本發明涉及膜蛋白，特別是涉及一種外泌體膜蛋白的標記以及純化方法。

背景技術：

1、外泌體作為一類細胞外囊泡介導細胞與細胞間互作和通訊等重要功能而受到廣泛的關注。外泌體廣泛存在并分布于各種體液中，其攜帶和傳遞重要的信號分子，形成了一種全新的細胞與細胞間信息傳遞系統。外泌體膜結構可以攜帶蛋白、脂質、核酸等生物活性物質，并將其傳遞給受體細胞，從而調控受體細胞的生理功能或病理功能，在細胞間信息交流中發揮著重要作用。

2、作為天然信息載體，外泌體具有免疫原性低，生物相容性高，血液中穩定存在的優點，因此外泌體可以作為藥物載體，在醫療領域具有巨大的應用潛力。此外，外泌體通常攜帶親本細胞的特定受體，具有一定的靶向性，有助于靶向給藥，作為藥物遞送載體的相關研究也越來越多。然而，外泌體雖然在新型醫藥領域帶來了希望，但體內注射的外泌體會在肝臟，脾臟，肺等免疫清除器官大量富集，最終在病灶部位起到治療作用的外泌體非常少。為了增強外泌體的治療效果，降低對正常細胞的毒害，需提高外泌體的靶向遞送藥物的能力。其中，外泌體膜蛋白在外泌體靶向以及與受體細胞識別中扮演非常重要的作用，因此深入理解外泌體膜蛋白的分子組成和對于外泌體的靶向功能與分子機制認識具有重要意義。

3、膜蛋白指一類生物膜所包含的蛋白質，膜蛋白作為膜功能的主要體現者，在生物膜識別、轉運等功能上起著至關重要的作用。依據蛋白與生物膜結合方式不同，可將膜蛋白分為3類：外在膜蛋白、內在膜蛋白以及脂錨定膜蛋白。外在膜蛋白分布在膜的內外表面，約占膜蛋白的20％～30％，主要在內表面，多為水溶性蛋白，其通過離子鍵、氫鍵與膜脂分子的極性頭部相結合，或通過與內在膜蛋白的相互作用，間接與膜結合。脂錨定膜蛋白是通過與脂分子共價相連，脂分子插入膜的脂雙分子層中，從而將蛋白錨定在細胞質膜上。而內在膜蛋白約占膜蛋白的70％～80％，是雙親性分子，可不同程度的嵌入脂雙層分子中。有的貫穿整個脂雙層，兩端暴露于膜的內外表面，這種類型的膜蛋白又稱跨膜蛋白。內在膜蛋白露出膜外的部分含較多的極性氨基酸，屬親水性，與磷脂分子的親水頭部鄰近；嵌入脂雙層內部的膜蛋白由一些非極性的氨基酸組成，與脂質分子的疏水尾部相互結合。內在膜蛋白通常與膜結合非常緊密，在使用去垢劑破壞膜結構后才能將其分離。作為跨膜蛋白存在的內在膜蛋白結構上可分為3大結構域：胞質外結構域、跨膜結構域與胞質內結構域。目前，外泌體研究領域主要關注外泌體蛋白質的豐度和種類研究，針對外泌體膜蛋白的研究方法比較缺乏，這在一定程度上限制了科學家對外泌體膜蛋白參與的識別和靶向功能的認識。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供一種外泌體膜蛋白的標記以及純化方法，以解決上述現有技術存在的問題。

2、為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

3、本發明技術方案之一，一種外泌體膜蛋白的標記以及純化方法，包括以下步驟：

4、利用n-羥基磺基琥珀酰亞胺酯生物素標記外泌體膜蛋白，再利用超速離心方法去除游離的生物素，接著對外泌體進行裂解，最后利用鏈霉親和素瓊脂糖凝膠對被標記的外泌體膜蛋白進行純化。

5、基于上述技術方案，本發明具有以下技術效果：

6、(1)外泌體膜表面蛋白的研究對于理解其生物學功能和開發新型診斷及治療策略具有重要意義。然而，目前缺乏針對外泌體膜蛋白分離純化的有效技術方案，因此本發明提出了一種外泌體膜蛋白生物素標記純化外泌體膜蛋白的技術方法。生物素標記濃度對實驗結果的影響尤為顯著：低濃度的生物素標記無法完全標記外泌體膜表面蛋白，導致標記不充分；而過高濃度的生物素標記則可能帶來膜蛋白結果的假陽性。因此，制定合適的標記與純化方案對于后續膜蛋白研究至關重要，能夠確保實驗結果的準確性。

7、(2)sulfo-nhs-biotin通過其磺酸基nhs活性酯與蛋白質中的伯胺基團(-nh2)發生特異性反應，實現對蛋白質的生物素化標記。該過程在生理至弱堿性緩沖液(ph?7-9)中進行，形成穩定的酰胺鍵。由于其水溶性和膜不滲透性，sulfo-nhs-biotin特別適用于表面蛋白的標記。標記后的蛋白質可以通過生物素親和的鏈霉親和素分離柱進行有效分離。該分離柱利用鏈霉親和素與生物素之間的高親和力，將生物素化的蛋白質從混合物中捕獲。純化后的蛋白質可用于后續的分析和功能研究。sulfo-nhs-biotin的高效標記和生物素親和分離柱的純化能力，使得外泌體膜表面蛋白的標記和純化過程更加精確和高效。這為后續的膜表面蛋白研究提供了可靠的基礎，有助于深入理解外泌體在細胞間通訊中的作用。

技術特征：

1.一種外泌體膜蛋白的標記以及純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據權利要求1所述的標記以及純化方法，其特征在于，所述利用n-羥基磺基琥珀酰亞胺酯生物素標記外泌體膜蛋白的方法為：向外泌體溶液中加入nhs-biotin進行標記。

3.根據權利要求2所述的標記以及純化方法，其特征在于，所述利用n-羥基磺基琥珀酰亞胺酯生物素標記外泌體膜蛋白的反應溫度為室溫，反應時間為10min；所述外泌體溶液的濃度為1×1011個/ml；所述nhs-biotin的用量為1.5mg/ml。

4.根據權利要求2所述的標記以及純化方法，其特征在于，還包括加入終止反應液終止反應的步驟。

5.根據權利要求1所述的標記以及純化方法，其特征在于，所述對外泌體進行裂解的方法為：向外泌體中加入100x蛋白酶抑制劑，稀釋至1x，再加入10x?ripa溶液進行裂解。

6.根據權利要求1所述的標記以及純化方法，其特征在于，所述利用鏈霉親和素瓊脂糖凝膠對被標記的外泌體膜蛋白進行純化的方法為：在層析柱中填入450μl生物素親和瓊脂糖樹脂，在1000g下離心層析柱后，向凝膠中加入500μlpbs，并在1000×g下離心1分鐘，重復此步驟兩次；

技術總結
本發明公開了一種外泌體膜蛋白的標記以及純化方法，屬于膜蛋白技術領域。包括以下步驟：利用N?羥基磺基琥珀酰亞胺酯生物素標記外泌體膜蛋白，再利用超速離心方法去除游離的生物素，接著對外泌體結構進行裂解，最后利用鏈霉親和素瓊脂糖凝膠對被標記的外泌體膜蛋白進行純化。本發明提出了一種創新的外泌體膜蛋白標記分離純化的實驗方案。首先，利用N?羥基磺基琥珀酰亞胺酯生物素與外泌體表面膜蛋白的伯胺基(?NH<subgt;2</subgt;)高效反應形成穩定的酰胺鍵標記外泌體膜表面蛋白，再利用超速離心方法去除游離的生物素，接著利用生物素親和鏈霉親和素高效結合進行被標記的膜蛋白提純，純化樣品可用于蛋白質質譜分析或其它分子生物學功能研究。

技術研發人員：王義峰,王浩堅,廖柳房,張禧龍,羅德華,龔蘇淇,姚明洋,羅群,柯欣榮
受保護的技術使用者：廣州醫科大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28