本發(fā)明屬于蔬菜雜交種純度鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種胡蘿卜雜交種純度的鑒定方法及其使用的indel引物組合。

背景技術(shù)：

1、作為我國主要蔬菜品種之一的胡蘿卜，其種植規(guī)模與產(chǎn)量均居世界前列。據(jù)官方統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國胡蘿卜種植面積約為600萬畝，占全球種植面積的35％，年產(chǎn)量可達(dá)1800萬噸。在胡蘿卜生產(chǎn)領(lǐng)域，得益于其卓越的遺傳特性和生產(chǎn)性能，雜交種已成為主導(dǎo)力量。然而，雜交種在進(jìn)入市場之前，必須經(jīng)過嚴(yán)格的純度鑒定。依據(jù)《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》(gb/t3543.1-3543.7-1995)，胡蘿卜雜交種的純度要求需超過98％。鑒于我國胡蘿卜育種企業(yè)規(guī)模普遍較小且分布分散，種子質(zhì)量的管理成為亟待解決的問題。市場上頻繁出現(xiàn)的假冒偽劣及純度不足的胡蘿卜種子，不僅侵害了農(nóng)民的利益，也對胡蘿卜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展造成了負(fù)面影響。目前，傳統(tǒng)的田間純度檢測方法成本高昂且耗時，無法滿足現(xiàn)代種業(yè)快速發(fā)展的需求。因此，基于dna的分子檢測技術(shù)應(yīng)運而生，憑借其低成本和高效率的優(yōu)勢，迅速成為鑒定胡蘿卜雜交種純度的首選方法。通過篩選適宜的dna檢測技術(shù)分子標(biāo)記組合，能夠更精確、迅速地完成純度鑒定，有效遏制假冒偽劣種子的流通，保護(hù)農(nóng)民權(quán)益并促進(jìn)胡蘿卜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。因此，篩選出基于dna檢測技術(shù)的鑒定胡蘿卜雜交種純度的分子標(biāo)記組合顯得尤為關(guān)鍵。

2、indel(insertion-deletion)標(biāo)記即為插入缺失標(biāo)記，即相對于參考基因組而言，其它樣本的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入或刪除。indel變異在基因組分布廣泛，數(shù)量僅次于snp變異，可根據(jù)插入缺失位點兩側(cè)的序列設(shè)計特異性的indel標(biāo)記引物。與snp和ssr標(biāo)記相比，indel標(biāo)記的適用范圍更廣，普通瓊脂糖電泳平臺就可以進(jìn)行檢測，且對樣品的dna質(zhì)量要求較低，其帶型穩(wěn)定性及判讀效果也優(yōu)于ssr；具有穩(wěn)定性好、分布廣、多態(tài)性高、通用性強(qiáng)、分型系統(tǒng)簡單且成本較低等特點。

3、基于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供indel引物組合，該引物組合用于鑒定胡蘿卜雜交種純度。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供包含上述引物組合的試劑盒。

3、本發(fā)明的目的之三在于提供上述引物組合或試劑盒的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的之四在于提供一種待測胡蘿卜雜交種純度的鑒定方法。

5、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

6、本發(fā)明第一方面提供indel引物組合，包括十個引物組，分別對應(yīng)擴(kuò)增十個indel位點(或indel標(biāo)記)以分別對各個indel位點進(jìn)行基因分型或者進(jìn)行純合或雜合確定，其中：

7、所述indel位點包括：

8、indhb10位點(第一位點)：位于3號染色體上第62600640位，為核苷酸a或者為seqid?no.21所示的核苷酸序列；

9、indhb12位點(第二位點)：位于4號染色體上第24462630位，為核苷酸a或者為seqid?no.22所示的核苷酸序列；

10、indhb15位點(第三位點)：位于5號染色體上第25653852位，為核苷酸a或者為seqid?no.23所示的核苷酸序列；

11、indhb22位點(第四位點)：位于7號染色體上第37949132位，為核苷酸t(yī)或者為seqid?no.24所示的核苷酸序列；

12、indhb27位點(第五位點)：位于9號染色體上第34173400位，為核苷酸a或者為seqid?no.25所示的核苷酸序列；

13、indhb32位點(第六位點)：位于3號染色體上第62564623位，為核苷酸g或者為seqid?no.26所示的核苷酸序列；

14、indhb36位點(第七位點)：位于7號染色體上第40686460位，為核苷酸t(yī)或者為seqid?no.27所示的核苷酸序列；

15、indhb44位點(第八位點)：位于9號染色體上第6247289位，為核苷酸t(yī)或者為seqid?no.28所示的核苷酸序列；

16、indhb47位點(第九位點)：位于1號染色體上第39038965位，為核苷酸t(yī)或者為seqid?no.29所示的核苷酸序列；

17、indhb50位點(第十位點)：位于3號染色體上第4341982位，為核苷酸t(yī)或者為seqid?no.30所示的核苷酸序列；

18、所述十個indel位點在染色體上的位置是基于胡蘿卜參考基因組reference?dh1v3序列比對確定的；

19、第一引物組(引物組1)用于擴(kuò)增indhb10位點；第二引物組(引物組2)用于擴(kuò)增indhb12位點；第三引物組(引物組3)用于擴(kuò)增indhb15位點；第四引物組(引物組4)用于擴(kuò)增indhb22位點；第五引物組(引物組5)用于擴(kuò)增indhb27位點；第六引物組(引物組6)用于擴(kuò)增indhb32位點；第七引物組(引物組7)用于擴(kuò)增indhb36位點；第八引物組(引物組8)用于擴(kuò)增indhb44位點；第九引物組(引物組9)用于擴(kuò)增indhb47位點；第十引物組(引物組10)用于擴(kuò)增indhb50位點。

20、上述indel引物組合可以用于胡蘿卜雜交種純度的鑒定，基于上述indel引物組合篩選出適合鑒定待檢測胡蘿卜品種的引物組，采用篩選出的該引物組進(jìn)行pcr，pcr產(chǎn)物如果是雜合帶，則代表待測胡蘿卜品種為雜交種，如果是單一條帶，則代表待測胡蘿卜品種不是雜交種，可能是親本之一，比如親本與雜交種混雜了。

21、本發(fā)明所述雜交種指雜交一代種，其純度可能受到親本混入或混雜的影響。

22、進(jìn)一步地，所述indel引物組合中，

23、所述第一引物組由seq?id?no.1所示的正向引物f1、和seq?id?no.2所示的反向引物r1組成；

24、所述第二引物組由seq?id?no.3所示的正向引物f2、和seq?id?no.4所示的反向引物r2組成。

25、所述第三引物組由seq?id?no.5所示的正向引物f3、和seq?id?no.6所示的反向引物r3組成。

26、所述第四引物組由seq?id?no.7所示的正向引物f4、和seq?id?no.8所示的反向引物r4組成。

27、所述第五引物組由seq?id?no.9所示的正向引物f5、和seq?id?no.10所示的反向引物r5組成。

28、所述第六引物組由seq?id?no.11所示的正向引物f6、和seq?id?no.12所示的反向引物r6組成。

29、所述第七引物組由seq?id?no.13所示的正向引物f7、和seq?id?no.14所示的反向引物r7組成。

30、所述第八引物組由seq?id?no.15所示的正向引物f8、和seq?id?no.16所示的反向引物r8組成。

31、所述第九引物組由seq?id?no.17所示的正向引物f9、和seq?id?no.18所示的反向引物r9組成。

32、所述第十引物組由seq?id?no.19所示的正向引物f10、和seq?id?no.20所示的反向引物r10組成。

33、進(jìn)一步地，所述indel引物組合由所述引物組1、所述引物組2、所述引物組3、所述引物組4、所述引物組5、所述引物組6、所述引物組7、所述引物組8、所述引物組9和所述引物組10組成。

34、本發(fā)明第二方面提供一種包含上述第一方面的indel引物組合的試劑盒。

35、所述試劑盒除了包含引物組合以外，還可以包含pcr用輔助試劑，比如超純水、pcr緩沖液、dntp以及dna聚合酶等，還可以包括進(jìn)行pcr的常規(guī)實驗器材。

36、上述引物組中，在進(jìn)行pcr時，名稱中含有“f”的引物與名稱中含有“r”的引物的摩爾比具體可為1:1。

37、本發(fā)明第三方面提供上述第一方面indel引物組合或者上述第二方面試劑盒在鑒定胡蘿卜雜交種純度方面的應(yīng)用。

38、本發(fā)明第四方面提供一種待測胡蘿卜雜交種純度的鑒定方法，包括如下步驟：

39、(1)隨機(jī)抽取n株待測胡蘿卜雜交種并獲取其基因組dna；

40、(2)分別以從步驟(1)獲得的n株待測胡蘿卜雜交種中選取的至少8株(如10株、12株、15株或20株)待測胡蘿卜雜交種的基因組dna為模板，分別采用上述第一方面提供的所述indel引物組合中第一至第十引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到相應(yīng)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

41、(3)對步驟(2)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果分別統(tǒng)計第一至第十引物組的雜合條帶的株數(shù)；然后選取雜合條帶株數(shù)相對多(比如株數(shù)在5以上、株數(shù)次最多、株數(shù)最多)且清晰的引物組作為目的引物組；

42、(4)分別以步驟(1)獲得的n株待測胡蘿卜雜交種的基因組dna為模板，分別采用步驟(3)獲得的目的引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到不同目的引物組擴(kuò)增下各株待測胡蘿卜雜交種的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；

43、(5)對步驟(4)得到的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果分別統(tǒng)計各個目的引物組擴(kuò)增產(chǎn)物中具有雜合條帶的株數(shù)，其中具有雜合條帶的待測胡蘿卜株系為雜交種，根據(jù)各個目的引物組擴(kuò)增下具有雜合條帶的株數(shù)獲得待測胡蘿卜雜交種的純度。

44、本發(fā)明第四方面方法中，由步驟(3)確定的目的引物組可以是1個也可以是2個或更多個，當(dāng)存在多個目的引物組時，可以采用多個目的引物組獲得的雜交種純度來確定待測胡蘿卜雜交種的最終純度，具體為：

45、統(tǒng)計各個目的引物組顯示雜合條帶的株數(shù)和無條帶的株數(shù)，分別計算各個目的引物組得到的待測胡蘿卜雜交種的純度，之后求平均值；

46、某一目的引物組得到的純度＝某一目的引物組顯示雜合條帶的株數(shù)/(n-該目的引物組無條帶的株數(shù))×100％。

47、作為上述方法中一種可選的實施方式，所述的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體可為：5μl模板dna(50ng/μl)、10μl?2×mix、1μl的正向引物和1μl的反向引物(20μmol/l)、3μl超純水。所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序具體可為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

48、上述所述的方法中，n的數(shù)值越大，鑒定待測胡蘿卜雜交種純度的準(zhǔn)確性越高，比如n≥80、100、120、150或者200。

49、進(jìn)一步地，本發(fā)明第四方面的所述待測胡蘿卜雜交種與第三方面的所述胡蘿卜雜交種均選自紅都107、納愛斯、大荔、紫霞、紫龍胡蘿卜、紅都345、黑色星云胡蘿卜、紫譽(yù)199、23-864、紅芯七寸參、靖遠(yuǎn)、卡洛斯、h1502、中譽(yù)2048、宇宙紫胡蘿卜、中譽(yù)1182、美人指胡蘿卜、明珠珍品、世農(nóng)春95、朝日五寸參、早春95、利嘉吉美、瑪麗特、陜西透心紅、中譽(yù)1504、中譽(yù)1877、23-1094、水果胡蘿卜、哈瑪、丹尼斯、早生紅冠、莊2203、mini?cxpress、h20181、紅彩五寸、全紅191-3、betarichi、中譽(yù)181、時nashi五寸2、黃帝九寸、極早生三寸人參、時nashi五寸1、四川紅心胡蘿卜、黃劍一號胡蘿卜、纖指一號胡蘿卜、齊頭黃胡蘿卜、紅圣4號、皇家紅、紅天下、金紅大根、全紅14、全紅785、喜豐二號、金美、耐抽日本、ca-86、ca-137、改良黑田人參、雷川紅、22-621、彩虹、日本黑田五寸參、小頂八寸參、福美紅、紫色人參、孟德爾、中譽(yù)1729、中譽(yù)1749、紫譽(yù)212、京譽(yù)189、23-1096、日本改良七寸參、紅圣九號、wc-1803、904、惠麗、吉祥、如意、莊2201、洋中寶、黑田五寸人參、中譽(yù)1870、華譽(yù)388、歐防一號胡蘿卜、23-881、盛紅601、紅圣五號、wc-2302、黃石、新黑田五寸、向陽二號、紅譽(yù)7寸、22-779、貝卡。

50、上述胡蘿卜雜交種或待測胡蘿卜雜交種均為市售品種。上述胡蘿卜雜交品種中，本發(fā)明第一方面提到的十個indel位點中的至少一個是雜合型，多的達(dá)到8個indel位點都是雜合型，本發(fā)明提供的indel引物組合可以用于上述胡蘿卜雜交品種的純度鑒定。當(dāng)然，本發(fā)明并不限制待檢測胡蘿卜雜交種的品種。

51、需要說明的是，本發(fā)明聚焦于胡蘿卜雜交種的純度保障，特指雜交一代種，其核心挑戰(zhàn)在于避免親本混雜而非機(jī)械混雜，即非由多種胡蘿卜雜交種簡單混合而成。

52、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

53、本發(fā)明提供的indel引物組合以及純度的鑒定方法實現(xiàn)了現(xiàn)有代表性胡蘿卜雜交種在種子或幼苗期的早期鑒定，簡化了鑒定周期，提高了效率，在確保雜交種純度的同時還有效維護(hù)生產(chǎn)者和育種家的合法權(quán)益，為胡蘿卜雜交種的市場和品質(zhì)管理提供了技術(shù)支持。本發(fā)明提供的方法具有高通量、準(zhǔn)確、低成本、操作簡單、節(jié)約人力、物力等優(yōu)點，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。