本發明涉及生物醫藥檢測，具體涉及一種抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體及其制備方法，還涉及該納米抗體在制備用于檢測幽門螺旋桿菌的產品中的應用。

背景技術：

1、幽門螺桿菌(helicobacter?pylori,h.pylori,hp)是一種定植于胃內，具有螺旋狀結構的微需氧革蘭陰性菌，1982年被首次發現，hp感染與多種疾病密切相關，包括慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、胃癌等消化系統疾病，以及血液系統、神經系統、心血管系統、皮膚、眼科等消化系統外疾病。目前，亟需能夠克服幽門螺桿菌耐藥性的新治療藥物，而準確診斷hp感染對進一步治療是很有必要的。目前幽門螺旋桿菌的檢測主要是碳13或碳14元素檢測、或經胃鏡取胃黏膜快速尿素酶測試及病理活檢等方式。因此，針對hp開發新的可靠便捷的診斷試劑有望成為預防和控制hp感染的有效手段。

2、hp感染的關鍵步驟之一是細菌黏附素蛋白a(hpaa)與胃上皮細胞上的受體結合。其在hp感染過程中發揮重要作用，它不僅有助于細菌在胃黏膜上定植，還能增強細菌的致病性。納米抗體(nanobodies，nbs)是在駱駝科動物和鯊魚中發現的一種獨特的單域抗體，即重鏈抗體可變區(variabledomain?of?the?heavy?chain?of?heavy-chain?antibody，vhh)，具有很強的抗原靶向性和結合能力，以及突出的致密組織穿透性，高特異性、高親和力、和高穩定性，基于納米抗體的眾多優勢，從而非常適合診斷試劑盒的開發、靶向給藥及中和抗體治療等研究。

3、本發明針對解決傳統抗體的存在的問題，第一個目的就是聚焦hpaa靶點篩選出了6株納米抗體，可用于開發高靈敏度和高特異性的檢測方法，第二個目的提供用于幽門螺旋桿菌檢測納米抗體的制備方法，第三個目的提供幽門螺旋桿菌抗hpaa納米抗體的用途。

技術實現思路

1、1、有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體；本發明的目的之二在于提供一種融合蛋白；本發明的目的之三在于提供一種編碼所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體的核酸序列；本發明的目的之四在于提供一種制備所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體的方法；本發明的目的之五在于提供一種檢測幽門螺旋桿菌的產品；本發明的目的之六在于提供所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體或所述融合蛋白在制備用于檢測幽門螺旋桿菌的產品中的應用。

2、為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

3、1、一種抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體，其特征在于：其氨基酸序列如氨基酸序列如seq?id?no.3、seq?id?no.5、seq?id?no.7、seq?id?no.9、seq?id?no.11或seqidno.13所示。

4、2、一種融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體和辣根過氧化物酶的氨基酸序列。

5、3、編碼所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體的核酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如seq?id?no.2、seq?id?no.4、seq?id?no.6、seq?id?no.8、seq?id?no.10或seqidno.12所示。

6、4、一種制備所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體的方法，其特征在于：主要包括以下步驟：

7、(1)優化并合成編碼hpaa的dna序列，構建原核表達載體，在大腸桿菌表達后，提取得到重組hpaa抗原蛋白；用重組hpaa抗原蛋白免疫駱駝后，采集駱駝的外周血用于分離淋巴細胞，然后用elisa檢測駱駝免疫后抗原特異性應答水平；

8、(2)取駱駝外周血淋巴細胞，用于總rna的提取并反轉錄的得到cdna，以cdna作為模版進行pcr反應擴增抗體的vhh區，擴增產物連接到噬菌體展示載體上，電轉化入大腸桿菌建立噬菌體展示文庫，通過抗原孵育和elisa鑒定篩選出所需陽性克隆，然后對其進行測序得到hpaa納米抗體的序列；

9、(3)將hpaa納米抗體的序列構建到原核或真核表達載體上，在大腸桿菌、酵母菌或哺乳動物細胞系里進行大規模表達及純化，得到抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體。

10、在本發明的一些實施例中，步驟(1)中，所述編碼hpaa的dna序列如seq?id?no.1所示。

11、在本發明的一些實施例中，步驟(2)中，所述噬菌體展示載體為pmecs。

12、在本發明的一些實施例中，步驟(3)中，所述原核表達載體為pet-25b(+)，所述大腸桿菌為bl21(de3)。

13、在本發明的一些實施例中，步驟(3)中，所述原核表達載體為pcmv-n1-hrp，所述哺乳動物細胞系為293t細胞。

14、5、一種檢測幽門螺旋桿菌的產品，其特征在于，包含所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體或所述融合蛋白。

15、6、所述抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a納米抗體或所述融合蛋白在制備用于檢測幽門螺旋桿菌的產品中的應用。

16、本發明的有益效果在于：本課題組結合文獻調研從hp靶蛋白中選擇免疫原性強的hpaa靶點蛋白，從ncbi官網下載該蛋白序列后，通過去除信號肽分析b細胞優勢抗原分析等步驟，優化該序列，構建pet-28a-hpaa原核表達載體，轉化至大腸桿菌bl21(de3)菌株中，經iptg誘導表達純化出重組hpaa蛋白，將制備的hpaa重組蛋白用于免疫駱駝，共免疫5次，免疫時間間隔為2周一次。第1次免疫：完全弗氏佐劑，2-5次使用非完全弗氏佐劑。5次免疫完成后一周，采取駱駝外周血清，通過elisa檢測抗hpaa蛋白抗體效價，結果表明，最后一次免疫后駱駝血清中hpaa蛋白的特異性抗體效價為1:1024000，免疫效果良好，可用于下一步提取mrna，反轉錄成cdna，構建噬菌體文庫。經過兩輪pcr后成功擴增了vhh基因，雙酶切pmecs及vhh基因后連接轉化至tg1感受態細胞中，納米文庫完成構建。經過文庫計數后，得出文庫大小為8×107pfu/ml，菌液pcr鑒定文庫陽性率：隨機挑選24個菌，其中23個菌為陽性，1個為陰性，文庫陽性率為：95.8％。

17、隨機挑選24個菌株送生工公司測序后結果顯示：24個菌株序列均顯示不同，體現出文庫的多樣性。檢測納米抗體淘選過程中特異性重組噬菌體的富集情況，發現隨著淘選輪次的遞增，噬菌體回收率明顯增加；特異性噬菌體比例明顯增加；以上數據說明經過三輪淘選，特異性重組噬菌體得到了明顯富集。隨機挑選120個單克隆，擴增培養抗hpaa單克隆進行親和檢測，結果顯示120個克隆的粗提物全部與hpaa蛋白有較強反應且挑選od>1.8，且p/n>5，有24株納米抗體與hpaa蛋白結合強烈，表明篩選的納米抗體具有特異性。

18、構建重組質粒pet-25b-hpaa-nbs，轉化至bl21(de3)感受態細胞中，iptg誘導表達后收集菌體、超聲，利用ni-nta進行純化。sds-page鑒定表明經過純化后的原核hpaa-nb8，hpaa-nb9，hpaa-nb10，hpaa-nb11，hpaa-nb12和hpaa-nb15大小與預期一致(20kda左右)且經image?j軟件掃描灰度值，顯示純度高于90％，抗hpaa納米抗體純化后his標簽wb鑒定進一步驗證了納米抗體的正確表達。通過elisa檢測純化出的納米抗體和hpaa的親和力，測得6株納米抗體和hpaa結合活性較強，ec50分別為0.002694μm、0.03004μm、0.003379μm、0.01380μm、0.009783μm、0.01027μm。

19、構建納米抗體真核表達載體pcmv-n1-hpaa-nbs-hrp，將構建的質粒分別轉染至293t細胞中，72h后收集細胞上清，wb以及elisa檢測重組nbs-hrp的表達情況，結果顯示帶hrp標簽的納米抗體成功表達，并且elisa檢測重組nbs-hrp和hpaa的結合情況，顯示高親和力，可作為有效的檢測幽門螺旋桿菌探針候選。

20、本發明基于噬菌體展示技術，篩選到了6株抗幽門螺旋桿菌粘附素蛋白a(hpaa)的納米抗體，所述納米抗體能夠特異性靶向hpaa蛋白，具有分子量小、高水溶性、高耐性、高穩定性，高抗原結合性、低免疫原性等特點，并對其進行鑒定和表征，并分析了重組hpaa蛋白和納米抗體的結合位點，本發明涉及納米抗體及其制備方法和應用，該納米抗體可以應用于hpaa蛋白檢測試劑，極高的靈敏度、高特異性使納米抗體在診斷方面優勢突出。