方法，其包括培養(yǎng)如本文所述的修飾的動物細胞。

32、在一個實施方案中，所述方法包括連續(xù)或分批培養(yǎng)修飾的細胞。

33、在一個實施方案中，所述方法包括使所述細胞形成組織樣結(jié)構(gòu)的步驟。

34、在一個實施方案中，所述細胞形成為肌肉組織樣結(jié)構(gòu)。

35、在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)如本文所述的修飾的動物細胞的方法，其中所述方法包括在與基因組監(jiān)測、細胞周期控制和/或細胞死亡控制相關(guān)的一個或多個基因中引入基因修飾，并且其中所述動物是適于人類或動物食用的任選地用于農(nóng)業(yè)中的動物。

36、另一方面，本發(fā)明涉及使動物細胞永生化的方法，其中所述方法包括在與基因組監(jiān)測、細胞周期控制和/或細胞死亡控制相關(guān)的一個或多個基因中引入基因修飾，并且其中所述動物是適合人類或動物食用的任選地用于農(nóng)業(yè)中的動物。

37、在一個實施方案中，所述基因修飾改變與基因組監(jiān)測、細胞周期控制和/或細胞死亡控制相關(guān)的一個或多個基因的表達或功能。

38、在一個實施方案中，將所述動物細胞永生化。

39、在一個實施方案中，所述動物選自豬、牛、家禽、綿羊、山羊、魚、甲殼動物或軟體動物。

40、在一個實施方案中，所述修飾的細胞是體細胞。

41、在一個實施方案中，所述修飾的細胞選自以下細胞類型中的一種：成肌細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞、脂肪來源的干細胞、上皮細胞、間充質(zhì)干細胞、衛(wèi)星細胞或肝細胞。

42、在一個實施方案中，所述細胞不表達外源性核酸以操縱基因組監(jiān)測、細胞周期控制和/或細胞死亡控制。

43、在一個實施方案中，所述動物細胞在以下基因中的一個或多個中具有基因修飾：rb1、tp53和/或ras基因。

44、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1中具有基因修飾。

45、在一個實施方案中，所述動物細胞在tp53中具有基因修飾。

46、在一個實施方案中，所述動物細胞在ras基因中具有基因修飾。

47、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1和tp53中具有基因修飾。

48、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1和ras基因中具有基因修飾。

49、在一個實施方案中，所述動物細胞在tp53和ras基因中具有基因修飾。

50、在一個實施方案中，所述動物細胞在rb1、tp53和ras基因中具有基因修飾。

51、在一個實施方案中，所述ras基因是hras、nras或kras。

52、在一個實施方案中，所述ras基因是hras。

53、在一個實施方案中，對一個或多個基因的啟動子區(qū)或編碼區(qū)進行修飾。

54、在一個實施方案中，使用靶向基因組修飾引入所述修飾。

55、在一個實施方案中，使用內(nèi)切核酸酶。

56、在一個實施方案中，所述內(nèi)切核酸酶選自talen、zfn或crispr/cas9。

57、在一個實施方案中，所述基因選自rb1和/或tp53中的一個或兩者，并且所述修飾是功能喪失修飾。

58、在一個實施方案中，所述功能喪失修飾包括基因的敲除。

59、在一個實施方案中，所述基因是ras基因，所述修飾是超活化修飾，任選地，其中所述ras基因是hras、nras或kras。

60、在一個實施方案中，所述超活化修飾包含一個或多個氨基酸置換。

61、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括置換在seq?id?no:46、47或48的位置12或13處的甘氨酸或者位置61處的谷氨酰胺。

62、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括置換在seq?id?no:46、47或48的位置12或13處的甘氨酸，其中所述一個或多個氨基酸選自包含丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、精氨酸、絲氨酸和纈氨酸的列表。

63、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括用纈氨酸置換在seq?id?no:46、47或48的位置12或13處的甘氨酸。

64、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括置換在seq?id?no:46、47或48的位置61處的甘氨酸，其中所述一個或多個氨基酸選自包含谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸和精氨酸的列表。

65、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括用纈氨酸置換在seq?id?no:1的位置12處的甘氨酸。

66、在一個實施方案中，所述一個或多個氨基酸置換包括用纈氨酸置換在seq?id?no:1的位置12處的甘氨酸。

67、另一方面，本發(fā)明涉及培育或培養(yǎng)動物組織或者培育或培養(yǎng)肉產(chǎn)品，其包含如本文所述的修飾的細胞。

68、在一個實施方案中，所述培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)。

69、在另一方面，本發(fā)明涉及如本文所述的修飾的動物細胞用于細胞農(nóng)業(yè)的用途。

70、在另一方面，本發(fā)明涉及用于制備永生化動物細胞系的方法，其包括如本文所述的方法。

71、指導(dǎo)rna用于制備如本文所述的修飾的、永生化的細胞或永生化的動物細胞系的方法。

72、在另一方面，本發(fā)明涉及包含選自seq?id?no.15、16、17、18的任何序列的指導(dǎo)rna。

73、在一個實施方案中，所述指導(dǎo)rna用于制備如本文所述的修飾的或永生化的細胞的方法。

74、在一個實施方案中，所述修飾的細胞是如本文所述的修飾的細胞。

75、在另一方面，本發(fā)明涉及包括如本文所述的指導(dǎo)rna的部件的試劑盒。