專利名稱：一種受精卵胞質內注射dna生產轉基因水牛的方法
一種受精卵胞質內注射DNA生產轉基因水牛的方法技術領域
本發明屬于生物工程的動物生物技術，特別是水牛繁殖與定向遺傳改良領域。具體是一種受精卵胞質內注射DNA生產轉基因水牛的方法。
背景技術：
動物轉基因技術(Animal Transgenic Technology)是借助基因工程技術將外源基因導入受體動物基因組內，并能穩定表達且能將導入的外源基因穩定遺傳給后代的技術。其主要特點是能人為有目的地改變動物的遺傳結構，而賦予轉基因動物新的表型特征。
水牛是我國南方的一種極具開發前景的重要家畜，因其適應性強、耐高溫高濕、抗病力強、耐粗飼、容易飼養、使用年限長和乳品營養價值高等特性，而倍受人們關注與重視。 然而，目前我國水牛的品種的產奶量和繁殖率低，制約水牛奶業的發展，急需應用胚胎工程技術對其進行品種改良。轉基因技術的出現，為動物的品種改良和新品種的培育提供了一條新的途徑。與其他轉基因技術相比，受精卵胞質內注射DNA轉基因技術是將攜帶有外源基因的質粒DNA直接注入到受精卵的胞質中，以生產轉基因動物。其具有步驟簡單、容易操作，胚胎成活率高，且成本較低等優點，使轉基因動物的培育過程大大簡化。為此，本發明通過受精卵胞質內注射DNA技術體外生產水牛轉基因胚胎，并結合胚胎移植技術建立一種生產轉基因水牛的新方法。這為轉基因動物的生產提供了一個重要的技術基礎，具有重要的理論意義和實際意義。發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種受精卵胞質內注射DNA生產轉基因水牛的方法。
本發明通過以下技術方案解決上述技術問題一種受精卵胞質內注射DNA生產轉基因水牛的方法，包括如下步驟
(1)水牛受精卵的制備從屠宰場收集的水牛卵巢上抽取的卵母細胞經體外成熟培養24h后進行體外受精(IVF)，IVF后7 他，用吸管輕輕反復吹打使粘附于卵母細胞周圍的精子脫落，再在50倍的體視顯微鏡下選擇排出第二極體的受精卵，以進行受精卵顯微注射DNA，
(2)受精卵胞質內注射DNA制作水牛轉基因胚胎將攜帶有增強綠色熒光蛋白 (EGFP)基因的轉基因載體(pEGFP-Nl)質粒DNA通過顯微注射的方法直接注入到IVF后7 8h的受精卵胞質中，注射的質粒DNA濃度為20μ g/ml，注射量為15 30pL，注射后的水牛受精卵置于顆粒細胞單層共培養6 7d后，在熒光顯微鏡下檢測發育到囊胚的EGFP表達情況，篩選獲得水牛轉基因胚胎，25%轉基因胚胎發育至囊胚階段，63%的囊胚表達EGFP，
(3)轉基因水牛的生產將挑選出表達EGFP的水牛轉基因囊胚移植到自然發情或同期發情處理的受體母水牛的子宮角中，每頭母牛移植2枚胚胎，受體水牛經妊娠足月后產下2頭犢牛。分別取2頭犢牛耳部組織進行PCR和Southern Blot等分子生物學技術鑒定，檢測到用該方法生產的水牛犢耳部組織均表達有EGFP標記基因。
本發明的突出優點在于
采用本發明的方法，成功生產了轉基因水牛胚胎，25%轉基因胚胎發育至囊胚階段，63 %的囊胚表達EGFP，經過胚胎移植后有1頭受體水牛獲得妊娠到期并產下2頭犢牛，2 頭都存活，分別取2頭犢牛的耳部組織進行PCR和Southern Blot等分子生物學技術鑒定， 檢測到用該方法生產的水牛犢耳部組織明顯均表達有EGFP標記基因。


圖1是本發明獲得的表達有EGFP的常光下的水牛轉基因囊胚。
圖2是本發明獲得的表達有EGFP的熒光燈下的水牛轉基因囊胚。
圖3是本發明獲得的轉基因水牛犢耳部組織的PCR檢測結果(1、Marker ；2、①號轉基因水牛；3、②號轉基因水牛；4、陰性對照)。
圖4是本發明獲得的轉基因水牛犢耳部組織的Southern Blot檢測結果(1、①號轉基因水牛；2、②號轉基因水牛)。
圖5是本發明獲得的表達有EGFP的轉基因水牛。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明的技術方案作進一步說明。
本發明所述的一種受精卵胞質內注射DNA生產轉基因水牛的方法，包括如下步驟
(1)水牛受精卵的制備
從屠宰場收集水牛卵巢，置于含有K+、Ca2+、Na+、Mg2+的；35 37°C生理鹽水的保溫瓶內，4h內送到實驗室，用37°C的生理鹽水洗凈，剪掉卵巢周圍的懸韌帶，用帶有12號針頭的IOml注射器抽取直徑為2 6mm的卵泡中卵母細胞。在實體顯微鏡下挑選出細胞質均勻，并有完整致密卵丘細胞的卵丘卵母細胞復合物(COCs)，用洗卵液清洗兩遍后，放入含1. 5ml水牛體外成熟液(TCM-199+5% 0CS+0. 1 μ g/ml FSH)的30 X IOmm玻璃平皿中，在 38. 5°C,5% CO2和最大飽和濕度的培養箱中體外成熟培養Mh。
體外成熟培養后的水牛COCs用200 μ L的微量加樣器輕輕反復抽打使卵母細胞周圍的部分卵丘細胞脫落，然后將具有第一極體、細胞質均勻的成熟卵母細胞選出，移到預平衡池的培養液中，置于培養箱中待用。
本實驗所用水牛冷凍精液均購買于廣西畜禽品種改良站。將細管冷凍精液在37°C 水浴中解凍，懸浮于平衡的受精液中30min。吸取含活精子的上清液，離心5min(1600 轉/min)，去上清，收集的精子留待體外受精用。將已去掉卵丘細胞的卵母細胞移入受精液中洗滌兩次，并轉移至覆蓋石蠟油的30 μ 1受精液滴中，每滴以10 15個卵母細胞為宜。 加入一定量經上述獲能處理的精子，使精子在受精液滴中的最終濃度約為1 X IO6個精子/ ml。最后，將其放入CO2培養箱中進行IVF。將IVF后7 他的受精卵取出，用200μ L的微量加樣器輕輕反復吹打使粘附于卵母細胞周圍的精子脫落，再挑選排出第二極體的受精卵，以進行DNA顯微注射配用。
(2)受精卵胞質內注射DNA制作水牛轉基因胚胎
首先，取一個60mm培養平皿的皿蓋，在皿蓋的中央根據實驗需要做4個10 μ 1的 PBS液小滴，然后用石蠟油蓋過小滴，防止PBS液蒸發。將其中一滴PBS液吸掉，以制備好的DNA代替。在另外一滴PBS液加入15 20個準備好的受精卵開始DNA的顯微注射。注射的質粒DNA濃度為20μ g/ml，注射量為15 30pL。在DNA滴內用注射管吸取一定量的 PEGFP-Nl質粒DNA，然后轉移至放置卵母細胞的微滴，用固定針吸住一個體外受精后的水牛胚胎，置其極體于6點鐘的位置，然后從3點鐘方向進針，將15 30pL DNA液緩慢注入胚胎的卵胞質并反復輕輕回吸胞質使之與DNA充分混合。隨后，撤出注射針，并將卵母細胞從固定管釋放。完成操作后，把注射DNA后的受精卵用培養液洗2遍后，置于顆粒細胞單層微滴中，在38. 5°C,5% CO2最大濕度的培養箱中進行體外培養。培養液每隔48小時更換一次。
(3)轉基因水牛的生產
注射DNA后的水牛受精卵在體外培養6 7d后，將發育至囊胚期的胚胎在倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達情況，挑選表達EGFP的轉基因囊胚裝入胚胎移植管中，采用非手術法將胚胎移植到自然發情或同期發情處理的受體母牛的子宮角中，每頭母牛移植2枚胚胎。3個月后檢測受體水牛妊娠情況。其中，1頭受體母牛懷孕至足月后分娩，生下2頭水牛犢，2頭均成活。分別取2頭犢牛耳部組織進行PCR和Southern Blot等分子生物學技術鑒定，檢測到生產的水牛犢耳部組織表達有EGFP標記基因。
實施例
試驗共將6枚新鮮或冷凍/解凍的表達有EGFP基因的水牛受精卵胞質內注射DNA 的轉基因囊胚分別移植給3頭受體水牛的子宮角中，每頭受體牛移植2枚囊胚，其中有1 頭受體水牛獲得妊娠，經過妊娠足月后，產下2頭牛犢，均成活。取其耳部組織進行PCR和 Southern Blot等分子生物學技術鑒定，檢測到生產的水牛犢耳部組織均表達有EGFP標記基因。這一實施例證明，本發明利用受精卵胞質內注射DNA技術生產轉基因水牛的方法是可行的。
權利要求
1. 一種受精卵胞質內注射DNA生產轉基因水牛的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)水牛受精卵的制備從屠宰場收集的水牛卵巢上抽取的卵母細胞經體外成熟培養 24h后進行體外受精IVF，IVF后7 他，在體視顯微鏡下挑選排出第二極體的受精卵，(2)受精卵胞質內注射DNA制作水牛轉基因胚胎將攜帶有增強綠色熒光蛋白EGFP基因的轉基因載體PEGFP-Nl質粒DNA直接顯微注射到IVF后7 他的受精卵胞質中，注射的質粒DNA濃度為20μ g/ml，注射量為15 30pL，注射后的水牛受精卵置于顆粒細胞單層里共培養6 7d后，在熒光顯微鏡下檢測胚胎的EGFP表達情況，篩選獲得水牛轉基因胚胎， 25%轉基因胚胎發育至囊胚階段，63%的囊胚表達EGFP，(3)轉基因水牛的生產將挑選出表達EGFP的水牛轉基因囊胚移植到自然發情或同期發情處理的受體母水牛的子宮角中，每頭母牛移植2枚胚胎，受體水牛經妊娠足月后產下2 頭犢牛，分別取2頭犢牛耳部組織進行PCR和Southern Blot等分子生物學技術鑒定，檢測到用該方法生產的水牛犢耳部組織均表達有EGFP標記基因。
全文摘要
一種受精卵胞質內注射DNA生產轉基因水牛的方法。體外成熟的水牛卵母細胞經體外受精IVF后，將攜帶有增強綠色熒光蛋白EGFP基因的轉基因載體pEGFP-N1質粒DNA直接顯微注射到水牛受精卵胞質中，制作水牛轉基因胚胎，然后在倒置熒光顯微鏡下挑選表達EGFP的水牛轉基因囊胚，移植到受體水牛子宮角中，獲得轉基因水牛。采用本發明的方法，成功生產了表達EGFP的水牛轉基因囊胚，囊胚陽性率達到63％，胚胎移植后成功獲得2頭表達EGFP基因的轉基因水牛。應用本發明培育轉基因水牛，操作簡單，成本較低，使轉基因動物的培育過程大大簡化，這為轉基因動物的生產提供了一個重要的技術基礎，具有重要的理論意義和實際意義。
文檔編號A61D19/04GK102533856SQ201210007408
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者劉慶友, 孟凡麗, 李湘萍, 石德順, 羅嬋, 蔣建榮, 陸鳳花, 韋英明 申請人:廣西大學