專利名稱：一種龍竹組培苗工業化生產快繁方法
技術領域：
本發明涉及到龍竹ipendrocalamus giganteus)組織培養的方法,特別是運用新生枝條作為外植體來誘導叢生芽，之后增殖培養和生根培養的龍竹組培苗工業化生產快繁方法。
背景技術：
竹類的組織培養研究起始于1968年Alex-ander和Rao關于竹子合體胚的立體培養。從1982年Mehatas等首次報道印度箣竹(Bambus arundinacea)通過胚性愈傷組織獲得再生植株開始，到2006年輝朝茂等報道通過胚性愈傷組織獲得珍惜竹種巨龍竹Wendrocalamus sinicus)的再生植株為止，已有數十種竹類可以通過組織培養獲短時間得完整試管苗植株。但是，竹類的組織培養技術由于所涉及的誘導芽、增殖培養和生根幾個環節相比其他禾本科植物較困難，并且因竹種的不同而差異性較大，這使得竹類的組織培養技術還沒有廣泛的運用于實際生產。龍竹iPendrocalamus giganteus),又稱苦龍竹、大竹，為大型叢生竹，竿高約20-30m，徑粗20-30cm。是云南省適應栽培區域最廣，用途最多，經濟價值最高的竹種之一。基于龍竹在云南省的廣泛栽培與應用，與其它竹種相比，人們對其進行了更為詳細、全面的研究，特別是對竹材性能和組織結構特性方面的深入了解為利用龍竹資源優勢，彌補其存在的缺點提供了豐富的資料。竹類植物由于生長繁殖快、再生能力強、成材時間短而具有優于其它林木的天然優勢，也正因如此，在長久的栽培過程中，諸如龍竹等經濟竹種的苗木培育和豐產經營技術得到了較快的發展和推廣。傳統的龍竹育苗方式主要有埋節、竹苗分株與枝條扦插等，但遠遠達不到工業化生產規模的要求。伴隨著組織培養技術的不斷成熟，參考相關竹類資源組織培養的成功經驗，總結龍竹組織培養中存在的問題，在龍竹組織培養上的突破是實現龍竹的工業化大規模生產，推進其進一步開發利用的有效途徑。

發明內容
針對龍竹工業化組織培養面臨的外殖體滅菌消毒極其困難，誘導叢生芽成功率低，增殖培養不穩定，生根困難等一系列難題，本發明要解決以下幾方面難題，使得龍竹組培苗工業化生產能夠順利進行。I)外殖體滅菌消毒根據不同生長狀況的龍竹外殖體，配制相應的消毒液，采用發明的材料預處理方法，運用改進的消毒操作流程，使得外殖體消毒更為徹底，在很大程度上降低了污染率。2)叢生芽誘導采用發明的腋芽預處理方法和改進的芽誘導培養基，將有效的提高叢生芽誘導成功率。3)增殖培養鑒于龍竹的組織培養與其他竹種存在差異，設計出獨特的最為合理的龍竹增殖培養基，使其叢生苗增殖效果好且保持良好的遺傳性狀。4) 誘導生根同樣因為龍竹的組織培養與其他竹種存在差異，需要設計出獨特的最為合理的龍竹生根培養基，使得增殖苗能夠生根，并使生根率和生根效率達到最佳效果O5) 練苗和大田栽培根據龍竹組培苗的實際生長壯況，配制合理的練苗基質，采用適當的培養條件進行練苗培養，提高練苗的成活率。然后將成活的龍竹組培苗進行大田移栽，并進行實地栽培維護，保證成活和生長。本發明通過如下技術方案實現 一種龍竹組培苗工業化生產快繁方法，步驟如下
(1)外殖體的采集和前期處理采集生長狀況良好健康無病蟲害的一年生龍竹枝條，進行修剪去除次生枝葉，放置在4 8°C冰箱保存I 2天；然后按每個竹節一段將其削成小段，再削除竹節上的桿籜，并用紗布擦除枝桿表面的污垢，最后用無菌水洗凈；
(2)將洗好的龍竹枝條段在無菌條件下進行三次消毒處理首先用濃度75%的乙醇擦洗后用無菌水沖洗干凈；然后將龍竹枝條段投放到消毒瓶中濃度O. I 1%的升汞水溶液中進行第二次消毒10 20min ;再將龍竹枝條段投入濃度I. 5 5%的次氯酸鈉水溶液中進行第三次消毒；最后用無菌水沖洗3 5次；
(3)腋芽的誘導將經過消毒的龍竹枝條段插入芽誘導培養基中進行誘導培養，培養溫度為25V，先暗培養3 5天，然后再進行光照培養，光照強度為1000 1200LX ;所述的誘導培養基為 1/2MS，其中含有 6-BA 5. O 10. 0mg/L、2，4_D 2. O 5. Omg/L、NAA O. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(4)叢生芽誘導培養將龍竹枝條段在誘導培養階段誘導出來的側芽切割下，接種到叢生芽誘導培養基中進行光照培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養20 25天，從而誘導培養出大量的叢生芽；所述的叢生芽誘導培養基為3/4MS，其中含有6-BA 2. 5 5. 5mg/L、KTl. O 2. Omg/L>NAA O. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(5)繼代增殖培養上一步驟叢生芽誘導培養所形成的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于增殖培養基上進行繼代增殖培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養20 25天；使得龍竹叢生芽既有整體數量的增加，也有個體生物量的增長；繼代增殖培養基為 MS，其中 6-BA 2. O 4. Omg/L、ΚΤ0. 5 I. 5mg/L、NAA 0. 5 I. 5mg/L、蔗糖10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. 0g/L ；
(6)壯苗增殖培養將繼代增殖培養的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于壯苗增殖培養基上進行壯苗培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養10 15天，使得繼代增殖培養出的叢生苗長得更加茁壯；壯苗增殖培養基為MS，其中6-BA 0. 5 I. 5. 0mg/L、KTl. O I. 5mg/L、NAA 0. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(7)誘導生根培養把壯苗增殖培養的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于誘導生根培養基上進行生根培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養15 20天生根率為90%，培養25 35天生根率為95%，所述的誘導生根培養基為1/2MS，其中含有6-BA 0. I 0. 5mg/L、NAA L 5 5. 0mg/L、IAA I. 5 3. O mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊月旨3. 5 5. 0g/L ；
(8)練苗和大田栽培把生根苗放置到室溫下3 5天，洗凈培養基，然后用1000倍稀釋的多菌靈水溶液浸泡5 lOmin，再移栽到按質量比例為30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基質中，用遮光度為50 70%的遮陰網控光以保持土壤濕潤，溫度控制在23 28°C，待小竹苗長至15 20cm高時，移到苗圃中進行大田實地栽培。作為本發明的優選方案
步驟(2)中進行第二次消毒及第三次消毒過程中要不斷搖晃消毒瓶，使消毒液能夠很好的分散殺菌。 本發明以龍竹當年生枝條為外殖體，消毒后先用芽誘導培養基進行誘導培養得到無菌側芽，將其切下用增殖培養基進行增殖培養得到大量無性系植株，并進行壯苗培養，再將植株轉接到生根培養基上進行生根培養，最后得到完整的龍竹無性系植株。然后用組合基質進行龍竹試管苗大棚練苗，最后將成活的苗進行大田實地栽培。此發明運用獨特的試驗方法和改良的培養基，克服了龍竹組培過程中消毒、增殖、生根困難以及試管苗遺傳穩定性差的難題，使植物組織培養技術在大型叢生竹試管苗工業化生產領域得到更為廣泛的運用，并且取得了技術性的進展，為竹類資源的開發利用提供了良好的基礎技術支撐。
具體實施例方式實施例I
(1)外殖體的采集和前期處理采集生長狀況良好健康無病蟲害的一年生龍竹枝條，進行修剪去除次生枝葉，放置在4 8°C冰箱保存I 2天；然后按每個竹節一段將其削成小段，再削除竹節上的桿籜，并用紗布擦除枝桿表面的污垢，最后用無菌水洗凈；
(2)將洗好的龍竹枝條段在無菌條件下進行三次消毒處理首先用濃度75%的乙醇擦洗后用無菌水沖洗干凈；然后將龍竹枝條段投放到消毒瓶中濃度O. I 1%的升汞水溶液中進行第二次消毒10 20min，在此過程中要不斷搖晃消毒瓶，使得消毒液能夠很好的分散殺菌。再將龍竹枝條段投入濃度I. 5 5%的次氯酸鈉水溶液中進行第三次消毒，同樣要搖晃瓶子；最后用無菌水沖洗3 5次。(3)腋芽的誘導將經過消毒的龍竹枝條段插入芽誘導培養基中進行誘導培養，培養溫度為25°C，先暗培養3 5天，然后再進行光照培養，光照強度為1000 1200Lx ;所述的誘導培養基為 1/2MS，其中含有 6-BA 5. O 10. 0mg/L、2，4-D 2. O 5. 0mg/L、NAA O. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(4)叢生芽誘導培養將龍竹枝條段在誘導培養階段誘導出來的側芽切割下，接種到叢生芽誘導培養基中進行光照培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養20 25天，從而誘導培養出大量的叢生芽；所述的叢生芽誘導培養基為3/4MS，其中含有6-BA 2. 5 5. 5mg/L、KTl. O 2. Omg/L>NAA O. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(5)繼代增殖培養按照實際需求，所形成的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于增殖培養基上進行繼代增殖培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養20 25天；使得龍竹叢生芽既有整體數量的增加，也有個體生物量的增長；繼代增殖培養基為MS，其中 6-BA 2. O 4. Omg/L、ΚΤ0. 5 I. 5mg/L、NAA O. 5 I. 5mg/L、蔗糖 10 20mg/L和瓊脂3. 5 5. Og/L ；
(6)壯苗增殖培養將繼代增殖培養的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于壯苗增殖培養基上進行壯苗培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養10 15天，使得繼代增殖培養出的叢生苗長得更加茁壯；壯苗增殖培養基為MS，其中6-BA 0. 5 I. 5. Omg/L、KTl. O I. 5mg/L、NAA 0· 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(7)誘導生根培養把壯苗增殖培養的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于誘導生根培養基上進行生根培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養15 20天生根率為90%，所述的誘導生根培養基為1/2MS，其中含有6-BA O. I O. 5mg/L、NAA I. 5 5. Omg/L、IAA I. 5 3. O mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(8)練苗和大田栽培把生根苗放置到室溫下3 5天，洗凈培養基，然后用1000倍稀釋的多菌靈水溶液浸泡5 lOmin，再移栽到按質量比例為30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基質中，用遮光度為50 70%的遮陰網控光以保持土壤濕潤，溫度控制在23 28°C，待小竹苗長至15 20cm高時，移到苗圃中進行大田實地栽培。實施例2
(1)外殖體的采集和前期處理采集生長狀況良好健康無病蟲害的一年生龍竹枝條，進行修剪去除次生枝葉，放置在4 8°C冰箱保存I 2天；然后按每個竹節一段將其削成小段，再削除竹節上的桿籜，并用紗布擦除枝桿表面的污垢，最后用無菌水洗凈；
(2)將洗好的龍竹枝條段在無菌條件下進行三次消毒處理首先用濃度75%的乙醇擦洗后用無菌水沖洗干凈；然后將龍竹枝條段投放到消毒瓶中濃度O. I 1%的升汞水溶液中進行第二次消毒10 20min，在此過程中要不斷搖晃消毒瓶，使得消毒液能夠很好的分散殺菌。再將龍竹枝條段投入濃度I. 5 5%的次氯酸鈉水溶液中進行第三次消毒，同樣要搖晃瓶子；最后用無菌水沖洗3 5次。(3)腋芽的誘導將經過消毒的龍竹枝條段插入芽誘導培養基中進行誘導培養，培養溫度為25°C，先暗培養3 5天，然后再進行光照培養，光照強度為1000 1200Lx ;所述的誘導培養基為 1/2MS，其中含有 6-BA 5. O 10. 0mg/L、2，4-D 2. O 5. 0mg/L、NAA O. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ；
(4)叢生芽誘導培養將龍竹枝條段在誘導培養階段誘導出來的側芽切割下，接種到叢生芽誘導培養基中進行光照培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養20 25天，從而誘導培養出大量的叢生芽；所述的叢生芽誘導培養基為3/4MS，其中含有6-BA 2. 5 5. 5mg/L、KTl. O 2. Omg/L>NAA 0. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. 0g/L ；
(5)誘導生根培養把叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于誘導生根培養基上進行生根培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養25 35天，生根率為95%，所述的誘導生根培養基為1/2MS，其中含有6-BA 0. I 0. 5mg/L、NAA I. 5 5. 0mg/L、IAAI. 5 3. O mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. 0g/L ；
(6)練苗和大田栽培把生根苗放置到室溫下3 5天，洗凈培養基，然后用1000倍稀釋的多菌靈水溶液浸泡5 lOmin，再移栽到按質量比例為30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基質中，用遮光度為50 70%的遮陰網控光以保持土壤濕潤，溫度控制在23 28°C，待小竹苗長至15 20cm高時，移到苗圃中進行大田實地栽培。
權利要求
1.一種龍竹組培苗工業化生產快繁方法，其特征在于步驟如下 (1)外殖體的采集和前期處理采集生長狀況良好健康無病蟲害的一年生龍竹枝條，進行修剪去除次生枝葉，放置在4 8°C冰箱保存I 2天；然后按每個竹節一段將其削成小段，再削除竹節上的桿籜，并用紗布擦除枝桿表面的污垢，最后用無菌水洗凈； (2)將洗好的龍竹枝條段在無菌條件下進行三次消毒處理首先用濃度75%的乙醇擦洗后用無菌水沖洗干凈；然后將龍竹枝條段投放到消毒瓶中濃度O. I 1%的升汞水溶液中進行第二次消毒10 20min ;再將龍竹枝條段投入濃度I. 5 5%的次氯酸鈉水溶液中進行第三次消毒；最后用無菌水沖洗3 5次； (3)腋芽的誘導將經過消毒的龍竹枝條段插入芽誘導培養基中進行誘導培養，培養溫度為25V，先暗培養3 5天，然后再進行光照培養，光照強度為1000 1200LX ;所述的誘導培養基為 1/2MS，其中含有 6-BA 5. O 10. 0mg/L、2，4_D 2. O 5. Omg/L、NAA O. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ； (4)叢生芽誘導培養將龍竹枝條段在誘導培養階段誘導出來的側芽切割下，接種到叢生芽誘導培養基中進行光照培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養20 25天，從而誘導培養出大量的叢生芽；所述的叢生芽誘導培養基為3/4MS，其中含有6-BA 2. 5 5.5mg/L、KTl. O 2. Omg/L>NAA O. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ； (5)繼代增殖培養上一步驟叢生芽誘導培養所形成的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于增殖培養基上進行繼代增殖培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養20 25天；使得龍竹叢生芽既有整體數量的增加，也有個體生物量的增長；繼代增殖培養基為 MS，其中 6-BA 2. O 4. Omg/L、ΚΤ0. 5 I. 5mg/L、NAA 0. 5 I. 5mg/L、蔗糖10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. 0g/L ； (6)壯苗增殖培養將繼代增殖培養的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于壯苗增殖培養基上進行壯苗培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養10 15天，使得繼代增殖培養出的叢生苗長得更加茁壯；壯苗增殖培養基為MS，其中6-BA 0. 5 I. 5. 0mg/L、KTl. O I. 5mg/L、NAA 0. 5 I. 5mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂 3. 5 5. Og/L ； (7)誘導生根培養把壯苗增殖培養的叢生芽切割分成帶2 3個小芽的小芽叢接種于誘導生根培養基上進行生根培養，光照強度為1000 1200Lx，25°C條件下培養15 20天生根率為90%，培養25 35天生根率為95%，所述的誘導生根培養基為1/2MS，其中含有6-BA 0. I 0. 5mg/L、NAA I. 5 5. 0mg/L、IAA I. 5 3. O mg/L、鹿糖 10 20mg/L 和瓊脂3.5 5. 0g/L ； (8)練苗和大田栽培把生根苗放置到室溫下3 5天，洗凈培養基，然后用1000倍稀釋的多菌靈水溶液浸泡5 lOmin，再移栽到按質量比例為30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基質中，用遮光度為50 70%的遮陰網控光以保持土壤濕潤，溫度控制在23 28°C，待小竹苗長至15 20cm高時，移到苗圃中進行大田實地栽培。
2.根據權利要求I所述的龍竹組培苗工業化生產快繁方法，其特征在于，步驟(2)中進行第二次消毒及第三次消毒過程中要不斷搖晃消毒瓶，使消毒液能夠很好的分散殺菌。
全文摘要
本發明公開一種龍竹組培苗工業化生產快繁方法，以龍竹當年生枝條為外殖體，消毒后先用芽誘導培養基進行誘導培養得到側芽，將其切下用增殖培養基進行增殖培養得到大量無性系植株，并進行壯苗培養，再將植株轉接到生根培養基上進行生根培養，最后得到完整的龍竹無性系植株。然后用組合基質進行龍竹試管苗大棚練苗，最后將成活的竹苗進行大田實地栽培。本發明運用獨特的試驗方法和改良的培養基，克服了龍竹組培過程中消毒、增殖、生根困難以及試管苗遺傳穩定性差的難題，使植物組織培養技術在大型叢生竹試管苗工業化生產領域得到更為廣泛的運用，并且取得了技術性的進展，為竹類資源的開發利用提供了良好的基礎技術支撐。
文檔編號A01H4/00GK102919124SQ201210446650
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月11日 優先權日2012年11月11日
發明者潘恒, 張紹智 申請人:云南禾起生物科技有限公司