專利名稱：酶法唾液酸檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗技術領域，具體涉及一種酶法唾液酸檢測試劑盒。
背景技術：
N-乙酰神經氨酸(N-Acetylneuraminic Acid，NANA)，俗稱唾液酸(Sialic acid, SA)，是多種天然神經氨酸衍生物之一，其母體結構是九個碳原子組成的內環氨基酸，是一族化合物的總稱，它由于最初從頌下腺粘蛋白中分離出而得名。唾液酸分布于哺乳動物體內，血管內皮細胞內含量尤其豐富。人體血清中總唾液酸(total sialic acid，TSA)含量約為1. 5 2. 5mmol/L，包括游離唾液酸和結合唾液酸。 其中游離唾液酸的含量較低，約為1 3ymol/L;與脂蛋白和糖蛋白結合的唾液酸即結合唾液酸，是血清中唾液酸的主要存在形式。唾液酸位于糖蛋白、糖脂的寡糖連的末端，與細胞識別、分化以及粘附有關，參與受體組成，并誘導細胞增殖、死亡。正常代謝時，人體血清中唾液酸含量穩定。當組織細胞惡變時，細胞表面糖蛋白在結構和功能上均發生明顯改變，結合在糖蛋白上的唾液酸隨異常表達的糖蛋白脫落入血， 是血液中唾液酸含量升高的原因之一。許多研究發現帶瘤動物及腫瘤患者的瘤體及血液中唾液酸含量增加并隨病情的加重而升高、隨病情的緩解而降低，因此在臨床檢驗中唾液酸常被作為惡性腫瘤存在和發展監控的一個指標，被廣泛地應用于很多腫瘤的診斷和監控中。目前，檢測總唾液酸含量的方法有很多，例如HPLC法、酶法、化學比色法(常見的有硫代巴比妥酸法、間苯二酚法)。HPLC方法具有靈敏度高、特異性好的優點，但是儀器昂貴且不適合臨床批量檢測。化學比色法雖然價格比較低，但是特異性低，操作復雜繁瑣，需要高溫萃取，不適合自動化分析，其試劑成分具有一定的腐蝕性和人體危害性。酶法通常通過神經氨酸苷酶(Neuraminidase，ΝΑ)來進行檢測血清樣本中的唾液酸含量。其反應原理為神經氨酸苷酶催化水解與糖蛋白、寡糖連接的N-乙酰神經氨酸殘基，使唾液酸糖苷鍵斷裂生成游離的N-乙酰神經氨酸，N-乙酰神經氨酸在神經氨酸醛縮酶的作用下生產成丙酮酸和甘露糖胺，丙酮酸與還原性輔酶(NADH)在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下生成乳酸和 NAD+，而NADH在340nm有特異性吸收，通過檢測NADH的減少量就可以檢測出血清樣本中的唾液酸含量。其反應過程如下
神經氨酸苷酶
唾液酸(結合型)- N-乙酰神經氨酸
N-乙酰神經氨酸神經氨酸醒縮f N-乙酰甘露糖胺+丙酮酸
丙酮酸 +NADH+ H+ _LDH_^ 乳酸 +NAD+ 酶分析法具有特異性高，操作簡單快捷、準確安全、可自動化分析的優點，但由于試劑中使用的還原性輔酶NADH在該反應條件下不穩定，必須制成干粉試劑才能長期保存穩定，復溶后必須盡快使用，否則在保存過程中由于NADH降解速度較快對試劑性能會造成 很大影響，無法滿足臨床檢測需要。同時神經氨酸苷酶、尤其是神經氨酸醛縮酶在該反應條 件下不穩定，效價降低很快，因此臨床上依然存在對測定準確、方便適用、穩定可靠、成本低 廉的酶法唾液酸檢測試劑盒的需要。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供ー種測定準確、方便適用、穩定可靠、成本低廉 的酶法唾液酸檢測試劑盒。本發明所采用的技術方案為一種酶法唾液酸檢測試劑盒，由以下兩種試劑構成，其中試劑1
緩沖液50-500mmol/L
神經氨酸苷酶1- 5 KU/L
乳酸脫氫酶1-5KU/L
表面活性劑0.1-100 g/L
穩定劑1-100 mmol/L
防腐劑0.1-100 g/L試劑2:
緩沖液50-500mmol/L
還原性輔酶1-20 mmol/L 神經氨酸醛縮酶 0.1-10 KU/L
穩定劑1-100 mmol/L
防腐劑0.1-100 g/L。所述試劑1和試劑2中的緩沖液為三羥甲基氨基緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、檸 檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫ニ鈉-檸檬酸緩沖液、MES緩沖液、Good’ S緩沖液、硼酸緩沖 液中的ー種或幾種，試劑1中緩沖液的PH為6. 0-8. 0，試劑2中緩沖液的pH為8. 5-10. 0。所述試劑1中的表面活性劑為非離子表面活性劑，進一歩優選為TWEEN系列表面 活性劑或SPAN系列表面活性劑或TRITON系列表面活性劑。所述試劑1和試劑2中的穩定劑為聚乙ニ醇、丙三醇、丙ニ醇、蔗糖、海藻糖、山梨 醇、BSA中的一種或者幾種。所述試劑1和試劑2中的防腐劑為山梨酸鉀、苯甲酸鈉、疊氮鈉、亞硝酸鈉、 Proclin300中的ー種或幾種。本發明試劑1和試劑2的配制方法為常規方法，即試劑1和試劑2所述組分分別 加入蒸餾水后各自混合攪勻即可。本發明酶法唾液酸檢測試劑盒測定樣本中的唾液酸的測試條件如下溫度30-37 V ；比色杯光徑為1.0cm。檢測主波長;MOnm，副波長405nm。應用本發明測定試劑盒測定樣本中唾液酸的方法如下樣品(校準管以校準品做 樣品)加試劑1混勻，30-37°C孵育3-5min后加入試劑2混勻，30_37°C反應90s后，監測 90s吸光度變化。其中樣本用量5-15 iU，試劑1用量240 iU，試劑2用量SOiU。本發明試劑盒測定樣本中唾液酸含量按以下公式進行計算
總唾液酸濃度mg/dl = - X 標準濃度
A標A 標堆空白本發明采用雙試劑的方法解決了酶法唾液酸檢測方法中NADH及關鍵工具酶不穩 定帶來的試劑檢測步驟復雜且不穩定的問題，得到的液體雙試劑2-8°C至少可穩定12個 月，能夠直接使用，無需復溶，方法簡便，易操作，可快速得到檢測結果，不需要特殊或額外 的儀器，便于行業內推廣應用。


圖1所示的是本發明酶法唾液酸檢測試劑盒的線性范圍實驗的數據分布圖。圖2所示的是本發明酶法唾液酸檢測試劑盒的方法學對比實驗的數據分布圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進ー步具體描述，但不局限于此。實施例1 酶法唾液酸檢測試劑盒，由以下兩種試劑構成，其中試劑1
三羥甲基氨基緩沖液(PH6.0) 50 mmol/L
神經氨酸苷酶1 KU/L
乳酸脫氫酶1 KU/L
TWEEN 800.1 g/L
BSA1 mmol/L
山梨酸鉀0.1 g/L試劑2
MES 緩沖液(pH 8.5) 50 mmol/L
NADH1 mmol/L
神經氨酸醛縮酶0.1 KU/L
乙ニ醇1 mmol/L
疊氮鈉0.1 g/L
試劑1和試劑2的配制方法為常規方法，即試劑1和試劑2所述組分分別加入蒸 餾水后各自混合攪勻即可。實施例2 酶法唾液酸檢測試劑盒，由以下兩種試劑構成，其中試劑1
甘氨酸-NaOH CpH 7.5)200 mmol/L
神經氨酸苷酶5 KU/L
乳酸脫氫酶5 KU/L
Tritonx X-IOO10g/L
山梨醇100 mmol/L
苯甲酸鈉10g/L試劑2
三羥甲基氨基緩沖液(pH 10.0) 200mmol/L
NADH20 mmol/L
神經氨酸醛縮酶10KU/L
蔗糖100 mmol/L
Proclin 30020 g/L實施例2試劑盒的制備方法同實施例1。實施例3酶法唾液酸檢測試劑盒，由以下兩種試劑構成，其中試劑1
Good's 緩沖液(pH7.0)100 mmol/L
神經氨酸苷酶2.5 KU/L
乳酸脫氫酶3 KU/L
TWEEN 2010 g/L
丙三醉10 mmol/L
Proclin 3001 g/L試劑2 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH9.0) 100 mmol/L NADH5 mmol/L
神經氨酸醛縮酶5 KU/L
海藻糖10 mmol/L
疊氮鈉0.1 g/L實施例3試劑盒的制備方法同實施例1。本發明酶法唾液酸檢測試劑盒測定樣本中的唾液酸的測試條件如下溫度 30-37 V ；比色杯光徑為1.0cm。檢測主波長;MOnm，副波長405nm。應用本發明測定試劑盒測定樣本中唾液酸的方法如下樣品(校準管以校準品做 樣品)加試劑1混勻，30-37°C孵育3-5min后加入試劑2混勻，30_37°C反應90s后，監測 90s吸光度變化。其中樣本用量8 ill，試劑1用量240 ill，試劑2用量80 ill。本發明試劑盒測定樣本中唾液酸含量按以下公式進行計算
權利要求
1.一種酶法唾液酸檢測試劑盒，其特征在于由以下兩種試劑構成，其中試劑1緩沖液50-:50-500 mmol/L神經氨酸苷酶 1- 5 KU/L 乳酸脫氫酶 1- 5 KU/L 表面活性劑 0.1-100 g/L穩定劑1-100 mmol/L防腐齊00.1-100 g/L試劑2緩沖液50-500 mmol/L還原性輔酶1-20 mmol/L神經氨酸醛縮酶 0.1-10 KU/L穩定劑防腐劑1-100 mmol/L 0.1-100 g/L0
2.根據權利要求1所述的酶法唾液酸檢測試劑盒，其特征在于所述試劑1和試劑2中的緩沖液為三羥甲基氨基緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、MES緩沖液、Good’ s緩沖液、硼酸緩沖液中的一種或幾種，試劑1中緩沖液的PH為6. 0-8. 0，試劑2中緩沖液的pH為8. 5-10. 0。
3.根據權利要求1所述的酶法唾液酸檢測試劑盒，其特征在于所述試劑1中的表面活性劑為非離子表面活性劑。
4.根據權利要求3所述的酶法唾液酸檢測試劑盒，其特征在于所述試劑1中的表面活性劑為TWEEN系列表面活性劑或SPAN系列表面活性劑或TRITON系列表面活性劑。
5.根據權利要求1所述的酶法唾液酸檢測試劑盒，其特征在于所述試劑1和試劑2中的穩定劑為聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一種或者幾種。
6.根據權利要求1所述的酶法唾液酸檢測試劑盒，其特征在于所述試劑1和試劑2中的防腐劑為山梨酸鉀、苯甲酸鈉、疊氮鈉、亞硝酸鈉、Proclin 300中的一種或幾種。
全文摘要
本發明提供了一種酶法唾液酸檢測試劑盒，該試劑盒由試劑1和試劑2兩種試劑構成，其中試劑1的各組分為緩沖液、神經氨酸苷酶、乳酸脫氫酶、表面活性劑、穩定劑、防腐劑，試劑2的各組分為緩沖液、還原性輔酶、神經氨酸醛縮酶、穩定劑、防腐劑。該試劑盒測定準確、方便適用、穩定可靠、成本低廉。
文檔編號C12Q1/32GK102399851SQ20111034390
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者沃燕波, 鄒炳德 申請人:寧波美康生物科技有限公司