專利名稱：生產(chǎn)還原型谷胱甘肽的重組菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘肽的微生物及其制備方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽(GSH)是生物體內(nèi)一種重要的非蛋白巰基化合物，在醫(yī)學(xué)和化妝品，食品加工，蛋白純化等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[Sies H. (1999)Free Rad Biol Med. 27，916-921 ； Henry Jay Forman et, al, (2009)Molecular Aspects of Medicine 30,1-12;鄭云朗 (1995)生物學(xué)通報(bào) 30，22-24 ；Castro, VM. et, al (1993), Biochem J 292,371-377]。自上世紀(jì)70年代日本協(xié)和公司(Kyowa Hakko Kogyo Co.)使用發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽工業(yè)化以后，發(fā)酵法生產(chǎn)GSH就成為其工業(yè)生產(chǎn)研究的主要方法[Sakato，K. and Tanaka H. 1992，Biotechnol. Bioeng. 40，904-912]。為此，上世紀(jì)七十年代后，各國(guó)開(kāi)始對(duì)生物法合成GSH進(jìn)行了大量研究，發(fā)表了大量文章和申請(qǐng)并公布了一系列相關(guān)專利 [Kimura A. (1986)Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. ,33,1-51, Nanjo, H. , Yamashita, K., et.，al (1986)公開(kāi)特許公報(bào) 61-52299 ；Tezuka, H.，Otake，Y.，Yabushi，et.，al (1987)公開(kāi)特許公報(bào) 62-275685 ；Christine, L.，Ulf, S. (1989) Eur. Pat. Appl. EP 300168 ；王紹校， (2005).中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)；饒志明等O007).應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，13 :257-260; 饒志明等(2007)，食品與發(fā)酵工業(yè).33 1-4 ；蔡宇杰等，食品與機(jī)械，23，16-19 ；US Patent 6902912 ；US Patent 4598046 ；US Patent 4582801 ；JP19890032584 ；W02004/003217A1 ； EP1539982 ；US Patent 20050239164 ；CN200810019761. 6] 其中，發(fā)酵菌株的選育主要集中在酵母(如 Saccharomyces cervisiae、Pichia pastoris、Candida utilis)禾口大腸桿菌等微生物，通常的方法是在育種中利用基因重組技術(shù)使微生物細(xì)胞表達(dá)GSH相關(guān)合成相關(guān)基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使細(xì)胞內(nèi) GSH合成酶活增加，從而提高GSH產(chǎn)量。谷胱甘肽作為細(xì)胞內(nèi)重要的多功能因子，其合成與調(diào)控等機(jī)理復(fù)雜。Alfafara等人研究表明，胞內(nèi)半胱氨酸的濃度是GSH合成產(chǎn)量的限制因素 [Alfafara et, al. 1992，Appl. microbiol. biotechol. 36，358-540]。發(fā)酵添加半胱氨酸直接提高 GSH 的產(chǎn)量[Wen，S. et, al. 2004，Enzyme Microbial, tech. 35，501-507]。GSH 的生產(chǎn)中如果增加細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸相對(duì)含量、就可以減少外源半胱氨酸添加量，提高半胱氨酸轉(zhuǎn)化率，生產(chǎn)成本將會(huì)大大降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先提供一種生產(chǎn)谷胱甘肽的重組菌株。本發(fā)明還提供所述重組菌株的制備方法。本發(fā)明還提供所述重組菌株在發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的生產(chǎn)谷胱甘肽的重組菌株，其谷胱甘肽合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)途徑上的基因被失活或敲除。
3
本發(fā)明中谷胱甘肽合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)，可以采用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)谷胱甘肽相關(guān)合成酶，也可以表達(dá)谷胱甘肽相關(guān)合成酶正調(diào)控蛋白。谷胱甘肽相關(guān)合成酶可以選擇來(lái)源各種生物的谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl或突變體和谷胱甘肽合成酶gsh2或突變體，如酵母、大腸桿菌、高等動(dòng)植物等，也可以選擇雙功能酶gshF或其突變體，如多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida)的gshF基因。本發(fā)明中谷胱甘肽合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)，也可以表達(dá)谷胱甘肽相關(guān)合成酶基因轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)蛋白(如Yaplp、Met4)啟動(dòng)谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因轉(zhuǎn)錄。 優(yōu)選的，所述的重組菌選擇真菌，特別是酵母菌，在本發(fā)明中最優(yōu)選為畢赤酵母。在本發(fā)明重組菌株的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，其內(nèi)源的半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)途徑上的基因和/或被失活或敲除，更優(yōu)選的，Str3基因被失活。本發(fā)明提供的所述重組菌株的制備方法，以畢赤酵母為出發(fā)菌株為例，表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌gshl和gsh2并且基因失活為例，包括如下步驟1)將大腸桿菌gshl和gsh2的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，獲得表達(dá)大腸桿菌gshl 和gsh2基因的畢赤酵母。2)將步驟1)獲得的畢赤酵母通過(guò)同源重組失活內(nèi)源的基因，從而獲得表達(dá)谷胱甘肽合成失調(diào)，半胱氨酸向高半胱氨酸的循環(huán)途徑被切斷的新菌株。本發(fā)明中基因表達(dá)可以采用商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)，也可以采用改造表達(dá)系統(tǒng)；表達(dá)載體可以選擇游離質(zhì)粒，也可以選擇整合基因組。本發(fā)明中基因表達(dá)啟動(dòng)子可以選擇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，也可以選擇組成型啟動(dòng)子或其突變體，以酵母菌為出發(fā)菌株優(yōu)選為GAP，YPT1，PGK， ADHl，TEF, HXK2等啟動(dòng)子中的幾種或一種。在本發(fā)明中菌株的相關(guān)基因突變或修飾可以通過(guò)同源重組-反篩選基因修飾技術(shù)，也可以轉(zhuǎn)座技術(shù)來(lái)構(gòu)建多基因突變或修飾。本發(fā)明的微生物菌株用于本領(lǐng)域已知的方法在發(fā)酵罐內(nèi)制備谷胱甘肽。舉例言之，所用的碳源可以是葡萄糖、淀粉糖、糖蜜或其他糖類，而所用氮源可以是銨或蛋白水解物。舉例言之，所用的硫源可以是硫酸鹽和含硫氨基酸等。在本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，表達(dá)gshl和gsh2基因的重組菌株，在添加外源半胱氨酸的情況下合成谷胱甘肽，雖然可以達(dá)到一定產(chǎn)量，但是存在半胱氨酸轉(zhuǎn)化效率低下。當(dāng)切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)，在添加外源半胱氨酸的情況下合成谷胱甘肽，同表達(dá)gshl和gsh2基因的對(duì)照菌株相比達(dá)到相同產(chǎn)量時(shí)，可以大大提高外源半胱氨酸轉(zhuǎn)化效率和縮短發(fā)酵時(shí)間。使用本發(fā)明的方法構(gòu)建的微生物菌株發(fā)酵培養(yǎng)，其谷胱甘肽的產(chǎn)量顯著高于目前報(bào)道的谷胱甘肽發(fā)酵生產(chǎn)的最高水平，提高了原料利用效率，降低了生產(chǎn)成本，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為ρ Pic G1G2的質(zhì)粒圖譜。圖2所示為失活切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)。圖3所示為str3基因失活突變過(guò)程示意圖。圖4所示為切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)途徑對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在下實(shí)施例中未注明的具體的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》、《pichia protocols》(Humana Press)中所說(shuō)的方法或廠商提供的方案進(jìn)行。本發(fā)明實(shí)施例中，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(包括=Pichia pastoris X33、pPIC3. 5K、 pGAPZB、pGAPZC 等)、合成引物等購(gòu)于 invitrogen 公司，其中 Pichia pastoris X33 為出發(fā)菌株。KOD聚合酶、PCR純化試劑盒、膠回收純化試劑盒、DNA抽提試劑盒、堿性磷酸酶、 部分限制性內(nèi)切酶、DH5ci、G418、ZeCOin、氨芐等購(gòu)于上海悅克生物科技有限公司；Taq酶、 T4連接酶、部分限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒PMDT-18、質(zhì)粒PUC18購(gòu)于Takara公司；同源重組-反篩選系統(tǒng)質(zhì)粒PPicZ mazF(A0Xl-mazF-Zeocin，圖3)是本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)[Yunjie Y. et， al. 2009，TEMS Yeast Res. 9，600-609]方法構(gòu)建。試劑除特殊要求外，均為國(guó)產(chǎn)試劑。電轉(zhuǎn)參照pichia expression Kit手冊(cè)中提供方法進(jìn)行。實(shí)施例1谷胱甘肽合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)菌株X33 (gshl, gsh2)的構(gòu)建1)引物gshl-Ι tgaaGGTACCTTGATCCCGGACGTATCACAGGC(SEQ ID No. 1)gsh 1-2 :atgaTCTAGAATCAGGCGTGTTTTTCCAGCCAC(SEQ ID No. 2)gsh2-l :atcaGAATTCATGATCAAGCTCGGCATCGTGA(SEQ ID No. 3)gsh 2-2 :attaCTCGAGTTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTC xhol(SEQ ID No. 4)GAPG1G2-1 CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAAC (SEQ ID No. 5)GAPG1G2-2 :GTAACCATGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTGT(SEQ ID No. 6)2)方法本實(shí)施例采用組成型啟動(dòng)子GAP表達(dá)來(lái)源大腸桿菌的gshl和gsh2基因來(lái)解除GSH轉(zhuǎn)錄調(diào)控。具體方法如下用引物gshl-Ι和gsh 1-2PCR擴(kuò)增大腸桿菌Dffia的gsh 1基因(EcoGene登錄號(hào) EG10418)，經(jīng)過(guò)Kpn I、Xba I雙酶切后連接相同酶切的質(zhì)粒pGAPZB，得到pGAPGl ；用引物gsh2_l和gsh 2-2PCR擴(kuò)增大腸桿菌Dffia的gsh 2基因(EcoGene登錄號(hào) EG10419) J^lEcoR I、Xho I雙酶切后連接相同酶切的質(zhì)粒pGAPZB，得到pGAPG2。pGAPG2 用Bgl II, BamH I雙酶切后連接到BamH I酶切并經(jīng)過(guò)堿性磷酸酶處理的pGAPGl，得到 PGAPG1G2。以 pGAPGlG2 為模板，GAPG1G2-1 和 GAPG1G2-2 為引物的 PCR產(chǎn)物經(jīng) Bgl II,Nco I 酶切連接到Nco I/BamH I酶切的pPIC3.阢得到質(zhì)粒pPicGlG2 (圖1)。pPicGlG2經(jīng)過(guò)&ic I酶切線性化后電轉(zhuǎn)Pichia pastoris X33，G418平板篩選得菌株X33 (gshl，gsh2)。挑取陽(yáng)性克隆菌落，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)保種。將其陽(yáng)性克隆菌株命名為ZX067。實(shí)施例2切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)
切斷半胱氨酉髮向高半胱氨酸循環(huán)示意圖如圖2所示。
1)引物
Pst3-1-1:5，TACCAGCAGCAACAGTATGAATGAGATCTC(SEQ ID No. 7)
Pst3-l-2:5，GCGTTCCCGCTCAATAATTACTC(1653-1675)(SEQ ID No. 8)
Pst3-3-l:5，GTCCTGCCTAAACGTTGCAGTC(2724-2745)(SEQ ID No. 9)
Pst3-3-2:5，actactgcaGGGGCATCACAGCTCCCTTCTTG(SEQ ID No. 10)
5
Pst3-l-3-l-3，GACTGCAACGTTTAGGCAGGACGCGTTCCCGCTCAATAATTACTCTGAT(SEQ ID No. 11)str3-l-r :TGCCCAGTTCCACCCTTTCC (SEQ ID No. 12)P5AOX-1 :AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTG(SEQ ID No. 13)Pzeo-2 :TGGCCTTTTGCTCACATGTTGGTCTCC(SEQ ID No. 14)2)方法(如圖3，基因突變經(jīng)過(guò)a、b、c、d四個(gè)步驟)①Str3 基因克隆(GeneID :8199046 ；NCBI)X33基因組為模板，Pst3-l_l和為引物的PCR產(chǎn)物用Bgl Il.Pst I酶切后，經(jīng)膠回收試劑盒回收產(chǎn)物連接到BamH I.Pst I酶切的pUC18得pUCstr3。②基因突變體反篩選盒(圖3a)將以pPicZ mazF為模板，以P5Aox_l和Pzeo-2為引物的PCR產(chǎn)物 AOXl-mazF-Zeocin反篩選盒插入經(jīng)SnaBI酶切并經(jīng)過(guò)堿性磷酸酯酶處理后的質(zhì)粒pUCstr3 中得質(zhì)粒 pUCstr3: (AOXl-mazF-Zeocin)。③基因體外突變構(gòu)建(圖北)以pUCstr3為模板，以和Pst3_l_2為引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物I3StS-I ；以pUCstr3為模板，以和Pst3_3_2為引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物；以I3StS-I為模板，以I3StS-I-I和Ι^ 3-1-3-1-3，為引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物 I^t3-l-3-5’，其3’端帶有I^t3-3的部分5’堿基序列；以 Pst3-l-3_5，和 Pst3_3 為模板，以 Pst3_l_l 和 Pst3_3_2 為引物擴(kuò)增得到 PCR 產(chǎn)物I^t3-l-3，其為去除部分堿基序列的基因的Δ str3 (SEQ ID No. 15)④基因突變(圖3c和d)以 pUCstr3: (AOXl-mazF-Zeocin)為模板，以 str3-l_l，和 Pst3_3_2 為引物擴(kuò)增得到 PCR 產(chǎn)物 str3: (AOXl-mazF-Zeocin)。將上述 str3: (AOXl-mazF-Zeocin) PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)X33(gshl，gsh2)經(jīng)hoc in篩選陽(yáng)性克隆菌落得X33(gshl，gsh2， str3: (AOXl-mazF-kocin))。將 PCR 產(chǎn)物 Pst3_l_3 (SEQ ID No. 15)電轉(zhuǎn)導(dǎo)入 X33 (gshl， gsh2, str3:: (AOXl-mazF-Zeocin))，在含甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆菌落得 X33(gshl,gsh2, Δ str3) 0挑取陽(yáng)性克隆菌落，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)保種，將其陽(yáng)性克隆菌株命名為 ZX068。實(shí)施例3制備發(fā)酵生產(chǎn)GSH培養(yǎng)基1)發(fā)酵生產(chǎn)GSH搖瓶種子培養(yǎng)基采用YPD培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。2)搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨 5g/L，酵母膏 5g/L，KH2PO4 2. 82g/L，K2HPO4 9. 12g/L，MgSO4 lg/L，(MM)2SO4 2g/L，Nacl 0. 2g/L, Cacl 0. 2g/L, FeS047H20 0. lg/L，生物素 0. 4mg/l，泛酸鈣 0.8mg/l，肌醇 ％ig/l，煙酸 0.8mg/l，對(duì)甲苯磺酸 0.%ig/l，V B6 0. 6mg/l,V B2 0. 4mg/ 1，硫胺素 0. 6mg/l，硼酸 lmg/1，CuSO4 0. 6mg/l，KI 0. 2mg/l, MnSO4 0. 8mg/l, Na2MoO4 0. 4mg/l, ZnSO4 0.8mg/lo3)發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)GSH培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏 10g/L，KH2PO4 30g/L，MgSO4 2g/L，(NH4)2SO4
65g/L，NaCl 0. 4g/L，CaCl 0. 5g/L，F(xiàn)eS047H20 0. 2g/L，生物素 0. 8mg/l，泛酸 丐 1. 6mg/l，肌醇 8mg/l，煙酸 1.6mg/l，對(duì)甲苯磺酸 0.8mg/l，VB6 1.6mg/l,VB2 0.8mg/l，硫胺素 1.6mg/l, 硼酸 2mg/l, CuSO4 1. 6mg/l, KI 0. 4mg/l, MnSO4 1. 6mg/l, Na2MoO4 0. 8mg/l, ZnSO4 1. 6mg/ 1，聚醚泡敵少許。4)流加培養(yǎng)基1 葡萄糖700g/L，酵母膏40g/L。5)流加培養(yǎng)基2 =L-半胱氨酸鹽酸鹽120g/L。實(shí)施例4胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的含量檢測(cè)1)待測(cè)樣品的制備胞內(nèi)谷胱甘肽的含量采用以下方法處理取一定量的發(fā)酵液離心，去上清，加一定倍數(shù)稀釋，沸水5分鐘后冷卻，12000g離心20分鐘后上清液過(guò)濾，過(guò)濾液待上樣。2)色譜檢測(cè)色譜條件色譜柱C18 (4. 6X250mm)，磷酸鹽溶液(取磷酸二氫鉀6. 8克，庚烷磺酸鈉2.2克，加水溶解使成1000ml，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)-甲醇(97 3體積比)流速 lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。進(jìn)樣量為20微升。以還原型谷胱甘肽純品為標(biāo)準(zhǔn)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)檢測(cè)樣品峰面積計(jì)算待測(cè)樣品谷胱甘肽含量。實(shí)施例5切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)對(duì)搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響選取X33、ZX067、ZX068菌株，經(jīng)搖瓶種子培養(yǎng)基YPD中，30°C、280rpm培養(yǎng)M小時(shí)后，按照10% (ν/ν)接種量接種到50ml搖瓶培養(yǎng)基中Q50ml三角瓶)，30°C、280rpm培養(yǎng)。 分別于24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)每次補(bǔ)加“流加培養(yǎng)基1”0· 8ml和“流加培養(yǎng)基2”0· 8ml, 并與36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中還原性谷胱甘肽GSH的含量。檢測(cè)結(jié)果如表1所示表1 GSH的搖瓶產(chǎn)量(g/L)
菌株基因型發(fā)酵時(shí)間36 h48 h60 hX33野生型0.050.090.02ZX067X33 (gshl,gsh2)0.230.450.42ZX068X33 ( gshl,gsh2,Astr3 )0.390.590.76從表1中可以看出，僅切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)，在相同條件下，與沒(méi)有切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)菌株相比，大大提高了底物轉(zhuǎn)化效率以及縮短發(fā)酵時(shí)間。實(shí)施例6切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響采用實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基，選取ZX067、ZX068菌株，經(jīng)搖瓶種子培養(yǎng)基YPD中， 30°C、280rpm培養(yǎng)M小時(shí)后，按照10% (ν/ν)接種量接種到15L發(fā)酵培養(yǎng)基中(30L發(fā)酵罐)，30°C發(fā)酵，流加氨水控制pH7. 0，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、溫度、罐壓、通風(fēng)量等控制溶氧D030%。發(fā)酵過(guò)程流加“流加培養(yǎng)基1”，控制葡萄糖含量為20-30g/L，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到0D6(i(i150時(shí)，開(kāi)始添加“流加培養(yǎng)基2”，繼續(xù)發(fā)酵至GSH含量不積累為止(50-70小時(shí))。 發(fā)酵自開(kāi)始添加“流加培養(yǎng)基2”每4時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中GSH產(chǎn)量，結(jié)果如圖4，發(fā)酵產(chǎn)量 ZX068菌株同ZX067相比，發(fā)酵產(chǎn)量大大提高，超過(guò)歷史報(bào)道水平7g/L ；同時(shí)半胱氨酸轉(zhuǎn)化
7生產(chǎn)谷胱甘肽的轉(zhuǎn)化率(摩爾)也由52-60%提高75-83%。 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所用的菌株、啟動(dòng)子等僅用作說(shuō)明之用，不能用來(lái)限制本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可對(duì)微生物，谷胱甘肽相關(guān)合成酶或突變體、啟動(dòng)子或突變體用來(lái)同本實(shí)施例結(jié)果進(jìn)行比較優(yōu)化(對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量影響)，這種優(yōu)化是顯而易見(jiàn)的。因此，選擇實(shí)施例以外的其他微生物、其他谷胱甘肽相關(guān)合成酶或突變體、啟動(dòng)子或突變體以及切斷半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)的其他基因同樣適用本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)谷胱甘肽重組菌株，其特征在于，其谷胱甘肽合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)途徑上的基因被失活或敲除。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，采用組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)谷胱甘肽相關(guān)合成酶基因gshl和gsh2基因或表達(dá)谷胱甘肽雙功能合成酶gshF基因，使谷胱甘肽合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌株，其特征在于，內(nèi)源的半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)途徑上的基因失活或敲除。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的重組菌株，其為真菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌株，其為酵母菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌株，其為畢赤酵母。
7.制備權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的重組菌株的方法，其包括如下步驟1)將大腸桿菌gshl和gsh2的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，獲得表達(dá)大腸桿菌gshl和 gsh2基因的畢赤酵母。2)將步驟1)獲得的畢赤酵母通過(guò)同源重組-反篩選基因修飾技術(shù)失活內(nèi)源基因，從而獲得表達(dá)谷胱甘肽合成失調(diào)，半胱氨酸向高半胱氨酸的循環(huán)途徑被切斷的新菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，表達(dá)大腸桿菌gshl和gsh2的啟動(dòng)子為GAP、 YPTl、PGK、ADHl、TEF、HXK2 中的一種或一種以上。
9.權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的重組菌株在發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)谷胱甘肽重組菌株，其谷胱甘肽合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)途徑上的基因被失活或敲除。本發(fā)明提供的菌株切斷了半胱氨酸向高半胱氨酸循環(huán)，在添加外源半胱氨酸的情況下合成谷胱甘肽，同表達(dá)gsh1和gsh2基因的對(duì)照菌株相比達(dá)到相同產(chǎn)量時(shí)，可以大大提高外源半胱氨酸轉(zhuǎn)化效率和縮短發(fā)酵時(shí)間。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102433265SQ20111034387
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者許善峰 申請(qǐng)人:鎮(zhèn)江市德?tīng)柹镏破费芯克邢薰?br>