本發明涉及生物醫學，尤其是涉及登革減毒株及其應用。

背景技術：

1、登革熱(dengue)是一種由登革病毒(dengue?virus，denv)引起的急性蟲媒傳染病，廣泛流行于熱帶、亞熱帶的100多個國家和地區，全球有近30億人面臨登革病毒感染的風險。登革病毒屬于黃病毒屬，是一種單股正鏈rna病毒，其基因組長度約11kb，由5端非編碼區、3端非編碼區，以及中間的單個開放閱讀框組成。開放閱讀框編碼病毒的前體蛋白，該蛋白最終會被切割成3個病毒結構蛋白(c、prm、e)和7個病毒非結構蛋白(ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5)。根據e蛋白抗原性不同，登革病毒被分為denv-1、denv-2、denv-3和denv-4這四種血清型。登革病毒感染人體后常常引發抗體依賴性增強作用，使得許多僅能誘導體液免疫的疫苗效果不佳，在保護幼童和誘導均衡免疫應答等方面存在不足。

技術實現思路

1、本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明提出一種登革減毒株，顯著削弱病毒致病性，同時能夠引發良好的宿主保護性免疫反應，有助于快速開發有效的登革疫苗。

2、本發明還提供上述登革減毒株的制備方法。

3、本發明還提供一種生物材料。

4、本發明還提供上述登革減毒株或生物材料的應用。

5、本發明還提供一種包括上述登革減毒株的疫苗。

6、根據本發明的第一方面實施例的一種登革減毒株，所述登革減毒株包含重新編碼的ns2a蛋白的功能結構域、ns2b蛋白的功能結構域和/或ns1蛋白的功能結構域；

7、所述重新編碼的ns2a蛋白的功能結構域、ns2b蛋白的功能結構域和/或ns1蛋白的功能結構域的編碼序列相較于對應的親本蛋白結構域編碼序列，具有降低的密碼子對偏好性；

8、所述登革減毒株的prm蛋白的弗林蛋白酶切割位點存在至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個或至少九個氨基酸突變。

9、根據本發明實施例的登革減毒株，至少具有如下有益效果：

10、實施例的登革減毒株具有良好的安全性，可用于預防登革病毒感染，能夠引發良好的宿主保護性免疫反應，同時具有卓越的遺傳穩定性，有助于快速開發有效的登革疫苗。通過在prm蛋白的弗林蛋白酶切割位點選擇合適的突變可以顯著促進病毒的成熟過程，有利于登革減毒株在細胞系中的擴增，且充分成熟有利于降低ade效應。

11、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株包含重新編碼的非結構蛋白的功能結構域。所述非結構蛋白包含ns2a蛋白、ns2b蛋白和/或ns1蛋白。

12、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株包括ⅰ型登革病毒、ⅱ型登革病毒、ⅲ型登革病毒、ⅳ型登革病毒中的至少一種。

13、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅰ型登革病毒，所述ns2a蛋白的功能結構域的氨基酸序列為ns2a蛋白的第1～218位。

14、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅱ型登革病毒，所述ns2a蛋白的功能結構域的氨基酸序列為ns2a蛋白的第1～218位。

15、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅱ型登革病毒，所述ns2b蛋白的功能結構域的氨基酸序列為ns2b蛋白的第1～130位。

16、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅱ型登革病毒，所述ns1蛋白的功能結構域的氨基酸序列為ns1蛋白的1～352位。

17、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株包含重新編碼的ns2a蛋白、ns2b蛋白和/或ns1蛋白；所述重新編碼的ns2a蛋白、ns2b蛋白和/或ns1蛋白的編碼序列相較于對應的親本蛋白編碼序列，具有降低的密碼子對偏好性。

18、根據本發明的一些實施方式，所述降低的密碼子對偏好性為相對哺乳動物降低的密碼子對偏好性。所述哺乳動物對登革病毒易感。

19、根據本發明的一些實施方式，所述哺乳動物包括但不限于人、鼠。

20、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株的所述重新編碼的ns2a蛋白、ns2b蛋白和/或ns1蛋白的編碼序列的密碼子對偏好性(codon?pair?bias,cpb)相比于親本蛋白降低0.3以上。所述cpb數值參考文獻《virus?attenuation?by?genome-scale?changes?incodon?pair?bias》(coleman?j?r,papamichail?d,skiena?s,et?al.virus?attenuationby?genome-scale?changes?in?codon?pair?bias[j].science,2008,320(5884):p.1784-1787.doi:10.1126/science.1155761.)進行計算。例如：cpb數值可以降低0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44或0.45。

21、根據本發明的一些實施方式，所述弗林蛋白酶切割位點為所述prm蛋白的第83至92位氨基酸序列。

22、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株的prm蛋白第85、86、89位氨基酸中的至少一個、至少兩個或至少三個存在突變。

23、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株的prm蛋白的第85、86、89位氨基酸存在突變。

24、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅱ型登革病毒，所述登革減毒株的prm蛋白的第89位存在氨基酸突變e85a、h86g、e89s。

25、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株的prm蛋白的第89位存在氨基酸突變。

26、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅰ型登革病毒，所述登革減毒株的prm蛋白的第89位存在氨基酸突變d89k。

27、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅱ型登革病毒，所述登革減毒株的重新編碼后的ns2a蛋白的編碼序列如seq?id?no:2第3478～4131位核苷酸序列所示。

28、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅱ型登革病毒，所述登革減毒株的重新編碼后的ns2b蛋白的編碼序列如seq?id?no:3第4132～4521位核苷酸序列所示。

29、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅱ型登革病毒，所述登革減毒株的重新編碼后的ns1蛋白的編碼序列如seq?id?no:4第2422～3477位核苷酸序列所示。

30、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株為ⅰ型登革病毒，所述登革減毒株的重新編碼后的ns2a蛋白的編碼序列如seq?id?no:6第3476～4129位核苷酸序列所示。

31、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株還包括c蛋白、prm蛋白、e蛋白、ns3蛋白、ns4a蛋白、ns4b蛋白、ns5蛋白。

32、根據本發明的一些實施方式，所述登革減毒株的基因組rna對應的cdna的核苷酸序列如seq?id?no:2、seq?id?no:3、seq?id?no:4或seq?id?no:6所示。由此，可以在不改變整體密碼子使用率以及保持rna局部和整體自由能不發生較大變化的前提下實現了密碼子對偏好性的降低。

33、根據本發明的第二方面實施例的上述登革減毒株的制備方法，包括如下步驟：

34、利用攜帶所述登革減毒株的基因組的載體通過反向遺傳技術在細胞中拯救獲得所述登革減毒株。

35、根據本發明的一些實施方式，所述細胞的培養溫度為34℃～37℃。

36、根據本發明的第三方面實施例的一種生物材料，選自a1)～a6)中的任一種；

37、a1)分離的核酸分子，包括上述登革減毒株的全基因組的核酸序列；

38、a2)含有a1)所述核酸分子的表達盒；

39、a3)含有a1)所述核酸分子或a2)所述表達盒的載體；

40、a4)含有a1)所述核酸分子、a2)所述表達盒或a3)所述載體的重組微生物；

41、a5)含有a1)所述核酸分子、a2)所述表達盒或a3)所述載體的細胞；

42、a6)由a5)所述細胞培養產生的所述登革減毒株。

43、根據本發明的一些實施方式，所述核酸序列為基因rna或其對應的cdna。

44、根據本發明的一些實施方式，所述核酸分子的核苷酸序列如seq?id?no:2、seq?idno:3、seq?id?no:4或seq?id?no:6所示。

45、根據本發明的一些實施方式，所述載體為表達載體或克隆載體。例如：所述載體為pcc1載體。

46、根據本發明的一些實施方式，所述核酸分子的5端含有啟動子。所述啟動子包括t7啟動子、cmv啟動子中的至少一種。所述t7啟動子的核苷酸序列如seq?id?no:7所示。

47、根據本發明的一些實施方式，所述核酸分子的3端含有丁型肝炎核酶序列。所述丁型肝炎核酶序列的核苷酸序列如seq?id?no:8所示。

48、根據本發明的一些實施方式，所述重組微生物為細菌、酵母、藻或真菌。

49、根據本發明的一些實施方式，所述細胞為離體動物細胞。例如：所述細胞可以為vero細胞。

50、根據本發明的一些實施方式，所述細胞不包括繁殖材料。

51、根據本發明的第四方面實施例的上述登革減毒株或上述生物材料在b1)～b3)任一種中的應用：

52、b1)制備篩選抗登革病毒的藥物的產品；

53、b2)篩選預防和/或治療登革病毒的藥物；

54、b3)制備評估抗登革病毒藥物的藥效的產品。

55、根據本發明的一些實施方式，所述產品選自藥物、試劑盒。

56、根據本發明的第五方面實施例的一種疫苗，所述疫苗的活性成分包含上述登革減毒株。由于疫苗采用了上述實施例的登革減毒株的全部技術方案，因此至少具有上述實施例的技術方案所帶來的所有有益效果。

57、根據本發明的一些實施方式，所述疫苗還包括藥學上可接受的佐劑或載體。

58、根據本發明的一些實施方式，所述疫苗的劑型為液體注射劑、注射粉劑和注射片劑中的至少一種。

59、根據本發明的一些實施方式，所述佐劑選自油佐劑、水包油佐劑、油包水佐劑、水包油包水佐劑、鋁鹽和多糖類佐劑中的至少一種。

60、本發明的其它特征和優點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實施本發明而了解。