專利名稱：中華按蚊抗藥性as-pcr檢測試劑盒及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種中華按蚊抗藥性AS-PCR檢測試劑盒及其專用引物。
背景技術：
中華按蚊(Anopheles sinensis)分布于我國除青海和新疆以外的所有省市，是我國平原水網和水稻種植地區的優勢蚊種，家野兩棲，白天多棲息在村莊四周的作物植棵和蘆葦叢、灌木叢中，部分棲息在牛房畜舍，偏嗜畜血(以牛、馬、豬等大牲畜為主)，兼吸人血，以成蚊越冬。中華按蚊是我國瘧疾的重要傳播媒介，尤其在北緯34°以北的地區，它是主要的或唯一的傳播媒介。目前，瘧疾尚無有效疫苗可用，控制瘧疾媒介的種群數量是防治瘧疾的重要手段。化學防治因其易操作，能夠迅速、有效地控制害蟲種群，在媒介昆蟲防制規劃中占有重要地位。過去幾十年來，針對中華按蚊的生活習性，用擬除蟲菊酯類殺蟲劑， 采用滯留噴灑和浸泡蚊帳等滅蚊防瘧措施，取得了顯著效果。然而，化學防治在充分發揮其優勢的同時，也帶來了負面效果，導致了中華按蚊抗藥性的產生。九十年代以來，國內各地報道的中華按蚊對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性越來越明顯。1993年重慶中華按蚊對溴氰菊酯和DDT達到初級抗性，1998年在云南采集的10個中華按蚊種群有5個對DDT產生抗性，1999年浙江溫州、寧波等地的中華按蚊種群達到高抗種群(R/S = 15-20)，2009年，江蘇部分地區的中華按蚊對溴氰菊酯產生了高度抗性。害蟲對殺蟲劑產生抗性以后，化學防治的效果就會隨著抗藥性的升高而下降，害蟲的防治也會受到嚴重的影響。為了應對害蟲種群的抗性，為了克服抗性達到預期的防治效果，殺蟲劑的使用量，包括單位面積的施藥量和施藥次數，就不得不持續增加，這無異于在持續增加殺蟲劑對媒介昆蟲抗性的選擇壓力，而且這種抗藥性還可向遠距離擴散，間接地還可能造成某些媒介疾病的發生與流行。從這些年對害蟲抗藥性的監測來看，抗藥性增長的速度遠大于新農藥、新劑型研發的速度。因此，如何加強媒介昆蟲的抗藥性治理、延緩抗藥性的產生和發展、延長現有殺蟲劑的使用壽命是害蟲治理中的重要內容。昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性主要是擊倒抗性(knockdown resistance, kdr), kdr基因在中華按蚊對擬除蟲菊酯的抗性中具有重要作用。擬除蟲菊酯的作用靶標主要是昆蟲電壓依賴性神經細胞膜上的鈉離子通道，離子通道上的作用靶點對殺蟲劑降低了敏感性而產生擊倒抗性，因此擊倒抗性不同于代謝抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制劑所降低。通過比較敏感、抗性中華按蚊的部分鈉通道序列，發現鈉通道基因的L1014F(亮氨酸到苯丙氨酸)即TTG — TTT的突變及L1014C(亮氨酸到半胱氨酸)即 TTG-TGT的突變和擊倒抗性相關。這是我國關于中華按蚊擊倒抗性及其基因突變的首次報道。kdr基因可以作為昆蟲對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態。譚偉龍等0011)用特異性等位基因PCR方法，對采江蘇、安徽的11個中華按蚊種群進行致死中濃度(LC50)和kdr基因頻率的測定，并且發現LC5tl為代表的高效氯氰菊酯抗性與中華按蚊kdr等位基因頻率之間存在正相關關系。研究說明Kdr基因可以作為中華按蚊對擬除蟲菊酯產生抗性的一個分子標記，通過監測kdr等位基因或基因型頻率，了解抗性基因在種群遺傳結構中的狀態，可以預測抗性的發生和發展。目前我國還沒有成型的針對中華按蚊的kdr抗性分子檢測方法和試劑盒。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的引物。本發明提供的引物由引物組A、引物組B和引物組C組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4 ；所述引物組C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列5。所述引物組A還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1 ；所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1 ；所述引物組C還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。所述引物組A由引物1-3組成；所述引物組B由引物1、2和4組成；所述引物組C由引物1、2和5組成；所述引物組A、所述引物組B和所述引物組C均為獨立包裝；所述突變位點為L1014F或L1014C。本發明的第二個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的PCR試齊IJ。本發明提供的PCR試劑，由試劑A、試劑B和試劑C組成；所述試劑A由所述引物組A和PCR緩沖液組成；所述試劑B由所述引物組B和PCR緩沖液組成；所述試劑C由所述引物組C和PCR緩沖液組成；所述引物1在其對應的所述試劑中的終濃度均為1. 33ng/yl ；所述引物2在其對應的所述試劑中的終濃度為eng/μ 1 ；所述引物3-5在其對應的所述試劑中的終濃度均為6. 67ng/yl ；所述突變位點為L1014F或L1014C。本發明的第三個目的是提供一種制備檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的試劑的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)分別將所述的引物中的所述引物組A、所述引物組B和所述引物組C進行獨立包裝，得到獨立包裝引物組A、獨立包裝引物組B和獨立包裝引物組C ；2)再將步驟1)得到的獨立包裝引物組A、步驟1)得到的獨立包裝引物組B和步驟1)得到的獨立包裝引物組C進行包裝，得到試劑；
所述突變位點為L1014F或L1014C。由所述的方法制備的試劑也是本發明保護的范圍。本發明第四個目的是提供一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的試劑盒。本發明提供的試劑盒，為如下1)或2)1)所示的試劑盒由試劑盒A、試劑盒B和試劑盒C組成；所述試劑盒A為含有所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒；所述試劑盒B為含有所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒；所述試劑盒C為含有所述PCR試劑中的試劑C的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有所述的試劑的試劑盒；所述突變位點為L1014F或L1014C。所述引物或所述試劑或所述試劑盒在檢測中華按蚊中kdr基因突變位點、檢測中華按蚊抗藥性或制備檢測中華按蚊抗藥性產品中的應用也是本發明保護的范圍；所述突變位點具體為L1014F或L1014C，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊
酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本發明第五個目的是提供一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的突變位點的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用所述引物或所述試劑或所述試劑盒中的所述引物組A、引物組B和引物組C分別對待測中華按蚊進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測各組引物擴增得到的產物，若所述引物組B擴增得到169bp產物，且所述引物C未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因的突變位點為或候選為L1014F ；若所述引物組C擴增得到169bp產物，且所述引物B未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因的突變位點為或候選為L1014C ；若所述引物組A擴增得到169bp產物，且所述引物組B和所述引物組C均未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因不含或候選不含有所述突變位點。本發明第六個目的是提供一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的基因型的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用所述引物或所述試劑或所述試劑盒中的所述引物組A引物組、引物組B引物組和引物組C引物組分別對待測中華按蚊進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測各組引物擴增得到的產物，若所述引物組B擴增得到169bp產物，且所述引物A和所述引物C均未擴增得到 169bp產物，則所述kdr基因為含有或候選含有突變位點L1014F的純合型基因；若所述引物組C擴增得到169bp產物，且所述引物A和所述引物B未擴增得到 169bp產物，則所述kdr基因為含有或候選含有突變位點L1014C的純合型基因；若所述引物組B和所述引物組C均擴增得到169bp產物，且所述引物A未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因為含有或候選含有突變位點L1014F和L1014C的雜合型基因；
若所述引物組A擴增得到169bp產物，且所述引物組B和所述引物組C均未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因為不含或候選不含有突變位點L1014F和L1014C的純合
型基因；所述PCR擴增中，以待測中華按蚊的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為55°C -60°C，退火溫度具體為55°C ；所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發明的技術原理在中華按蚊Kdr基因突變的基礎上，以突變位點的堿基為3' 末端，設計三條特異性內引物O種突變型和1種非突變型)，分別只能與2種突變的靶DNA 及非突變的靶DNA結合。同時，在突變堿基上下游處設計兩條非特異性外引物，利用Taq酶缺乏3' -5'外切酶活性的特點，在以突變型引物擴增正常DNA模板時，延伸反應會因磷酸酯鍵難于形成而不能進行，也就得不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA無此突變。反之，表明有突變產生。將突變型和非突變型引物分別用于同一 DNA模板的擴增，判斷有無特定位點基因的特定突變。本發明的實驗證明，本發明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的中華按蚊kdr突變等位基因檢測試劑盒，用來掌握中華按蚊與擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關的kdr等位基因的狀況。本發明的kdr突變等位基因檢測試劑盒針對中華按蚊kdr等位基因的基因型，分別設計了 3組特異性引物，可以快速偵別中華按蚊的kdr基因型。采用本發明的kdr突變等位基因檢測試劑盒，只需提取單只中華按蚊的DNA，因此對待測中華按蚊的數量沒有特殊的要求，另外還無需中華按蚊的飼養場所和設施，也不需要投入長時間的人力物力來觀察。被檢樣本能夠準確、有效、直接地檢測出點突變，能夠鑒定個體基因型。判斷kdr相關的基因型為研究德國小鐮對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性奠定基礎。


圖1為AS-PCR設計原理2為中華按蚊的基因組1014位點kdr等位基因的檢測結果圖3為各種基因型頻率與生物抗性表型的相關性
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、檢測中華按蚊鈉通道基因點突變方法的建立一AS-PCR法1、AS-PCR檢測原理及引物設計AS-PCR的原理是根據蚊蟲鈉通道基因突變特點，以突變位點的堿基為引物的 3'末端，設計兩條特異性引物(突變型和非突變型)，分別與突變的等位基因DNA序列及非突變的等位基因DNA序列結合。同時，在突變位點上下游分別設計兩條非特異性外引物，利用Taq酶缺乏3' -5'外切酶活性的特點，在以突變型引物擴增正常DNA模板時，PCR反應會因磷酸酯鍵難于形成而不能進行延伸，也就得不到特異長度的條帶，從而表明模板DNA 序列無此突變。反之，表明有突變產生。將突變型和非突變型引物分別用于同一樣品等位基因序列的擴增，判斷有無特定位點基因突變的等位基因序列。
根據中華按蚊鈉通道基因II S4- II S6部分序列(kdr敏感基因cDNA序列，其部分核苷酸序列為序列10 (L1014在此序列的核苷酸序列為四3-四5位TTG)，其氨基酸序列為序列11 (L1014在此序列的氨基酸序列為第107位)，在GENBANK的登錄號為JN002364，及抗性基因⑶NA序列(L1014F、L1014C)，設計一對非特異性外引物OTl和⑶2 (擴增對照條帶)。L1014F的1014位點為3，末端，分別設計三條特異性內引物Cgd3、Cgd4和Cgd5 (擴增特異條帶)。其中，Cgd3用于擴增非突變等位基因，Cgd4用于擴增突變F等位基因(TTT) 的第1014的氨基酸由亮氨酸突變為苯丙氨酸，Cgd5用于擴增突變C等位基因(TGT)的第 1014的氨基酸由亮氨酸突變為半胱氨酸，具體引物序列如下表1 :表1為AS-PCR引物序列表
引物名稱序列(5’—3')
CDl (上游)TGATCGTGTTTCGCGTGCTG (序列 1，引物 1)
CD2 (下游)GTCTCGTTATCCGCCGTTGG (序列 2，弓丨物 2)
Cgd3 (上游) CCCGGTGGTAATTGGAAACTTG (序列 3，引物 3) Cgd4 (上游) TGCGGTGGTAATTGGAAACTTT (序列 4，弓丨物 4) _Cgd5 (上游)_TGCGGTGGTAATTGGAAACTGT (序列 5，引物 5)合成上述AS-PCR引物，PAGE純化。2、AS-PCR 反應分別提取野外捕獲的編號為1-6的中華按蚊的基因組DNA，備用，得到編號為1_6 的待測樣本的DNA，分別將6種樣品進行如下檢測AS-PCR設計為平行三管法三個平行的PCR反應體系用于鑒定同一個體基因型， 一個反應體系(A管)引物為CDl、CD2、Cgd3，另一反應體系(B管)引物為CDl、CD2、Cgd4， 第三反應體系(C管)引物為⑶1、⑶2、Cgd5。若A管擴增出兩條特異條帶而B、C管只有一條帶，則個體基因型為敏感純合子(SQ ；若B管擴增出兩條特異條帶而A、C管只有一條帶，則個體基因型為抗性純合子(RR-F/F)，若C管擴增出兩條特異條帶而A、B管只有一條帶，則個體基因型為抗性純合子(RR-C/C)；若任意兩管均擴增出兩條特異條帶而第三管只有一條帶，則個體基因型為抗性雜合子(RR-F/C，RS-F, RS-C)；若三管同時擴增出兩條特異條帶，則試驗污染。其原理如圖1所示。A 管反應總體積 30 μ 1，包括 iTaq DNA Polymerase (TaKaRa, D7205) (0. 08U/ μ 1)0. 5 μ 1，10XPCR Buffer (TaKaRa) 3. 0 μ 1,4XdNTP (0. 17mM)2. 0μ 1，模板 DNA 1· 0μ 1， CDl (1. 33ng/ μ 1)0. 2 μ 1, CD2 (6ng/ μ 1)0. 9 μ 1, Cgd3 (6. 67ng/y 1) 1. 0 μ 1, ddH20 20. 5μ 1 ；B 管反應總體積 30 μ 1，包括 iTaq DNA Polymerase (TaKaRa, D7205) (0. 08U/ μ 1)0. 5 μ 1,10XPCR Buffer 3· 0 μ 1，4 X dNTP (0· 17mM) 2· 0 μ 1，模板 DNA 1. 0μ 1, CDl (1. 33ng/y 1)0. 2 μ 1, CD2 (6ng/ μ 1)0. 9 μ 1, Cgd4(6. 67ng/ μ 1) 1. 0 μ 1, ddH20 20. 5μ 1 ；C 管反應總體積 30 μ 1，包括 iTaq DNA Polymerase (TaKaRa, D7205) (0. 08U/ μ 1)0. 5 μ 1,10XPCR Buffer 3· 0 μ 1，4 X dNTP (0. 17mM) 2· 0 μ 1，模板 DNA 1. 0μ 1, CDl (1. 33ng/y 1)0. 2 μ 1, CD2 (6ng/ μ 1)0. 9 μ 1, Cgd5 (6. 67ng/ μ 1) 1. 0 μ 1, ddH2020. 5μ 1 ；反應條件為94 °C，8min ；94 "C，Imin, 55 "C，2min, 72 "C，2min, 40cycles ；72 °C， IOmin0若B擴增得到169bp產物，且A和C均未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因的突變位點為L1014F，所述kdr基因的基因型為RR ；RR表示純合型突變的kdr基因。若C擴增得到169bp產物，且A和B均未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因的突變位點為L1014C，所述kdr基因的基因型為RR ；RR表示純合型突變的kdr基因。若B和A均擴增得到169bp產物，且C未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因的突變位點為L1014F，所述kdr基因的基因型為RS ；RS表示雜合型突變的kdr基因。若C和A均擴增得到169bp產物，且B未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因的突變位點為L1014C，所述kdr基因的基因型為RS ；若A擴增得到169bp產物，且B和C均未擴增得到169bp產物，則所述kdr基因不存在突變位點，所述kdr基因的基因型為SS ；SS表示純合型未突變的kdr基因。結果如圖2所示，其中，1-6分別編號為1-6的中華按蚊，且每個編號的3條泳道從左到右均為A、B和C管，Marker為DNA Marker。263bp為非特異性外引物的擴增帶(由 CDl和CD2擴增得到對照PCR產物，測序為序列6)，169bp為特異性內引物的擴增帶(分別由CD2和Cgd3、Cgd4或Cgd5擴增得到)。編號為1的中華按蚊僅A管中有長度為169bp的片段1 (經過測序，為序列7，其中第20-22位核苷酸為TTG)，說明這一樣本不存在kdr突變基因，為kdr敏感純合子SS，存在純合型未突變的kdr基因；編號為2的中華按蚊僅B管中有長度為169bp的片段(經過測序，為序列8，自5’ 末端第20-22位核苷酸為TTT)，說明這一樣本為kdr突變基因的純合子；說明存在純合型突變的kdr基因，kdr基因的突變位點為L1014F。編號為3的中華按蚊僅C管中有長度為169bp的片段(經過測序，為序列9，自5’ 末端第20-22位核苷酸為TGT)，說明這一樣本為kdr突變基因的純合子；說明存在純合型突變的kdr基因，kdr基因的突變位點為L1014C。編號為4的中華按蚊在B管和C管中同時出現長度為169bp的片段(經過測序， B管為序列8、C管為序列9)，說明這一樣本為說明這一樣本為F型突變和C型突變同時存在于一個個體的抗性雜合子.編號為5的中華按蚊在A管和C管同時出現長度為169bp的片段(經過測序，A管為序列7、C管為序列9)，說明這一樣本為kdr突變基因的雜合子；說明這些為雜合型突變的kdr基因，kdr基因的基因型為RS，kdr基因的突變位點為L1014C。編號為6的中華按蚊在A管和B管中出現長度為169bp的片段(經過測序，B管為序列8、A管為序列7)，說明這一樣本為kdr突變基因的雜合子；說明這些為雜合型突變的kdr基因，kdr基因的基因型為RS，kdr基因的突變位點為L1014F。如果有出現3管同時出現兩個條帶的現象，為非正常狀況，可能存在其它新的突變或判為誤差。所有樣本已通過基因測序證明實驗結果無誤。實施例2、抗性試驗
9
中華按岐實驗室敏感品系((susc印tible(k)mosquito) strain，記載在Song， F. L. , Χ. Μ. Cao, Τ. Y. Zhao, Y. D. Dong and B. L. Lu. 2007. Pyrethroid resistance and distribution of kdr allele in Culex pipiens pallens in north China. Int J Pest Manag 53 :25-34.，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得) 來自軍事醫學科學院微生物流行病研究所昆蟲飼養室，隔離養殖十年以上，從未接觸過任何殺蟲劑。中華按蚊自然種群包括中華按蚊幼蟲抗性組，采自江蘇省的徐州、淮陰、常熟、南京、蘇州等5個地區；現場采集的幼蟲數量較多時，直接進行幼蟲生測，數量不夠的帶回實驗室繁殖，利用第一代幼蟲進行生物測試。1、用于幼蟲致死中濃度測試的按蚊成蚊5個自然種群中華按蚊品系及編號分別是江蘇徐州品系(XZ)，江蘇淮陰品系 (HY)，江蘇南京品系(NJ)，江蘇蘇州品系(SZ)和江蘇常熟品系(CS)(表2)。這5個自然種群中華按蚊采自2009年7月至9月和2010年7月至9月。中華按蚊成蚊自現場采集后帶回實驗室昆蟲飼養室飼養，蚊蟲養殖均在相對穩定溫度( 士 1°C )、相對濕度80 士 5%、光照12h/d的條件下飼養。將實驗室敏感品系及5個地方采集自然種群尖音庫蚊的幼蟲做毒力測定。采用浸漬法，將殺蟲劑原藥(溴氰菊酯(95%，江蘇揚農化工股份有限公司)；Es-生物丙烯菊酯 (93%，法國羅素-優克福公司)；氯菊酯(92%，南京軍區軍事醫學研究所)；高效氯氰菊酯 (97%，天津農藥股份有限公司)用丙酮配制成5-7個濃度，容器中加199ml過夜清水，放入 25頭4齡初期幼蟲，加Iml不同梯度濃度的藥液。Iml丙酮作對照，重復3次，24h觀察結果，以幼蟲不能逃避機械刺激為死亡。本研究使用高效氯氰菊酯對5個自然種群的中華按蚊及實驗室敏感品系的致死中濃度(LC50)進行了測定(表3)。以敏感品系為參照，野外種群LC50除以敏感種群LC50 即為抗藥性指數(R/S)。表2為幼蟲相關抗性組中華按蚊種群現場采樣點的分布
權利要求
1.一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的引物，由引物組A、引物組B和引物組C組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4 ；所述引物組C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列5。
2.根據權利要求1所述的引物，其特征在于所述引物組A還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1 ； 所述引物組B還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1 ； 所述引物組C還包括引物1，所述引物1的核苷酸序列為序列表中序列1。
3.根據權利要求1或2所述的引物，其特征在于 所述引物組A由引物1、2和3組成；所述引物組B由引物1、2和4組成； 所述引物組C由引物1、2和5組成； 所述引物組A、所述引物組B和所述引物組C均為獨立包裝； 所述突變位點為L1014F或L1014C。
4.一種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的PCR試劑，由試劑A、試劑B和試劑C組成；所述試劑A由所述引物組A和PCR緩沖液組成； 所述試劑B由所述引物組B和PCR緩沖液組成； 所述試劑C由所述引物組C和PCR緩沖液組成； 所述引物1在其對應的所述試劑中的終濃度均為1. 33ng/yl ； 所述引物2在其對應的所述試劑中的終濃度為eng/μ 1 ； 所述引物3-5在其對應的所述試劑中的終濃度均為6. 67ng/yl ； 所述突變位點為L1014F或L1014C。
5.一種制備檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的試劑的方法，包括如下步驟1)分別將權利要求1-3中任一所述的引物中的所述引物組A、所述引物組B和所述引物組C進行獨立包裝，得到獨立包裝引物組A、獨立包裝引物組B和獨立包裝引物組C ；2)再將步驟1)得到的獨立包裝引物組A、步驟1)得到的獨立包裝引物組B和步驟1) 得到的獨立包裝引物組C進行包裝，得到試劑；所述突變位點為L1014F或L1014C。
6.由權利要求5所述的方法制備的試劑。
7.—種檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的試劑盒，為如下1)或2) 1)所示的試劑盒由試劑盒A、試劑盒B和試劑盒C組成；所述試劑盒A為含有權利要求4所述PCR試劑中的試劑A的試劑盒； 所述試劑盒B為含有權利要求4所述PCR試劑中的試劑B的試劑盒； 所述試劑盒C為含有權利要求4所述PCR試劑中的試劑C的試劑盒；2)所示的試劑盒為含有權利要求6所述的試劑的試劑盒； 所述突變位點為L1014F或L1014C。
8.權利要求1-3中任一所述引物或權利要求4或6所述試劑或權利要求7所述試劑盒在檢測中華按蚊中kdr基因突變位點、檢測中華按蚊抗藥性或制備檢測中華按蚊抗藥性產品中的應用；所述突變位點具體為L1014F或L1014C，所述抗藥性為抗菊酯類藥物；所述菊酯類藥物具體為溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
9.一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的突變位點的方法，包括如下步驟 用權利要求1-3中任一所述引物或權利要求4或6所述試劑或權利要求7所述試劑盒中的所述引物組A、引物組B和引物組C分別對待測中華按蚊進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測各組引物擴增得到的產物，若所述引物組B擴增得到169bp產物，且所述引物C未擴增得到169bp產物，則所述 kdr基因的突變位點為或候選為L1014F ；若所述引物組C擴增得到169bp產物，且所述引物B未擴增得到169bp產物，則所述 kdr基因的突變位點為或候選為L1014C ；若所述引物組A擴增得到169bp產物，且所述引物組B和所述引物組C均未擴增得到 169bp產物，則所述kdr基因不含或候選不含有所述突變位點。
10.一種檢測或輔助檢測中華按蚊中kdr基因的基因型的方法，包括如下步驟用權利要求1-3中任一所述引物或權利要求4或6所述試劑或權利要求7所述試劑盒中的所述引物組A、引物組B和引物組C分別對待測中華按蚊進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測各組引物擴增得到的產物，若所述引物組B擴增得到169bp產物，且所述引物A和所述引物C均未擴增得到169bp 產物，則所述kdr基因為含有或候選含有突變位點L1014F的純合型基因；若所述引物組C擴增得到169bp產物，且所述引物A和所述引物B未擴增得到169bp 產物，則所述kdr基因為含有或候選含有突變位點L1014C的純合型基因；若所述引物組B和所述引物組C均擴增得到169bp產物，且所述引物A未擴增得到 169bp產物，則所述kdr基因為含有或候選含有突變位點L1014F和L1014C的雜合型基因； 若所述引物組A擴增得到169bp產物，且所述引物組B和所述引物組C均未擴增得到 169bp產物，則所述kdr基因為不含或候選不含有突變位點L1014F和L1014C的純合型基因；所述PCR擴增中，以待測中華按蚊的基因組DNA為模板； 所述PCR擴增的退火溫度為55°C -60°C，退火溫度具體為55°C ； 所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發明公開了一種中華按蚊抗藥性AS-PCR檢測試劑盒及其專用引物。本發明提供的檢測中華按蚊中kdr基因突變位點的引物，由引物組A、引物組B和引物組C組成所述引物組A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列3；所述引物組B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列4；所述引物組C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分別為序列表中序列2和序列表中序列5。本發明的實驗證明，本發明提供的了一種快捷、簡便、靈敏的中華按蚊kdr突變等位基因檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102373280SQ201110343929
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者劉美德, 張映梅, 李春曉, 汪中明, 董言德, 譚偉龍, 趙彤言, 邢丹, 郭曉霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所