本發明涉及生物，具體涉及一種樣本稀釋液及其在牛副結核篩查試劑盒中的應用和產品。

背景技術：

1、牛副結核病，又稱“副結核性腸炎”，它是指由副結核分枝桿菌感染引起的一種慢性消化道傳染性疾病。該菌通常呈短桿菌，長度大小為0.5μm-1.5μm，是一種革蘭氏陽性菌，分枝呈絲狀，無鞭毛、不形成莢膜、無芽孢和無運動性，對外界環境的抵抗力較強，可存活數月之久。感染后期以間歇性腹瀉、頑固性腹瀉為主要特征，逐漸出現消瘦、沉郁，泌乳期的牛泌乳逐漸減少甚至停止，逐漸衰竭死亡。

2、牛副結核病的潛伏期長，早期癥狀不明顯，該病從犢牛到種牛都有感染，一旦感染會造成巨大的經濟損失。因此對養殖場定期篩查、檢疫顯得尤為重要。目前實驗室診斷的方法有鏡檢法、變態反應法、酶聯免疫間接法、pcr法。副結核分枝桿菌與草分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發分枝桿菌等有多種相同成分，在進行血清學診斷時，常發生交叉反應，而且上述一些方法存在過程繁瑣、耗時長、成本高等問題，不適合大規模篩查，市面上缺少高通量、速度快、特異性高、結果準確的檢測系統用于副結核分枝桿菌感染的篩查試劑。

3、中國專利cn105907770a中公開了重組基因、其編碼的重組蛋白、其應用及牛副結核桿菌的檢測試劑盒和檢測方法，該發明中所述的檢測牛副結核血清的試劑盒中包括重組蛋白、包被液、洗滌液、封閉液、稀釋液、兔抗牛igg和底物顯色液，該發明以重組基因編碼獲得的重組蛋白作為包被抗原，采用間接elisa檢測牛副結核桿菌，檢測的特異性為91%，敏感性為87%，符合率為89%，檢測的符合率較低。

4、現有技術中對于牛副結核病的篩查研究較少，公開的間接elisa法，耗時長、自動化程度低，不利于進行樣本篩選，亟需提供一種檢測方法簡單，速度快，檢測結果準確率較高的用于副結核分枝桿菌感染的篩查試劑。

技術實現思路

1、本發明的目的是提供一種樣本稀釋液及其在牛副結核篩查試劑盒中的應用和產品。

2、為實現上述發明目的，本發明的技術方案如下：

3、一方面，本發明提供了一種樣本稀釋液，所述的樣本稀釋液中包括20-30ug/ml草分枝桿菌提取物、40-60mm?pbs和0.8-1.0%?nacl。

4、進一步地，所述的樣本稀釋液包括20ug/ml草分枝桿菌提取物、50mm?pbs和0.9%nacl。

5、具體地，所述的nacl的濃度為質量體積比濃度。

6、具體地，所述的草分枝桿菌提取物的制備包括以下步驟：

7、（1）將草分枝桿菌接種至發酵培養基中進行發酵培養得到發酵液；

8、（2）將制得的發酵液使用甲醛滅活，離心，收集菌體，加入處理液，80-90℃處理0.4-1h后，進行超聲，離心，過濾，即得草分枝桿菌提取物。

9、進一步地，將草分枝桿菌接種至發酵培養基前還包括將草分枝桿菌接種至斜面培養和種子培養的步驟。

10、根據本發明的一些實施方式，所述的斜面培養基包括：大豆蛋白胨0.3g，胰蛋白胨0.3g，酵母膏0.3g，葡萄糖0.4g，蔗糖0.4g，硫酸鎂0.06g，磷酸氫二鈉0.06g，磷酸二氫鉀0.06g，氯化鈉0.04g，瓊脂1.8g，加入蒸餾水至100ml，ph7.5，121℃濕熱滅菌30min。

11、再進一步地，所述的斜面培養為將草分枝桿菌接種至斜面培養基，于35-37℃靜置72-96h進行菌種活化。

12、更進一步地，所述的斜面培養的溫度為35℃。

13、根據本發明的一些實施方式，所述的種子培養基包括：大豆蛋白胨0.4g，胰蛋白胨0.4g，酵母膏0.4g，葡萄糖0.4g，蔗糖0.4g，硫酸鎂0.04g，磷酸氫二鈉0.06g，磷酸二氫鉀0.06g，氯化鈉0.04g，甘油0.6g，加入蒸餾水至100ml，ph7.5，121℃濕熱滅菌30min。

14、再進一步地，所述的種子培養為將草分枝桿菌接種至種子培養基，于35-37℃，轉速180-220rpm條件下培養48-96h，得到種子液。

15、更進一步地，所述的種子培養的條件為35℃，轉速200rpm條件下培養。

16、進一步地，步驟（1）中所述的發酵培養基包括大豆蛋白胨2-6g/l，胰蛋白胨2-6g/l，酵母膏2-6g/l，葡萄糖2-6g/l，蔗糖2-6g/l，硫酸鎂0.4-0.6g/l，磷酸氫二鈉0.4-0.8g/l，磷酸二氫鉀0.4-0.8g/l，氯化鈉0.4-0.8g/l，甘油8-12g/l。

17、再進一步地，步驟（1）中所述的發酵培養基包括大豆蛋白胨4g/l，胰蛋白胨4g/l，酵母膏4g/l，葡萄糖4g/l，蔗糖4g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸氫二鈉0.6g/l，磷酸二氫鉀0.6g/l，氯化鈉0.6g/l，甘油10g/l。

18、具體地，將上述制得的種子液接種至發酵培養基中進行培養；

19、進一步地，所述的接種量為5-10%（v/v）。

20、進一步地，步驟（1）中所述的發酵培養為在35-38℃、轉速120-180rpm、通氣比為1：（0.8-2）的條件下通氣培養48-96h；

21、再進一步地，步驟（1）中所述的發酵培養的條件為35℃、轉速150rpm、通氣比為1：1下通氣培養。

22、進一步地，步驟（2）中所述的甲醛的濃度為0.2-0.6%；再進一步地，所述的甲醛的濃度為0.4%。

23、進一步地，步驟（2）中發酵液和甲醛的體積比為1：（0.8-2）；

24、再進一步地，步驟（2）中發酵液和甲醛的體積比為1：1。

25、進一步地，步驟（2）中所述的菌體的濕重與處理液的質量體積比為1:（3-5）；

26、再進一步地，步驟（2）中所述的菌體的濕重與處理液的質量體積比為1:4。

27、再進一步地，所述的處理液的配方為10-20?mm?pbs，0.5-2?mm?edta，40-60mm?谷氨酸鈉、終濃度0.2-0.4%的甘氨酸，1-2%的蔗糖，1-3%的海藻糖，1-2%的甘露醇，0.05-0.1%的tween-20，0.2-0.4%的泊洛沙姆，0.4-0.6%的chaps和0.1-0.2%的sds，ph6-8；

28、更進一步地，所述的處理液的配方為20?mm?pbs，1?mm?edta，50mm?谷氨酸鈉、終濃度0.3%的甘氨酸，1%的蔗糖，2%的海藻糖，1.5%的甘露醇，0.1%的tween-20，0.3%的泊洛沙姆，0.5%的chaps和0.1%的sds，ph7.2。

29、進一步地，步驟（2）中加入處理液后于85℃處理0.5h。

30、進一步地，步驟（2）中加熱處理后進行超聲破碎，超聲功率為100-200?w，超聲破碎1-3?s，暫停2-4?s，總時長為15-20?min，超聲溫度為2-8℃。

31、進一步地，步驟（2）中超聲破碎后5000-8000g離心15-25min除去沉淀，收集上清過0.2μm濾膜。

32、又一方面，本發明提供了上述的樣本稀釋液在制備牛副結核篩查試劑盒中的應用。

33、又一方面，本發明提供了一種用于牛副結核篩查的化學發光檢測試劑盒，所述的化學發光檢測試劑盒中包括上述的樣本稀釋液。

34、具體地，所述的化學發光檢測試劑盒還包括生物素標記的副結核分枝桿菌抗原、吖啶磺酰胺標記的鼠抗牛igg抗體、鏈霉親和素磁珠。

35、進一步地，所述的化學發光檢測試劑盒還包括標準品和質控品。

36、進一步地，所述的生物素標記的副結核分枝桿菌抗原的工作濃度為0.2-1ug/ml；

37、再進一步地，所述的生物素標記的副結核分枝桿菌抗原的工作濃度為0.5ug/ml。

38、進一步地，所述的生物素標記的副結核分枝桿菌抗原的制備方法包括以下步驟：

39、（1）將副結核分枝桿菌抗原使用緩沖液進行稀釋；

40、（2）將生物素加入到（1）中的抗原稀釋液中；

41、（3）將步驟（2）得到的標記產物離心，超濾，收集超濾產物；

42、（4）加入hrp藕聯物穩定/稀釋劑iv，抽濾，得到生物素標記的副結核分枝桿菌抗原。

43、再進一步地，步驟（1）中所述的緩沖液為0.02m?pb緩沖液，緩沖液的ph為7.2。

44、再進一步地，步驟（2）中所述的生物素為sulfo-nhs-lc-biotin。

45、再進一步地，步驟（3）中所述的離心的條件為2-8℃、離心力為4900-5000g，離心的時間為10-15min。

46、進一步地，所述的吖啶磺酰胺標記的鼠抗牛igg抗體的工作濃度為0.5-1.2ug/ml；

47、再進一步地，所述的吖啶磺酰胺標記的鼠抗牛igg抗體的工作濃度為1ug/ml。

48、進一步地，所述的吖啶磺酰胺標記的鼠抗牛igg抗體的制備方法包括以下步驟：

49、（1）將鼠抗牛igg抗體使用緩沖液進行稀釋；

50、（2）將吖啶磺酰胺加入到（1）中的抗原稀釋液中；

51、（3）將步驟（2）得到的標記產物離心，超濾，收集超濾產物；

52、（4）加入hrp藕聯物穩定/稀釋劑iv，抽濾，得到吖啶磺酰胺標記的鼠抗牛igg抗體。

53、再進一步地，步驟（1）中所述的緩沖液為0.05m?cbs緩沖液。

54、再進一步地，步驟（3）中所述的離心的條件為2-8℃、離心力為4900-5000g，離心的時間為10-15min。

55、進一步地，所述的鏈霉親和素磁珠的濃度為0.2-1.0mg/ml；

56、再進一步地，所述的鏈霉親和素磁珠的濃度為0.4mg/ml。

57、進一步地，所述的鏈霉親和素磁微粒的制備方法為：取鏈霉親和素-磁微粒使用磁性分離器進行磁吸附，加入hrp藕聯物穩定劑/稀釋劑iv并混勻磁珠即得。

58、具體地，所述的生物素標記的副結核分枝桿菌抗原為基因重組抗原，所述的抗原氨基酸序列長度為266?aa。

59、進一步地，所述的抗原序列如seq?id?no:1所示。

60、seq?id?no:1:

61、mnalarlrgrkvvpqrsdgeldamaaagavvaaalqavraaavagvstlsldqiaesvirdagavpsflgyhgypasicasvndrvvhgipsaaevlapgdlvsidcgavldgwhgdaaitfgvgaldpadealcqgtresleagiaamvpgnrltdvshaielgtraaetrhgrafgivegygghgigrqmhmdpflpnegspgrgpllapgsvlaiepmltlgtgktvvlddqwtvittdgsraahwehtvavtdag?priltig。

62、進一步地，所述的標準品包括低值標準品和高值標準品。

63、再進一步地，所述的低值標準品為含60au/ml副結核分枝桿菌抗體的溶液；

64、再進一步地，所述的高值標準品為含480au/ml副結核分枝桿菌抗體的溶液。

65、具體地，所述的標準品用于對試劑的主曲線進行校準。

66、進一步地，所述的質控品包括陰性質控品和陽性質控品。

67、再進一步地，所述的陰性質控品為不含副結核分枝桿菌抗體的緩沖液；

68、再進一步地，所述的陽性質控品為含240au/ml副結核分枝桿菌抗體的溶液。

69、具體地，所述的質控品用于評估試劑盒是否在控。

70、又一方面，本發明提供了化學發光檢測試劑盒在牛副結核篩查中的應用。

71、具體地，使用本發明的化學發光檢測試劑盒的判定結果為：檢測結果≥120?au/ml，則為陽性；檢測結果＜90?au/ml，則為陰性；檢測結果在90-120?au/ml之間，則為灰區。

72、本發明的有益效果為：

73、本發明的樣本稀釋液能夠降低其他igg抗體的干擾，本發明提供的用于牛副結核篩查的化學發光檢測試劑盒中包括上述的樣本稀釋液、生物素標記的副結核分枝桿菌抗原、鏈霉親和素磁微粒、吖啶磺酰胺標記二抗；生物素和鏈霉親和素的信號放大體系，提高了試劑盒的靈敏度，本發明的檢測試劑盒具有高通量、速度快、特異性高、結果準確的特點，適合大規模的篩查。