本發(fā)明涉及分析檢測，尤其是涉及一種用于同步檢測兒茶酚胺及其代謝物的試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

1、兒茶酚胺ca是一類含有兒茶酚和胺基的神經(jīng)類物質(zhì)，是人體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，具有較強(qiáng)的生理學(xué)活性。兒茶酚胺及代謝產(chǎn)物濃度檢測主要測定腎上腺素e、去甲腎上腺素ne和多巴胺da及其中間代謝產(chǎn)物甲氧基腎上腺素mn、甲氧基去甲腎上腺素nmn、3-甲氧酪胺3-mt、和終末代謝產(chǎn)物香草扁桃酸vma、?高香草酸hva。兒茶酚胺及其代謝物的極性較大、結(jié)構(gòu)相近，而且在生物樣品中含量較低、干擾較大，檢測難度大。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法lc-ms/ms因其靈敏度高,特異度強(qiáng),能進(jìn)行大量樣本的快速篩選,目前已成為檢測ca及代謝產(chǎn)物的主要方法并被指南和共識所推薦。

2、對于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，合適的前處理方法至關(guān)重要。由于兒茶酚胺及其代謝物在血漿中的濃度極低，通常在進(jìn)行前處理時采用固相萃取法進(jìn)行樣品濃縮處理。固相萃取技術(shù)的核心是填料，選擇對目標(biāo)物具有適中吸附性的spe填料是確保檢測準(zhǔn)確的前提。兒茶酚胺及其代謝物都屬于單胺類物質(zhì)，具有氨基基團(tuán)，而存在于尿液中的兒茶酚胺的終末代謝產(chǎn)物香草扁桃酸、?高香草酸具有較強(qiáng)的羧基基團(tuán)，目前商品化的兒茶酚胺固相萃取填料只能對同一性質(zhì)的一類化合物進(jìn)行吸附，市面上要完整的測定8種兒茶酚胺及其代謝物至少需要兩種不同類型的試劑盒進(jìn)行前處理，既費時又費力。市場上還沒有合適的試劑盒可以對8種兒茶酚胺及其代謝物進(jìn)行一次性分離提取，這嚴(yán)重制約了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測兒茶酚胺及其代謝物的效率。因此，開發(fā)一種既能實現(xiàn)一次性同步分離并檢測尿液中8種兒茶酚胺及其代謝物，又可以對血液中6種兒茶酚胺及其代謝物進(jìn)行檢測的試劑盒具有十分重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于同步檢測兒茶酚胺及其代謝物的試劑盒及檢測方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的對尿液樣本中兒茶酚胺及其代謝物檢測的效率不高，準(zhǔn)確度較低的技術(shù)問題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種用于同步檢測兒茶酚胺及其代謝物的試劑盒，含有稀釋劑、固相萃取試劑、lc-ms/ms檢測試劑、固相萃取裝置、固相萃取填料；

3、所述固相萃取填料為雙性離子交換微球；

4、所述雙性離子交換微球含有羧基官能團(tuán)和季銨基官能團(tuán)；

5、所述雙性離子交換微球因為同時含有羧基官能團(tuán)和季銨基官能團(tuán)，所以具備同時分離酸性分析物和堿性分析物的性能，可以同時對尿液中含有的6種堿性兒茶酚胺及其代謝物、2種酸性兒茶酚胺的終末代謝物進(jìn)行一次性分離，有利于簡化分離檢測步驟，提高檢測的效率；

6、所述固相萃取試劑包括活化液、平衡液、淋洗液、洗脫液、復(fù)溶液；

7、所述lc-ms/ms檢測試劑包括標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、內(nèi)標(biāo)工作液、流動相。

8、進(jìn)一步地，所述雙性離子交換微球的羧基官能團(tuán)密度為1mmol/g-5mmol/g；季銨基官能團(tuán)密度為0.5mmol/g-2mmol/g；孔徑為1nm-50nm;粒徑為10μm?-300μm，優(yōu)選為30μm-60μm；

9、通過選取適當(dāng)羧基官能團(tuán)密度、季銨基官能團(tuán)密度、孔徑和粒徑的雙性離子交換微球，可以更加有針對性的提高試劑盒的檢測靈敏度。由于尿液中兒茶酚胺及其代謝物的濃度范圍通常在μg級別，而血液中兒茶酚胺及其代謝物的濃度范圍一般較低，只有pg級別，選擇適當(dāng)?shù)碾p性離子交換微球作為固相萃取的填料，對提高血液樣品的檢測靈敏度有更重要的意義。

10、進(jìn)一步地，所述雙性離子交換微球的制備方法，具體步驟如下：

11、步驟m1，取分散劑加入到蒸餾水中，充分?jǐn)嚢璧玫綕舛葹?.1%-20%的分散劑水溶液；優(yōu)選為3%-10%；

12、所述分散劑為羥丙基甲基纖維素，和/或聚乙烯醇；

13、步驟m2，按照質(zhì)量份數(shù)稱取50-90份聚合物單體混合物、1-90份致孔劑、0.003-1份引發(fā)劑，進(jìn)行充分?jǐn)嚢瑁玫?00份油相混合物；

14、所述聚合物單體混合物包括二乙烯基苯、含氯的芳香類化合物；二乙烯基苯與含氯的芳香類化合物的質(zhì)量比為1：（1-3）；

15、所述含氯的芳香類化合物選自對氯甲基苯乙烯、4-氯代苯乙烯；引入含氯的芳香類化合物，可以后續(xù)與叔胺類單體發(fā)生接枝反應(yīng)，為在微球上順利接枝季銨基官能團(tuán)提供活性點位。

16、所述致孔劑為二氯甲烷、正十二烷、甲苯、鄰二氯苯、液體石蠟中的一種或多種混合物；

17、所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，和/或過氧化苯甲酰；

18、在所述雙性離子交換微球的制備過程中適當(dāng)?shù)奶砑又驴讋┖鸵l(fā)劑，有利于調(diào)節(jié)微球孔徑及粒徑，以滿足不同檢測的需求。

19、步驟m3，將丙烯酸酯類單體與所述油相混合物、分散劑水溶液充分混合，在50-80℃下冷凝回流反應(yīng)4-20h；反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，先后用水和乙醇進(jìn)行清洗，并于60℃下干燥10-12h，得到第一反應(yīng)產(chǎn)物；

20、所述丙烯酸酯類單體選自丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯；

21、所述丙烯酸酯類單體的添加質(zhì)量為所述聚合物單體混合物的1%-20%；

22、所述油相混合物與分散劑水溶液的質(zhì)量比為（30-60）：100；

23、步驟m4，取所述第一反應(yīng)產(chǎn)物置于甲苯溶液中，進(jìn)行溶脹0.5-1.5h，得到溶脹混合物；向所述溶脹混合物中加入叔胺類單體，在80-90℃下持續(xù)充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)4-20h，反應(yīng)結(jié)束后，得到第二反應(yīng)產(chǎn)物；

24、所述叔胺類單體選自n,n-二甲基丁胺、三甲胺、三乙胺；

25、所述叔胺類單體的添加量為所述含氯的芳香類化合物質(zhì)量的1-10倍；

26、步驟m5，向所述第二反應(yīng)產(chǎn)物中加入堿性甲醇溶液，在65-75℃下低速攪拌，并進(jìn)行酯水解反應(yīng)20-30?h；冷卻至室溫后，依次采用乙醇、碳酸氫鈉溶液、水進(jìn)行清洗，并進(jìn)行干燥后得到所述雙性離子交換微球吸附材料。

27、進(jìn)一步地，所述稀釋劑為血液檢測稀釋液，和/或尿液檢測稀釋液；

28、所述血液檢測稀釋液為10%-15%的甲醇溶液；

29、所述尿液檢測稀釋液為0.02mol/l的碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液；優(yōu)選地，碳酸鈉：碳酸氫鈉的質(zhì)量比為（1-3）：（7-9）。

30、進(jìn)一步地，所述活化液為0-50%的甲醇溶液；

31、所述平衡液為去離子水；

32、所述淋洗液包括第一淋洗液、第二淋洗液；所述第一淋洗液為去離子水；第二淋洗液選自甲醇、乙腈；

33、所述洗脫液為含有0.1%-4%甲酸的甲醇溶液；

34、所述復(fù)溶液為去離子水；

35、所述標(biāo)準(zhǔn)品為血液標(biāo)準(zhǔn)品，和/或尿液標(biāo)準(zhǔn)品；

36、所述質(zhì)控品為血液質(zhì)控品，和/或尿液質(zhì)控品；

37、所述內(nèi)標(biāo)工作液為血液內(nèi)標(biāo)工作液，和/或尿液內(nèi)標(biāo)工作液；

38、所述流動相包括流動相a、流動相b；所述流動相a為0.1%的甲酸水溶液；所述流動相b為甲醇。

39、進(jìn)一步地，所述血液標(biāo)準(zhǔn)品和血液質(zhì)控品中均包括腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、甲氧基腎上腺素、甲氧基去甲腎上腺素、3-甲氧酪胺，余量為血液模擬基質(zhì)溶液；

40、所述血液標(biāo)準(zhǔn)品中各組分化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為：腎上腺素:23.3pg/ml-1800pg/ml、去甲腎上腺素:58.31pg/ml-4500pg/ml、多巴胺:17.5pg/ml-1350pg/ml、甲氧基腎上腺素:11.67pg/ml-900pg/ml、甲氧基去甲腎上腺素:23.3pg/ml-1800pg/ml、3-甲氧酪胺:11.67pg/ml-900pg/ml；

41、所述血液質(zhì)控品包括血液低質(zhì)控品、血液高質(zhì)控品；

42、所述血液低質(zhì)控品中各組分化合物的目標(biāo)濃度為：腎上腺素:120pg/ml、去甲腎上腺素:300pg/ml、多巴胺:90pg/ml、甲氧基腎上腺素:60pg/ml、甲氧基去甲腎上腺素:120pg/ml、3-甲氧酪胺:60pg/ml；

43、所述血液高質(zhì)控品中各組分化合物的目標(biāo)濃度為：腎上腺素:900pg/ml、去甲腎上腺素:2250pg/ml、多巴胺:675pg/ml、甲氧基腎上腺素:450pg/ml、甲氧基去甲腎上腺素:900pg/ml、3-甲氧酪胺:450pg/ml；

44、所述血液內(nèi)標(biāo)工作液包括腎上腺素-d6:40ng/ml、去甲腎上腺素-d6:100ng/ml、多巴胺-d4:40ng/ml、甲氧基腎上腺素-d3:20ng/ml、甲氧基去甲腎上腺素-d3:40ng/ml、3-甲氧酪胺-d4:20ng/ml；

45、所述血液模擬基質(zhì)溶液包括4%的牛血清白蛋白溶液、0.1%-0.5%的抗壞血酸；

46、優(yōu)選地，血液模擬基質(zhì)溶液中抗壞血酸的濃度為0.3%-0.5%。

47、進(jìn)一步地，所述尿液標(biāo)準(zhǔn)品和尿液質(zhì)控品中均包括腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、甲氧基腎上腺素、甲氧基去甲腎上腺素、3-甲氧酪胺、高香草酸hva、香草扁桃酸vma，余量為模擬尿液基質(zhì)溶液；

48、所述尿液標(biāo)準(zhǔn)品中各組分化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為：腎上腺素:0.4ng/ml-80ng/ml、去甲腎上腺素:6ng/ml-1200ng/ml、多巴胺:10ng/ml-2000ng/ml、甲氧基腎上腺素:0.5ng/ml-100ng/ml、甲氧基去甲腎上腺素:0.8ng/ml-160ng/ml、3-甲氧酪胺:0.8ng/ml-160ng/ml、高香草酸：125ng/ml-25000ng/ml、香草扁桃酸：125ng/ml-25000ng/ml；

49、所述尿液質(zhì)控品包括尿液低質(zhì)控品、尿液高質(zhì)控品；

50、所述尿液低質(zhì)控品中各組分化合物的目標(biāo)濃度為：腎上腺素:4ng/ml、去甲腎上腺素:60ng/ml、多巴胺:100ng/ml、甲氧基腎上腺素:5ng/ml、甲氧基去甲腎上腺素:8ng/ml、3-甲氧酪胺:8ng/ml、高香草酸：1250ng/ml、香草扁桃酸：1250ng/ml；

51、所述尿液高質(zhì)控品中各組分化合物的目標(biāo)濃度為：腎上腺素:32ng/ml、去甲腎上腺素:480ng/ml、多巴胺:800ng/ml、甲氧基腎上腺素:40ng/ml、甲氧基去甲腎上腺素:64ng/ml、3-甲氧酪胺:64ng/ml、高香草酸：10000ng/ml、香草扁桃酸：10000ng/ml；

52、所述尿液內(nèi)標(biāo)工作液包括腎上腺素-d6:100ng/ml、去甲腎上腺素-d6:1000ng/ml、多巴胺-d4:1500ng/ml、甲氧基腎上腺素-d3:100ng/ml、甲氧基去甲腎上腺素-d3:150ng/ml、3-甲氧酪胺-d4:150ng/ml、高香草酸-d5：20000ng/ml、香草扁桃酸-d3：20000ng/ml；

53、所述模擬尿液基質(zhì)溶液為含有0.1%-0.5%乙酸的人工尿液溶液。

54、另一方面，本發(fā)明提供一種兒茶酚胺及其代謝物的同步檢測方法，所述檢測方法使用了上述試劑盒。

55、進(jìn)一步地，如圖1所示，所述檢測方法的具體步驟如下：

56、步驟1，取裝填有雙性離子交換微球的固相萃取裝置，加入活化液進(jìn)行活化；再加入所述平衡液后壓干，制備得到活化的固相萃取裝置；

57、步驟2，同步移取標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測樣本各200?μl，分別依次加入20?μl內(nèi)標(biāo)工作液，400?μl?稀釋液，渦旋混勻得到標(biāo)準(zhǔn)品工作液、質(zhì)控品工作液、待測樣品溶液；

58、步驟3，將所述標(biāo)準(zhǔn)品工作液、質(zhì)控品工作液、待測樣品溶液同步轉(zhuǎn)移到所述固相萃取裝置內(nèi)，壓干；然后依次加入所述第一淋洗液、第二淋洗液，壓干；再加入所述洗脫液，收集洗脫液，壓干；

59、將所述各組洗脫液于氮氣下吹干，加入100μl復(fù)溶液進(jìn)行復(fù)溶，得到濃縮檢測溶液；

60、步驟4，取10μl所述濃縮檢測溶液，進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

61、進(jìn)一步地，步驟1中所述雙性離子交換微球裝填量為2mg-8mg，優(yōu)選為3mg-5mg。

62、進(jìn)一步地，所述雙性離子交換微球的季銨基官能團(tuán)密度為0.5?mmol/g?-2mmol/g，羧基官能團(tuán)密度為1?mmol/g?-5mmol/g，微觀結(jié)構(gòu)及吸附原理如圖2所示。

63、采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果：

64、本發(fā)明提供的用于同步檢測兒茶酚胺及其代謝物的試劑盒，主要用于通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對兒茶酚胺及其代謝物進(jìn)行同步檢測。在檢測過程中，創(chuàng)造性地采用適量的雙性離子交換微球作為固相萃取裝置的填料。因為雙性離子交換微球同時含有羧基官能團(tuán)和季銨基官能團(tuán)，可以對尿液樣本中含有的6種帶有氨基官能團(tuán)的兒茶酚胺及其代謝物和2種帶有羧基官能團(tuán)的兒茶酚胺的終末代謝物進(jìn)行同步分離；同時對血液樣本中含有的6種帶有氨基的兒茶酚胺及其代謝物進(jìn)行分離時也具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。本發(fā)明提供的兒茶酚胺及其代謝物的同步檢測方法，可以在保證檢測準(zhǔn)確度和靈敏度的前提下，大大降低了對尿液中8種兒茶酚胺及其代謝物的檢測成本，縮短了檢測時間；另外，所述試劑盒既適用于血液樣本，也同樣適用于尿液樣本，且對兩種樣本的檢測步驟基本相同，避免了實際檢測工作中試劑盒繁多，檢測流程繁瑣的問題，具有廣泛的實用價值。