專利名稱：五節芒多倍體誘導方法
技術領域：
本發明屬于植物細胞工程領域，涉及植物組織工程技術，具體地說是一種五節芒的多倍體誘導方法。
背景技術：
五節芒(MiscanthusfIoridulus)屬于禾本科(Poaceae)芒屬(Miscan thus Andersson)(陳守良，1997)，是一種高光效的C4植物，具有生物質產量高、抗逆性強、纖維素含量高、燃燒充分等特點，被認為是一種開發潛力巨大的生物質能源植物，在我國主要分布在熱帶和亞熱帶地區。目前，五節芒多倍體誘導方面的研究還未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種五節芒的多倍體誘導方法。五節芒多倍體誘導方法，包括如下步驟I)外植體的選擇與滅菌選用五節芒種子，在無菌操作臺上用70%酒精處理，再用O. I %的升汞消毒,最后用無菌水沖洗備用；2)胚性愈傷組織的誘導和分化將滅菌處理后種子，在超凈臺接種在愈傷組織誘導培養基MS+2-5mg/L 2，4_D ;暗培養，保持溫度24±2°C誘導愈傷組織(7天左右產生愈傷組織)，然后將愈傷組織接種在分化培養基MS+l-2mg/L6-BA中，分化條件為溫度24 ± 2 °C， 光照 2000Iux ；3)秋水仙素的處理將秋水仙素過濾滅菌，將分化后帶芽點的愈傷組織接種于添加質量百分比O. 05% -O. 2%的秋水仙素的基本培養基中，處理24h-72h ;(在試驗的幾個處理中，以秋水仙素O. 1%處理72h誘導率最高)4)叢生芽誘導或增殖將材料從秋水仙素處理培養基中取出，無菌水清洗，用滅菌過的濾紙吸干殘留水分；轉入分化增殖生根培養基MS+2mg/L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。多倍體鑒定在植株根長達l_2cm左右時，切取6_10mm根尖，進行染色體核型鑒定；染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。步驟I)中選用五節芒種子，在無菌操作臺上用70%酒精處理15-30秒，再用 O. I %的升萊消毒10 15分鐘,用無菌水沖洗6 7次備用。步驟2)中50ml三角瓶內每瓶接種15-20顆種子。步驟2)中，當愈傷組織長至直徑為O. 5-0. 8cm后進行分化，分化獲得帶芽點的愈傷組織或叢生芽；選取帶芽點的愈傷組織進行秋水仙素的處理。步驟2)中挑選淡黃色并致密的愈傷組織，接種在分化培養基中。步驟3)中所述的基本培養基為MS+0. 3%蔗糖+0. 7%瓊脂。步驟3)中優選將分化后帶芽點的愈傷組織接種于添加質量百分比為O. 1%-0. 2%的秋水仙素的基本培養基中， 處理 24h-72h。
步驟4)中將材料從秋水仙素處理培養基中取出，用滅菌過的濾紙吸干殘留液后， 無菌水清洗3次，每次1-3分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留水分。本發明提出的五節芒多倍體誘導方法，利用五節芒種子為外植體，取材不受季節限制，通過愈傷誘導，秋水仙素誘變，愈傷組織分化成苗，多倍體鑒定，最終得到多倍體材料，周期2-3個月，與常規育種相比，誘變時間大大縮短，為五節芒新品種選育提供了一條新途徑。


圖I為實施例I五節芒(M. floridulus) 02117 (2n)的核型圖；圖2為實施例I五節芒(M. floridulus) 02117 (4n)的核型圖。
具體實施例方式以下結合實施例進一步說明本發明，而不是限制本發明。實施例I取材五節芒(M. floridulus) 02117，采集自湖南郴州，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。I、外植體的選擇與滅菌選用五節芒(M. floridulus)飽滿完整種子,在無菌操作臺上用70%酒精處理15秒左右,再用O. I %的升汞消毒10分鐘,用無菌水沖洗6次備用；2、胚性愈傷組織的誘導將滅菌處理后種子，在超凈臺接種在愈傷組織誘導培養基MS+2mg/L2，4-D ；50ml接種瓶內每瓶接種20顆種子，暗培養，保持溫度24±2°C，7天左右產生愈傷組織；愈傷組織生長至直徑為O. 5-0. 8cm，挑選淡黃色并較為致密的愈傷組織， 接種在分化培養基為MS+lmg/L6-BA，分化條件為溫度24±2°C，光照20001ux。3、秋水仙素的處理將秋水仙素過濾滅菌，將帶芽點的愈傷組織接種于添加 O. 05%秋水仙素的基本培養基(MS+0. 3%蔗糖+0. 7%瓊脂)中，處理24h、48h、72h，各設3 次重復。4、叢生芽誘導或增殖將材料從秋水仙素處理培養基中取出，用滅菌過的濾紙吸干殘留液后，轉入滅了菌的三角瓶，加入無菌水，清洗3次，I次1-3分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留水分；將帶芽點的愈傷組織轉入分化增殖生根培養基MS+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。5、多倍體鑒定在植株根長達l_2cm左右時，切取6-10mm根尖，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。結果表明，隨著處理時間的延長愈傷組織死亡率提高，多倍體誘導率提高，嵌合體數目下降。表102117帶芽點愈傷組織秋水仙素誘變效果秋水仙素處理時間處理愈傷組死亡率嵌合體
的濃度(％) (h)織數(塊)(％)誘導率(％)(株)0.0524 50386. 710 0.0548 5043115 0.0572 5058253實施例2取材五節芒(M. floridulus) 04036，采集自陜西勉縣，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。I、外植體的選擇與滅菌選用五節芒(M. floridulus)飽滿完整種子,在無菌操作臺上用70%酒精處理20秒左右,再用O. I %的升汞消毒12分鐘,用無菌水沖洗7次備用；2、胚性愈傷組織的誘導將滅菌處理后種子，在超凈臺接種在愈傷組織誘導培養基MS+4mg/L2，4-D ；50ml接種瓶內每瓶接種15顆種子，暗培養，保持溫度24±2°C，7天左右產生愈傷組織；愈傷組織生長至直徑為O. 5-0. 8cm，挑選淡黃色并較為致密的愈傷組織， 接種在分化培養基為MS+1. 5mg/L6-BA，分化條件為溫度24±2°C，光照20001ux。3、秋水仙素的處理將秋水仙素過濾滅菌，將帶芽點的愈傷組織接種于添加 O. 1%秋水仙素的基本培養基(MS+0. 3%蔗糖+0. 7%瓊脂)中，處理24h、48h、72h，各設3次重復。4、叢生芽誘導或增殖將材料從秋水仙素處理培養基中取出，用滅菌過的濾紙吸干殘留液后，轉入滅了菌的三角瓶，加入無菌水，清洗3次，I次1-3分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留水分；將帶芽點的愈傷組織轉入分化增殖生根培養基MS+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。5、多倍體鑒定在植株根長達l_2cm左右時，切取6-10mm根尖，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。結果表明，隨著處理時間的延長愈傷組織死亡率提高，多倍體誘導率提高。表204036帶芽點愈傷組織秋水仙素誘變效果
秋水仙素處理時間~處理愈傷組死亡率嵌合體
的濃度(％)(h) 織數(塊)(％) 誘導率(％) (株)O. I24 505620O O. I48 505825 O O. I72 505938 O實施例3取材五節芒(M. floridulus) 06023，采集自廣西賀州，保存于湖南農業大學芒屬植物資源圃。I、外植體的選擇與滅菌選用五節芒(M. floridulus)飽滿完整種子,在無菌操作臺上用70%酒精處理30秒左右,再用O. I %的升汞消毒12分鐘,用無菌水沖洗7次備用；2、胚性愈傷組織的誘導將滅菌處理后種子，在超凈臺接種在愈傷組織誘導培養基MS+3mg/L2，4-D ；50ml接種瓶內每瓶接種15顆種子，暗培養，保持溫度24±2°C，7天左
5右產生愈傷組織；愈傷組織生長至直徑為O. 5-0. 8cm，挑選淡黃色并較為致密的愈傷組織， 接種在分化培養基為MS+2mg/L6-BA，分化條件為溫度24±2°C，光照20001ux。3、秋水仙素的處理將秋水仙素過濾滅菌，將帶芽點的愈傷組織接種于添加 O. 15%秋水仙素的基本培養基(MS+0. 3%蔗糖+0. 7%瓊脂)中，處理24h、48h、72h，各設3
次重復。4、叢生芽誘導或增殖將材料從秋水仙素處理培養基中取出，用滅菌過的濾紙吸干殘留液后，轉入滅了菌的三角瓶，加入無菌水，清洗3次，I次1-3分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留水分；將帶芽點的愈傷組織轉入分化增殖生根培養基MS+2mg/ L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。5、多倍體鑒定在植株根長達l_2cm左右時，切取6-10mm根尖，進行染色體核型鑒定。染色體數目以染色體組為單位成倍增加的即為多倍體。結果表明，隨著處理時間的延長愈傷組織死亡率提高，多倍體誘導率提高。表306023帶芽點愈傷組織秋水仙素誘變效果
權利要求
1.五節芒多倍體誘導方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)外植體的選擇與滅菌選用五節芒種子，在無菌操作臺上用70%酒精處理，再用0.I %的升汞消毒,最后用無菌水沖洗備用；2)胚性愈傷組織的誘導和分化將滅菌處理后種子，在超凈臺接種在愈傷組織誘導培養基MS+2-5mg/L2，4-D ;暗培養，保持溫度24±2°C誘導愈傷組織，然后將愈傷組織接種在分化培養基MS+l-2mg/L6-BA中，分化條件為溫度24±2°C，光照20001ux ；3)秋水仙素的處理將秋水仙素過濾滅菌，將分化后帶芽點的愈傷組織接種于添加質量百分比為0. 05% -0. 2%的秋水仙素的基本培養基中，處理24h-72h ；4)叢生芽誘導或增殖將材料從秋水仙素處理培養基中取出，無菌水清洗，用滅菌過的濾紙吸干殘留水分；轉入分化增殖生根培養基MS+2mg/L6-BA+0. 2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
2.根據權利要求I所述的誘導方法，其特征在于，步驟I)中選用五節芒種子，在無菌操作臺上用70%酒精處理15-30秒，再用0. 1%的升汞消毒10 15分鐘，用無菌水沖洗6 7次備用。
3.根據權利要求I所述的誘導方法，其特征在于，步驟2)中50ml三角瓶內每瓶接種15-20顆種子。
4.根據權利要求I所述的誘導方法，其特征在于，步驟2)中，當愈傷組織長至直徑為0. 5-0. 8cm后進行分化，分化獲得帶芽點的愈傷組織或叢生芽；選取帶芽點的愈傷組織進行秋水仙素的處理。
5.根據權利要求I或4所述的誘導方法，其特征在于，步驟2)中挑選淡黃色并致密的愈傷組織，接種在分化培養基中。
6.根據權利要求I所述的誘導方法，其特征在于，步驟3)中所述的基本培養基為MS+0. 3%蔗糖+0. 7%瓊脂。
7.根據權利要求I所述的誘導方法，其特征在于，步驟3)中將分化后帶芽點的愈傷組織接種于添加質量百分比為0. 1% -0. 2%的秋水仙素的基本培養基中，處理24h-72h。
8.根據權利要求I所述的誘導方法，其特征在于，步驟4)中將材料從秋水仙素處理培養基中取出，用滅菌過的濾紙吸干殘留液后，無菌水清洗3次，每次1-3分鐘；清洗后，用滅菌過的濾紙吸干殘留水分。
全文摘要
本發明公開了一種五節芒多倍體誘導方法，以五節芒的種子為外植體，誘導獲得胚性愈傷組織之后，對帶芽點的愈傷組織進行多倍體誘變，0.1％秋水仙素處理愈傷組織72h左右，可誘導獲得四倍體再生植株，低濃度的秋水仙素不能產生加倍效應，高濃度會導致愈傷組織死亡或嚴重抑制愈傷組織再生能力。本發明提出的五節芒多倍體誘導方法，利用五節芒種子為外植體，取材不受季節限制，通過愈傷誘導，秋水仙素誘變，愈傷組織分化成苗，經過鑒定，最終得到多倍體材料，周期2-3個月，與常規育種相比，誘變時間大大縮短，為五節芒新品種選育提供了一條新途徑。
文檔編號A01H4/00GK102577982SQ20121008021
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者劉清波, 易自力, 肖亮, 蔣建雄, 陳智勇 申請人:湖南農業大學