本發明屬于稀有細胞分選，具體涉及一種用于稀有細胞高純度分選與捕獲的方法。

背景技術：

1、細胞具有異質性，對群體細胞的研究往往會掩蓋單細胞之間的差異，從而限制生物學和醫學等學科的發展。聚焦于單個細胞特別是單個稀有細胞的研究（如循環腫瘤細胞、腫瘤干細胞、循環內皮祖細胞、造血干細胞等）不僅有利于進一步深化我們對生命、人體、疾病等的理解，也有利于新藥的開發和疾病的治療。在臨床環境中，識別一些特殊的稀有細胞往往可以提供更多關于患者疾病狀態的寶貴信息，如轉移情況、化療療效、遺傳病篩查等，但數量龐大的非目標細胞干擾使這類研究發展相對受限，因此從數量眾多的非目標細胞中準確分選及捕獲單個目標細胞（稀有細胞）成為了單細胞研究中的關鍵技術。

2、目前對細胞的分選及捕獲主要技術方法可以概括為以下3類：基于微流控技術、基于細胞表面標志物分選技術、基于顯微操作技術。

3、基于微流控的方法具有反應效率高、適用性強、節省試劑樣品消耗等優點。但是，一次性微流控芯片損耗高、微流控技術操作復雜、目標細胞難以分離和釋放用于下游分析等缺點，也成為該方法普及的主要障礙。比如，公開號為cn111718836a的發明申請公開了一種用于稀有細胞獲取與單細胞封裝的微流控芯片，自上而下依次堆疊設置上流道層、濾膜層、下流道層，采用微孔濾膜技術對樣本液中的稀有細胞進行富集，采用液滴技術對富集細胞進行封裝，采用介電泳技術對液滴提純分選。

4、以流式細胞術為代表的細胞表面標志物分選技術，通常需要相對大量的樣品量，導致難以處理那些珍貴稀少的樣品。

5、顯微操作技術所需設備較為簡單，可視化的操作、極低的采樣體積、極簡的實驗耗材可以在減少樣品損失的前提下增加對稀有細胞的完整無損捕獲，允許捕獲和原位識別的技術也非常適合進行表型相關分析研究的同時保留住相應的空間信息。比如，公開號為cn113373104a的發明申請公開了一種用于稀有細胞高純度分選的裝置及方法，所述方法包括：(1)將細胞樣品進行鋪展；(2)對鋪展后的細胞樣品進行掃描成像；(3)根據成像結果，讀取目標細胞的位置信息以及目標細胞與周圍其他非目標細胞之間的距離信息，對得到的距離信息進行判斷：如果所述距離信息不滿足設定取樣距離要求，則根據目標細胞的位置信息，對其所在區域進行取樣，得到包含該目標細胞和周圍其他非目標細胞的中間細胞樣品，對得到的中間細胞樣品進行再次鋪展，并返回步驟(2)；如果所述距離信息滿足設定取樣距離要求，直接進行目標細胞的取樣，實現目標細胞的分選。但是該技術方案中，需要反復多次成像并分析目標細胞與其他非目標細胞之間的距離信息，并需要反復對目標細胞附近取樣后重新鋪展，直到目標細胞與附近非目標細胞距離足夠遠后，才能將目標細胞吸取出來，但其操作較為繁瑣，耗時長，難以在大量非目標細胞存在下實現極少量稀有細胞的捕獲。

技術實現思路

1、本發明針對現有技術中存在的上述不足，提供了一種用于稀有細胞高純度分選與捕獲的方法，具有裝置簡單、操作簡便、無需細胞樣品稀釋、細胞樣品鋪展速度快、目標細胞分選純度高、遺漏率低、原位捕獲、可重復等優點，適用于單細胞篩選與分析、單細胞培養、單細胞藥物篩選、單分子分析、基因篩選、樣品純化、抗體篩選、微生物研究等領域。

2、一種用于稀有細胞高純度分選與捕獲的方法，包括以下步驟：

3、（1）將樣品鋪展在鋪展容器中，樣品中稀有的目標細胞混雜在大量非目標細胞之間；

4、（2）確定樣品中目標細胞位置，以及目標細胞與目標細胞周圍的非目標細胞之間的位置關系；

5、（3）使用管狀的探針通過排出緩沖液，吹散目標細胞周圍的非目標細胞，使非目標細胞遠離待捕獲的目標細胞；直到待捕獲的目標細胞附近沒有影響捕獲的非目標細胞時，通過探針抽吸捕獲目標細胞。

6、具體的，一種用于稀有細胞高純度分選與捕獲的方法：

7、（1）將樣品鋪展在鋪展容器中，樣品中含有的數目極少的稀有的目標細胞混雜在大量非目標細胞之間；

8、（2）利用成像裝置對鋪展在容器內的樣品進行成像，以確定樣品中目標細胞位置，以及目標細胞與其周圍的非目標細胞之間的位置關系；

9、（3）控制管狀的探針使其尖端在正上方對準目標細胞的條件下，從上至下插入樣品溶液中；探針尖端插入樣品溶液并向下移動的過程中，控制與探針末端相連通的流體驅動系統通過探針尖端排出緩沖液，吹散目標細胞周圍的非目標細胞，使非目標細胞遠離待捕獲的目標細胞；直到待捕獲的目標細胞附近沒有影響捕獲的非目標細胞時，且探針尖端與目標細胞之間的距離達到設定的范圍內后，控制液體驅動系統將目標細胞通過探針尖端抽吸進入探針通道內，完成目標細胞的捕獲操作；

10、（4）控制探針使其尖端對準目標細胞的接收容器，通過控制液體驅動系統向探針外排出液體，將探針通道內的目標細胞通過探針尖端排出進入接收容器內。

11、優選的，用于稀有細胞高純度分選與捕獲的樣品包括：血液、胸腔積液、尿液、腦脊液、骨髓、淋巴液，實際的樣品類型可不限于上述列舉。目標細胞可以是占樣品中細胞比例極少數的細胞，比如，循環腫瘤細胞、腫瘤干細胞、循環內皮祖細胞、造血干細胞等，實際的細胞類型可不限于上述列舉。目標細胞可以是單個的細胞，也可以是少量細胞聚集在一起形成的細胞簇。

12、利用目標細胞的粘附性通常高于白細胞等非目標細胞的特點，在以恰當流速吹散細胞時，非目標細胞被吹散，而目標細胞仍能由于粘附在鋪展容器表面而保留在原位，從而使得非目標細胞遠離待捕獲的目標細胞，避免了非目標細胞對目標細胞捕獲的干擾。

13、本發明針對的是粘附性強的稀有細胞（如循環腫瘤細胞）的分選難題。比如循環腫瘤細胞極其稀有，每毫升外周血中通常不超過10個，所以極其需要高回收率、高純度和低損傷的單細胞捕獲方法。本發明通過單次定向吹散，利用目標細胞與容器表面的高粘附性，在緩沖液排出時僅吹散周圍非目標細胞（粘附性較低或體積/密度較小），而目標細胞因物理特性差異仍牢固附著于表面，同時利用探針扣住目標細胞，避免在吸取過程中吸取非目標細胞，確保有且僅有單個目標細胞被捕獲，使得單細胞捕獲成功率高達80%以上，同時避免了長時間強光照射和反復吹打對細胞生理活性的損傷。

14、當用于稀有細胞高純度分選與捕獲的樣品為血液時，作為優選，先進行一步紅細胞裂解再進行目標細胞的分選與捕獲。由于血液中大量存在紅細胞，對稀有的目標細胞的分選與捕獲存在較大影響，可以通過紅細胞裂解液先將紅細胞裂解，并去除紅細胞碎片，收集剩下的白細胞以及目標細胞，這樣目標細胞在剩余細胞中所占比例大大提高，并且，也避免了紅細胞這種顏色較為醒目的細胞對觀察的影響。

15、對目標細胞的觀察和鑒定首先依靠倒置熒光顯微鏡或其他成像儀器平臺對鋪展在容器中的樣品細胞進行成像。在大量非目標細胞中識別目標細胞的方法包括人工肉眼識別、機器視覺識別、人工智能綜合分析識別等方法。

16、優選的，確定目標細胞位置時，通過目標細胞與非目標細胞之間的大小和/或細胞形態進行區分。如果目標細胞與非目標細胞之間通過大小、形態等自然狀態特征就能區分出來，則可以直接進行下一步驟，不需要對目標細胞進行標記。否則，可以通過加入針對目標細胞或非目標細胞的標記試劑將目標細胞與非目標細胞進行區分。因為非目標細胞數量較多，且可能種類也較多，所以，一般來說，較少對非目標細胞進行標記，一般通過加入針對目標細胞的標記將目標細胞與非目標細胞進行區分。

17、標記的方式只要能夠將目標細胞與非目標細胞進行區分即可。優選的，所述標記的方法包括：抗體標記、核酸適配體標記、核酸探針標記、納米粒子標記、同位素標記；標記試劑的報告方法包括：熒光光譜法、紫外可見吸收光譜法、拉曼光譜法、質譜法、電化學法、核酸pcr擴增方法等；實際的標記方法和報告方法可不限于上述列舉。

18、所述鋪展容器需要能夠將樣品中的細胞鋪展開，并且其上方開放能夠方便使用探針對細胞進行操作。優選的，鋪展樣品的容器為細胞培養皿，多孔板，或上方開放且底面可與樣品中目標細胞接觸的微流控芯片或其它構型樣品鋪展容器。

19、探針的功能在于將非目標細胞吹離目標細胞及對目標細胞進行分選和捕獲，并最終將捕獲的細胞在選定容器釋放。作為優選的方案，所述探針為帶有取樣通道的可以進行液體或氣體注射與吸取的有一定硬度的中空管狀結構。優選的，所述探針為毛細管形捕獲探針，具有拉尖的尖端結構，探針的尖端內徑應該與目標細胞的尺寸相匹配，一般所述探針的尖端內徑略大于目標細胞直徑，如果是目標細胞簇，則探針的尖端內徑應略大于所要分選與捕獲的細胞簇的大小。進一步優選的，可以對探針的尖端及內部通道的表面進行疏水化表面處理或降低探針表面吸附的處理，以防止或降低細胞對探針壁的吸附。

20、作為優選，所述探針通過排出液體來吹散目標細胞周圍的非目標細胞時，流速為5~200納升/秒，排出體積10~500納升。所述探針排出液體的方式包括連續排出液體或間歇脈沖式排出液體兩種方式，或者兩種方式交替使用。

21、在進行目標細胞的捕獲操作時，可通過改變探針尖端的內徑大小、探針吸入細胞和液體的流速、體積等條件，提高探針捕獲目標細胞的成功率，降低探針捕獲非目標干擾細胞的概率。

22、作為優選，通過探針抽吸捕獲目標細胞時，探針尖端與目標細胞的距離為小于10微米；作為進一步優選，探針尖端與目標細胞的距離為小于5微米。

23、作為優選，通過探針抽吸捕獲目標細胞時，抽吸流速為10~200納升/秒，抽吸體積為1~20納升。

24、本發明限定了吹散流速、抽吸體積，結合限定探針的尖端與目標細胞的距離，該范圍通過實驗驗證可避免粘附性細胞脫離（說明書實施例）。例如，流速大于200納升/秒會導致緩沖液沖擊力過大，破壞目標細胞粘附；體積大于20納升則易吸入非目標細胞。

25、優選的，在進行稀有細胞高純度分選與捕獲時，使用專用的分選與捕獲裝置，所述分選與捕獲裝置包括：

26、管狀的探針，用于吹散非目標細胞以及抽吸捕獲目標細胞；

27、移動臺，包括第一移動臺和第二移動臺；所述鋪展容器放置在所述第一移動臺上，所述探針固定在第二移動臺上，所述鋪展容器上方開放以方便探針操作，鋪展容器底面可與樣品中目標細胞接觸；

28、細胞成像系統，用于對所述鋪展容器中的細胞進行成像觀察和檢測；

29、三維移動控制系統，包括用于控制所述第一移動臺在水平面內移動水平驅動裝置，以及控制固定在第二移動臺上的探針豎向移動豎向驅動裝置，所述三維移動控制系統用于控制和調節所述探針、細胞成像系統和鋪展容器之間相對位置；

30、液體驅動裝置，與所述探針的末端相連通，用于控制所述探針進行吹散和抽吸操作時的液體排出和液體抽吸的流量與體積。

31、所述液體驅動裝置可對探針內液體施加正壓或負壓，完成非目標細胞的吹散和目標細胞的捕獲操作。液體驅動裝置包括連通所述探針末端的注射泵、氣動泵、電滲泵、重力液位差驅動裝置等，實際的流體驅動裝置可不限于上述列舉。

32、本發明中，熒光光譜法、紫外可見吸收光譜法、拉曼光譜法、質譜法、電化學法、核酸pcr擴增方法等均可用于樣品細胞的成像和檢測，這些方法對應的儀器均可作為細胞成像系統。作為優選，采用倒置熒光顯微鏡通過掃描待檢測樣品區域并依靠熒光來對目標細胞進行成像。

33、與現有技術相比，本發明的優點主要在于：

34、本發明用于稀有細胞高純度分選與捕獲的方法，先將細胞鋪展，然后查找并確定目標細胞的位置，基于目標細胞的固有物理屬性（如粘附性、密度或大小），再使用探針向外注射緩沖液來吹散目標細胞周圍的非目標細胞，再利用類似血液流動的流體動力無損傷地捕獲目標細胞，最后可以將目標細胞釋放至接收容器中，實現稀有細胞的高純度分選和捕獲。本發明方法配套使用的裝置結構簡單、容易操作，方法具有無需反復大量稀釋、細胞樣品鋪展速度快、目標細胞分選純度高、遺漏率低、原位捕獲、重復性好等優點，適用于單細胞篩選與分析、單細胞培養、單細胞藥物篩選、單分子分析、基因篩選、樣品純化、抗體篩選、微生物研究等領域。