本發明涉及植物病毒學和分子生物學，具體涉及一種含有黃瓜花葉病毒fny分離物突變型rna1的質粒載體及其應用。

背景技術：

1、在農業生產中植物病毒病危害植物的程度僅次于真菌性病害，現已發現700多種植物病毒病，危害147種作物，僅蔬菜上就發現80多種(郭萬卓等，2010)。由于植物沒有完整的免疫系統且缺少有效防治藥劑和措施，植物病毒病的防治較為困難，一旦流行暴發，就會造成慘重損失。

2、通過對交叉保護研究的不斷深入，弱毒疫苗防治技術越來越受到人們的關注，并不斷發展突破。一種病毒通常存在多種株系，在侵染植物后不表現或只表現輕微病毒病癥狀的株系，稱為弱毒株系。在病毒的弱毒株系預先侵染植物后，誘導植物自身的免疫系統，而當再次受到同種病毒侵染時就會刺激“免疫”，免受強毒株系的侵害(婁虎等，2017)。

3、在研制弱毒疫苗的過程中，為實現安全、高效和穩定的交叉保護防治效果，對新構建的疫苗需要有如下要求：一是所創制的弱毒疫苗應為弱致病性，接種到植物中不會產生明顯癥狀，不會對植物的生長狀況產生影響；二是創制弱毒疫苗的基礎載體應具有廣寄主特性，對各種植物都應具備一定的侵染能力，且能夠抵御多種病毒的強毒株系的再侵染；三是弱毒疫苗預先接種后，應在一定期限內具備良好的遺傳穩定性，能夠維持疫苗長時間的免疫效果。

4、黃瓜花葉病毒(cucumber?mosaic?virus，cmv)是目前已知的寄主范圍最廣的植物病毒之一。黃瓜花葉病毒由三個基因組rna1、rna2、rna3以及亞基因組rna4和rna4a組成(sivakumaran?et?al.,2002)。其中，rna1編碼一種稱為1a的蛋白質。蛋白1a的序列是高度保守的，有兩個功能結構域，n端結構域具有甲基轉移酶活性，用于向基因組和亞基因組rna的5'末端添加帽結構，而1a蛋白的c端結構域是一種假定的解旋酶，其功能是“解開”病毒復制過程中產生的雙鏈rna。rna2編碼2a和2b蛋白，2a蛋白具有rna依賴性rna聚合酶(rdrp)活性，并與1a蛋白一起參與病毒復制過程(palukaitis?et?al.,1992；rozanov?et?al.,1992)；2b蛋白從rna2的3′部分中的亞基因組rna鏈稱為rna4a翻譯而來，cmv2b蛋白參與長距離病毒運動、全身癥狀的表達和基因沉默的抑制。rna3編碼亞基因組rna4表達3a蛋白和外殼蛋白(cp)，3a蛋白與病毒在宿主中的細胞間運動和長距離運輸有關，因此它也被稱為運動蛋白(mp)。cp是唯一與病毒顆粒相關的蛋白質，也是蚜蟲媒介傳播的唯一決定因素(nagano?et?al.,2001；llamas?et?al.,2006)。

5、黃瓜花葉病毒寄主范圍廣泛、分離物資源豐富，三分體基因組賦予多位點突變和假重組選擇，具備開發弱毒疫苗載體的良好潛力。前期研究中主要針對黃瓜花葉病毒rna2進行突變改造，構建得到遺傳穩定、交叉保護效果良好的cmv為骨架的弱毒疫苗，但是，針對黃瓜花葉病毒rna1構建的弱毒疫苗載體還很少見有報道。

技術實現思路

1、針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種含有黃瓜花葉病毒fny分離物rna1的突變型質粒載體及其應用。本發明對黃瓜花葉病毒fny分離物的rna1進行了結構改造，使其具有弱毒性；將其作為疫苗載體，至少可以容納200bp的外源片段并保持遺傳穩定性，為開發多價弱毒疫苗提供了基礎。

2、為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

3、本發明的第一方面，提供一種含有黃瓜花葉病毒fny分離物突變型rna1的質粒載體，將其命名為pccfr1-3um2，所述質粒載體含有cmvfny分離物突變型rna1。

4、所述cmvfny分離物突變型rna1是在rna1的3079-3080位核苷酸之間插入多克隆酶切位點ggatccgtcgaccccggg(bamh?i、sali、sma?i)；cmvfny分離物突變型rna1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

5、本發明的第二方面，提供上述質粒載體pccfr1-3um2的制備方法，包括以下步驟：

6、以cmvfny?rna1侵染性克隆質粒pcb301-cmvfny-r1為模板，利用seq?id?no.2和seqid?no.3所示的引物進行反向pcr擴增，獲得線性化載體；利用bamhi酶切與連接技術，最終獲得質粒載體pccfr1-3um2。

7、優選的，反向pcr擴增的條件為：95℃預變性3min；95℃變性15s，54℃退火15s，72℃延伸4min，30個循環；72℃徹底延伸5min；4℃保存。

8、本發明的第三方面，提供上述質粒載體pccfr1-3um2在構建植物病毒弱毒疫苗中的應用。

9、本發明的第四方面，提供上述質粒載體pccfr1-3um2作為弱毒疫苗在防治黃瓜花葉病毒病中的應用。

10、本發明的第五方面，提供一種植物弱毒疫苗，包括：質粒載體pccfr1-3um2、野生型cmvfnyrna2和野生型cmvfny?rna3。

11、優選的，質粒載體pccfr1-3um2、野生型cmvfnyrna2和野生型cmvfny?rna3的濃度比為1:1:1。

12、本發明的有益效果：

13、(1)本發明保留了黃瓜花葉病毒1a蛋白編碼序列，在rna1的3079-3080位核苷酸之間插入多克隆酶切位點ggatccgtcgaccccggg(bamhi、sali、smai)，獲得一種黃瓜花葉病毒的弱毒突變體，該質粒與含有cmvfny分離物的rna2和rna3的質粒混合接種，可以預防cmv強毒株系的侵染，可作為抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗。

14、(2)本發明獲得的黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗載體pccfr1-3um2作為多價弱毒疫苗構建的基礎載體，至少可以容納200bp外源片段并保持遺傳穩定性，為構建多價弱毒疫苗提供更多病毒種類的選擇。

15、(3)對于獲得的黃瓜花葉病毒弱毒突變體，本發明可以作為多價弱毒疫苗構建的基礎載體，利用引入的多克隆酶切位點，插入其他重要的植物病毒序列，得到兼抗黃cmv及其他病毒的多價弱毒疫苗。基于獲得rna1的弱毒疫苗載體，既可以單獨使用；也可以根據需要和基于rna2的弱毒疫苗載體混合使用，提高疫苗的防治靶標病毒的范圍。

技術特征：

1.一種含有黃瓜花葉病毒fny分離物突變型rna1的質粒載體，其特征在于，所述質粒載體含有cmvfny分離物突變型rna1，所述cmvfny分離物突變型rna1的核苷酸序列如seq?idno.1所示。

2.權利要求1所述的質粒載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，反向pcr擴增的條件為：95℃預變性3min；95℃變性15s，54℃退火15s，72℃延伸4min，30個循環；72℃徹底延伸5min；4℃保存。

4.權利要求1所述的質粒載體在構建植物病毒弱毒疫苗中的應用。

5.權利要求1所述的質粒載體作為弱毒疫苗在防治黃瓜花葉病毒病中的應用。

6.一種植物弱毒疫苗，其特征在于，包括：權利要求1所述的質粒載體、野生型cmvfnyrna2和野生型cmvfny?rna3。

7.根據權利要求6所述的植物弱毒疫苗，其特征在于，質粒載體、野生型cmvfnyrna2和野生型cmvfny?rna3的濃度比為1:1:1。

技術總結
本發明公開了一種含有黃瓜花葉病毒Fny分離物突變型RNA1的質粒載體及其應用，屬于植物病毒學和分子生物學技術領域。所述質粒載體含有CMV<subgt;Fny</subgt;分離物突變型RNA1，所述CMV<subgt;Fny</subgt;分離物突變型RNA1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發明對黃瓜花葉病毒Fny分離物的RNA1進行了結構改造，使其具有弱毒性；將其作為疫苗載體，至少可以容納200bp的外源片段并保持遺傳穩定性，為開發多價弱毒疫苗提供了基礎。

技術研發人員：原雪峰,王昭,于成明
受保護的技術使用者：山東農業大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28