本發明涉及具有模擬過氧化物酶特性的鉑-磺化石墨烯復合納米材料，屬于納米技術和仿生技術領域。

背景技術：

天然酶主要是蛋白質，少量為核酸，是在維持生物的生命活動和化學反應等基本過程中發揮重要作用的物質。由于酶對底物結合的特異性及其高效的催化活性使得其在各個領域備受關注。然而，天然酶來源有限，提純復雜困難，保存條件苛刻，操作過程中易受多種物理、化學環境影響導致變性失活等諸多弊端限制了天然酶的應用。具有天然酶相似功能的人工模擬酶恰恰能夠克服天然酶上述的缺點，并且在熱穩定性、制備成本、催化活性、生物檢測等方面展現出巨大的優勢。因此，人工模擬酶的研究開發與應用越來越多的受到人們的重視。

過氧化物酶一般是催化過氧化氫或其他過氧化物，表現為易對多種有機物或無機物產生氧化作用。在過氧化物酶研究中，研究最為廣泛的是具有模擬過氧化物酶活性的碳納米材料。由于碳納米材料的低成本，易大規模生產，可長期存儲以及在惡劣環境中保持高度穩定性等優點，使其被廣泛應用于環境檢測和生物醫學等領域。目前，石墨烯、氧化石墨烯、碳納米管、碳量子點、石墨烯量子點等均被報道具有過氧化物模擬酶活性，但相比于自然酶，這些碳材料的低催化性能限制了其應用。

納米級別的鉑粒子具有獨特的物理和化學性質，被廣泛地應用于生物傳感器、光化學與電化學催化、半導體熒光探針、光電子器件等領域。近年來，研究者們致力研究鉑納米粒子穩定劑以克服其在溶液中的低分散性、易產生團聚沉降現象、電子傳遞途徑易被部分阻斷及表面活性位點易被掩蓋等缺陷。現已報道的鉑納米粒子穩定劑有水溶性小分子化合物檸檬酸鈉、烷基胺、乙二醇，水溶性聚合物聚乙烯吡咯烷酮、聚（酰胺-胺）、聚（丙烯酸），蛋白質類牛血清白蛋白、去鐵鐵蛋白、溶菌酶，碳材料碳納米、氧化石墨烯、還原氧化石墨烯等。用上述穩定劑制備的復合材料在一定程度上克服了鉑納米粒子本身存在的一些缺陷，但是其合成過程操作復雜、耗費試劑多且制備時間長，或降低了原本鉑納米粒子的催化活性。因此，尋求快速、簡便的制備方法獲得高穩定性、高活性的鉑納米材料具有重大意義。

本發明利用磺化石墨烯作為支撐載體，通過硼氫化鈉還原合成的方法，制備磺化石墨烯-納米鉑復合材料，該復合材料對底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺（TMB）和過氧化氫（H₂O₂）同時具有高親和力。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種以磺化石墨烯為基底，通過硼氫化鈉還原法合成鉑納米粒子-磺化石墨烯復合材料，利用鉑納米粒子-磺化石墨烯復合材料的優良催化特性模擬過氧化物酶。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明所述的鉑-磺化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，其特征是鉑-磺化石墨烯復合納米材料具有過氧化物酶特性，催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色；所述的鉑-磺化石墨烯復合納米材料由以下方法制備的：往12.559 mL濃度為2.389 mg/mL的磺化石墨烯溶液中加入1.796 mL濃度7.9 mmol/L的氯鉑酸水溶液，混勻劇烈攪拌15分鐘后，逐滴加入0.645 mL濃度為2.5 mg/mL硼氫化鈉水溶液，攪拌4小時后即得鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，真空干燥后得到鉑-磺化石墨烯復合納米材料粉末。

所述磺化石墨烯的制備方法為：將Hummers法制備出的氧化石墨烯分散于去離子水中，超聲處理3小時得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系，往氧化石墨烯分散體系加入5wt%碳酸鈉溶液，使得體系pH值為9~10，然后加入30 mL濃度為 0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌反應1小時，8000轉/分鐘離心后用水洗滌沉淀，得到中性的還原氧化石墨烯，將還原氧化石墨烯分散于去離子水中，得到還原氧化石墨烯懸浮液75 mL，再將對氨基苯磺酸重氮鹽加入到還原氧化石墨烯懸浮液中并在冰浴條件下攪拌反應2小時，離心后用雙蒸水洗滌沉淀至pH值為7，得到呈中性的耦合物，將上述所得的耦合物分散于150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，在100 ℃下攪拌24小時進行還原反應，然后滴加5 wt %碳酸鈉溶液沉淀磺化石墨烯，將上述制得的磺化石墨烯用雙蒸水進行徹底洗滌，然后將磺化石墨烯在一定溫度下進行真空干燥，得到磺化石墨烯固體，取119.45 mg磺化石墨固體溶解于50 mL雙蒸水，常溫下超聲5小時，充分剝離后得到2.389 mg/mL透明澄清的棕黑色磺化石墨烯水溶液。

所述鉑-磺化石墨烯復合納米材料中鉑納米粒子的平均粒徑為7.5 nm，鉑元素以0價和+4價兩種形式存在。

催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽生成藍色產物，該產物在652 nm處有最大吸收峰。

鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽反應體系的最佳條件為：pH為5.0，溫度為37 ℃，鉑-磺化石墨烯復合納米材料的用量為1.125 μg/mL，3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽的濃度為0.338 mmol/L，反應時間為10 min。

鉑-磺化石墨烯復合納米材料對3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽的米氏常數為0.06244 mmol/L，對過氧化氫的米氏常數為47.76 mmol/L。

鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽的顯色產物吸光值與0.01~1 mmol/L濃度范圍內的過氧化氫呈線性關系，檢測限為0.0025 mmol/L。

本發明所述的鉑-磺化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶，具體技術方案為：

（一）磺化石墨烯的制備：首先，將Hummers法制備出的氧化石墨烯分散于去離子水中，超聲處理3小時得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯分散體系加入5%碳酸鈉溶液，使得體系pH值為9~10，然后加入30 mL濃度為 0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌反應1小時，8000轉/分鐘離心后用水洗滌沉淀，得到中性的還原氧化石墨烯。將還原氧化石墨烯分散于去離子水中，得到還原氧化石墨烯懸浮液75 mL，再將對氨基苯磺酸重氮鹽加入到還原氧化石墨烯懸浮液中并在冰浴條件下攪拌反應2小時，離心后用雙蒸水洗滌沉淀至pH值為7，得到呈中性的耦合物。將上述所得的耦合物分散于150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，在100 ℃下攪拌24小時進行還原反應，然后滴加5%碳酸鈉溶液沉淀磺化石墨烯，將上述制得的磺化石墨烯用雙蒸水進行徹底洗滌，然后將磺化石墨烯在一定溫度下進行真空干燥，得到磺化石墨烯固體。取119.45 mg磺化石墨固體溶解于50 mL雙蒸水，常溫下超聲5小時，充分剝離后得到2.389 mg/mL透明澄清的棕黑色磺化石墨烯水溶液。

（二）鉑-磺化石墨烯復合納米材料的制備：

往12.559 mL濃度為2.389 mg/mL的磺化石墨烯溶液中加入1.796 mL濃度7.9 mmol/L的氯鉑酸水溶液，混勻劇烈攪拌15分鐘后，逐滴加入0.645 mL濃度為2.5 mg/mL硼氫化鈉水溶液，攪拌4小時后即得鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液。所負載的納米鉑粒子平均粒徑為7.5 nm，4 ℃保存，能保持2個月以上的相對穩定。以上過程中使用的所有玻璃器皿均經過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。

（三）鉑-磺化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶活性：

通過鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽（TMB）產生藍色底物，驗證和比較其過氧化物酶活性。在磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中依次加入過氧化氫、3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后溫浴10分鐘，肉眼觀察顏色的變化或測定652 nm波長處的吸光度值。根據溶液顏色或通過測定吸光度值進行比較過氧化物酶活性。

（四）鉑-磺化石墨烯復合納米材料模擬過氧化物酶檢測過氧化氫：

通過鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽產生藍色底物，檢測低濃度過氧化氫。最優條件下，在磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中依次加入過氧化氫、3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后溫浴10分鐘，測定652 nm波長處的吸光度值。通過吸光度值標準曲線對過氧化氫濃度進行定量。

本發明的優點：

（1）本發明所得到的鉑-磺化石墨烯復合納米材料穩定性好且制備方法簡單。

（2）本發明鉑-磺化石墨烯復合納米材料具有良好的過氧化物酶活性。

（3）本發明鉑-磺化石墨烯復合納米材料對底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽的親和力高。

（4）本發明鉑-磺化石墨烯復合納米材料能定量檢測過氧化氫，檢測限低，靈敏度高。

附圖說明

圖1為鉑-磺化石墨烯復合納米材料透射電子顯微鏡圖。

圖2為鉑-磺化石墨烯復合納米材料鉑元素的X射線光電子能譜圖。

圖3為鉑-磺化石墨烯復合納米材料的X射線衍射圖。

圖4為鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系的顏色變化圖。從左到右依次為TMB+H₂O₂溶液、磺化石墨烯+TMB+H₂O₂溶液、鉑-磺化石墨烯復合納米材料+TMB+H₂O₂溶液，溶液由無色變為藍色。

圖5為鉑-磺化石墨烯復合納米材料終濃度對催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系的影響圖。

圖6為pH值對鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系的影響圖。

圖7為溫浴溫度對鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系的影響圖。

圖8為3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽濃度對鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系的影響圖。

圖9為反應時間對鉑-磺化石墨烯復合納米材料催化過氧化氫氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系的影響圖。

圖10為鉑-磺化石墨烯復合納米材料對于3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽的穩態動力學曲線圖。

圖11為鉑-磺化石墨烯復合納米材料對于過氧化氫的穩態動力學曲線圖。

圖12為鉑-磺化石墨烯復合納米材料檢測過氧化氫標準曲線圖。

具體實施方式

實例1：

Hummers法制備氧化石墨烯：稱取325目鱗片石墨2.7 g，加入到316 mL濃度為18.4 mol/L的濃硫酸和36 mL濃度為14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分攪拌后，置于在0 ℃冰浴中。將16.2 g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 ℃冰浴，磁力攪拌3小時后，將所得墨綠混懸液轉移至35 ℃溫水浴中，控溫1小時，然后將所得墨綠混懸液轉移至50 ℃溫水浴中，控溫12小時得到紫黑色混懸液混合物。360 mL冰水緩慢加入到得到的紫黑色混懸液混合物中，劇烈攪拌1小時。繼而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%過氧化氫溶液，溶液顏色突變為亮黃色，攪拌30 分鐘。所得溶液經G1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過濾，繼而4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液；加入180 mL 超純水充分振蕩洗滌，4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入180 mL 30wt% 鹽酸充分振蕩洗滌，經G1砂芯漏斗（孔徑20-30微米）過濾去除不溶顆粒，濾液4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色繼續加深；接著多次用無水乙醇將沉淀物洗至pH值為中性，4000 轉每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀呈棕黃色；最后用乙醚沖洗沉淀，經G5砂芯漏斗（孔徑1.5-2.5微米）過濾。濾餅在室溫下過夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。

實例2：

對氨基苯磺酸重氮鹽制備：在裝有冷凝管、攪拌器、滴液漏斗和溫度計的150 mL四頸瓶中放入10 mL 5 wt%碳酸鈉溶液及2.1 g對氨基苯磺酸晶體，攪拌下溫熱使其溶解，再加入0.8 g亞硝酸鈉與6 mL水配成的溶液，用冰浴冷至0~5 ℃。在不斷攪拌下，將3 mL濃鹽酸與10 mL水配成的溶液滴入上述混合溶液中，在冰浴中繼續攪拌15 min，得到對氨基苯磺酸重氮鹽。

實例3：

將Hummers法制備出的氧化石墨烯分散于去離子水中，超聲處理3小時得到4 mg/mL氧化石墨烯的分散體系。往氧化石墨烯分散體系加入5wt%碳酸鈉溶液，使得體系pH值為9~10，然后加入30 mL濃度為 0.16 g/mL 硼氫化鈉溶液，在80 ℃下攪拌反應1小時，8000轉/分鐘離心后用水洗滌沉淀，得到中性的還原氧化石墨烯。將還原氧化石墨烯分散于去離子水中，得到還原氧化石墨烯懸浮液75 mL，再將對氨基苯磺酸重氮鹽加入到還原氧化石墨烯懸浮液中并在冰浴條件下攪拌反應2小時，離心后用雙蒸水洗滌沉淀至pH值為7，得到呈中性的耦合物。將上述所得的耦合物分散于150 mL去離子水中，加入10 mL濃度為1.6 g/mL水合肼，在100 ℃下攪拌24小時進行還原反應，然后滴加5 wt %碳酸鈉溶液沉淀磺化石墨烯，將上述制得的磺化石墨烯用雙蒸水進行徹底洗滌，然后將磺化石墨烯在60 ℃下進行真空干燥，得到磺化石墨烯固體。取119.45 mg磺化石墨固體溶解于50 mL雙蒸水，常溫下超聲5小時，充分剝離后得到2.389 mg/mL透明澄清的棕黑色磺化石墨烯水溶液。

實例4：

往12.559 mL濃度為2.389 mg/mL的磺化石墨烯溶液中加入1.796 mL濃度7.9 mmol/L的氯鉑酸水溶液，混勻劇烈攪拌15分鐘后，逐滴加入0.645 mL濃度為2.5 mg/mL硼氫化鈉水溶液，攪拌4小時后即得鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液。一定溫度下真空干燥后得到鉑-磺化石墨烯復合納米材料粉末。

實例5：

將實施例4所制得的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液滴涂到銅網上，進行透射電子顯微鏡測試，結果表明鉑-磺化石墨烯復合納米材料中鉑納米粒子的平均粒徑為7.5 nm（見圖1）。

實例6：

取一定量實施例4所制得的鉑-磺化石墨烯復合納米材料粉末，進行X射線光電子能譜測試，結果表明鉑-磺化石墨烯復合納米材料中鉑元素以0價和+4價兩種形式存在（見圖2）。

實例7：

取一定量實施例4所制得的鉑-磺化石墨烯復合納米材料粉末，進行X射線衍射測試。如圖3所示，2θ=40.08o、46.02o和60.27o處為鉑的特征峰，分別對應鉑的（111）、（200）和 （220）晶面；2θ=24.1o處為磺化石墨烯的特征峰。

實例8：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL濃度為0.1 mmol/L的過氧化氫、0.04 mL濃度為16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37 ℃溫浴10分鐘，溶液由無色變為藍色。當不加鉑-磺化石墨烯復合納米材料或加入磺化石墨烯溶液時，反應體系不發生顏色反應（見圖4）。

實例9：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL濃度為0.1 mmol/L的過氧化氫、0.04 mL濃度為16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL不同濃度的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37℃溫浴10分鐘，測定652 nm波長處吸光度。如圖5所示，顯色產物的吸光度隨著鉑-磺化石墨烯復合納米材料終濃度增大而增大，但當鉑-磺化石墨烯復合納米材料的濃度達到1.125 μg/mL后，體系的吸光值趨于平緩，故選擇鉑-磺化石墨烯復合納米材料的最佳用量為1.125 μg/mL。

實例10：

在pH值分別為3、4、4.5、5、5.5、6、7、8的1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（200 mmol/L）中依次加入0.18 mL濃度為0.1 mmol/L的過氧化氫、0.04 mL濃度為16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37 ℃溫浴10分鐘，測定652 nm波長處吸光度。鉑-磺化石墨烯復合納米材料的相對催化活性在磷酸鹽緩沖液pH值為4.5~5.0時達到最大（見圖6），故選擇反應體系的最佳pH值為5.0。

實例11：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL濃度為0.1 mmol/L的過氧化氫、0.04 mL濃度為16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后在不同溫度10℃、20℃、30℃、37℃、45℃、50℃、60℃溫浴10分鐘，測定652 nm波長處吸光度。如圖7所示，在溫度10~37℃間，吸光度值緩慢增大，當溫度高于37℃時，吸光值則出現明顯的下降趨勢，故選擇反應體系的最佳溫度為37℃。

實例12：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL濃度為0.1 mmol/L的過氧化氫、0.04 mL不同濃度的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37℃溫浴10分鐘，測定652 nm波長處吸光度。如圖8所示，顯色產物的吸光度隨著3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽終濃度增大而增大，當濃度達到0.338 mmol/L后吸光度幾乎不再增大，故反應體系的最佳TMB濃度為0.338 mmol/L。

實例13：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL濃度為0.1 mmol/L的過氧化氫、0.04 mL濃度為16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37℃溫浴反應，測定不同時間下652 nm波長處吸光度。如圖9所示，隨著反應時間的延長，吸光度值逐漸增大，在反應時間達10 min之后，吸光度值變化緩慢，故選擇反應體系的最佳反應時間為10 min。

實例14：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL濃度為0.1 mmol/L的過氧化氫、0.04 mL不同濃度的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37℃溫浴反應1分鐘，測定652 nm波長處吸光度，計算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出鉑-磺化石墨烯復合納米材料對底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽的米氏常數為0.06244 mmol/L（見圖10）。

實例15：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL不同濃度的過氧化氫、0.04 mL濃度為16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37℃溫浴反應1分鐘，測定652 nm波長處吸光度，計算初速度。通過米氏方程擬合，可以得出鉑-磺化石墨烯復合納米材料對底物過氧化氫的米氏常數為47.76 mmol/L（見圖11）。

實例16：

在1.74 mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5，200 mmol/L）中依次加入0.18 mL不同濃度的過氧化氫、0.04 mL濃度為16.9 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽和40 μL濃度為1.125 μg/mL的鉑-磺化石墨烯復合納米材料水溶液，混合后37℃溫浴反應10分鐘，測定652 nm波長處吸光度。過氧化氫濃度在0.01~1 mmol/L范圍內，顯色產物的吸光度與過氧化氫濃度呈線性相關（r=0.997），式中r指相關系數，檢測限為0.0025 mmol/L（見圖12）。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改，等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。