專利名稱：一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，屬于微生物檢驗領域。
背景技術：
目前，國內外微生物檢驗過程中分離培養主要是預增菌、增菌、選擇性平板分離培養的方法，上世紀七十年代，以酶底物法顯色為基本原理的顯色培養基的發明大大提高了致病菌分離培養的特異性和敏感性。其基本原理為選擇性增菌，劃線分散成單個菌體，單菌體生長為單菌落并分解顯色底物顯色，需要兩步，且需要大量的培養基及有經驗的人工劃線技術，耗時36-48小時。而眾所周知，在化學物質和生物大分子分離過程中，以色譜層析或電泳為基本原理的分離方法快速省時且敏感性、特異性、準確性都比較高。但由于微生物不具溶解性，無法進行分配，因此不可能利用色譜層析。而且由于微生物個體太大無法進行有效常規電泳，有些科學家摸索了高效毛細管電泳的效果，結果表明在分離致病性球菌，如葡萄球菌和鏈球菌以及大腸桿菌方面有一定的有效性，但受生長環境、條件和生長時期等多種因素的影響，同種微生物會表現比較大的荷質比差異性，導致重現性很低，大大限制了它的適用性。
那么是否可以想一種辦法間接模擬色層原理呢？就如數字模擬信號解決數字信號的問題。從文獻分析，導管裝入半固體瓊脂，一端接種沙門氏菌，可以在毛細管另一端解離出具有鞭毛的沙門氏菌；或在一端接種某菌種，導管中若添加某化學物質，可以檢測其對該物質的趨藥性。因此可否設計以微生物的運動性或趨藥性為基本動力(模擬色譜層析中的動力)，以選擇性雜菌抑制劑為選擇性基礎物質(模擬色譜層析中的固相分配劑)，以半固體瓊脂為載體(模擬色譜層析中液相分配劑)的基本方法，即把毛細管一端放入樣品增菌液，混合菌體經過裝有特異性比較強的選擇性雜菌抑制劑的半固體瓊脂毛細管，隨著混合菌體向前生長移動會受到反復的抑制性選擇，最終雜菌會被全抑制，理論上講最后目標菌會被徹底釋放到毛細管另一端，如此就類似化學成分在色譜中不斷進行再分配的結果， 從而實現目標菌的快速高效分離。且從理論上分析，一大部分微生物具有鞭毛，具運動性； 其它微生物可以利用其趨藥性，因此動力上能夠保證；而且從目前選擇性培養基，如科瑪嘉類顯色培養基的顯色選擇性來分析，對大多數致病微生物可以篩選到特異性比較強的選擇性雜菌抑制物質。因此用毛細管選擇性半固體培養法理論上可以分離大部分微生物。迄今為止，尚未見到有用毛細管培養法檢測或篩選微生物的報道。發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其可用于檢測或篩選微生物，檢測或分離時間由現有技術中的36 48小時縮短為 12 M小時，具有快速、高效、省時省力、特異性好、敏感性強等優點。
本發明是通過以下技術方案實現的
一種利用毛細管培養法檢測、分離或鑒定微生物的方法，包括以下步驟
(1)填裝毛細管以毛細管為容器，裝載培養基；
所述培養基為半固體培養基或液體培養基或固體培養基；
所述培養基中含有供目標微生物生長的營養物質；
所述培養基中含有或不含有選擇性雜菌抑制劑或/和目標微生物顯色劑；
(2)微生物檢測將上述填裝后的毛細管的一端接入待檢樣本或待檢樣本的稀釋液或增菌液中，或將待檢樣本接入毛細管的一端，培養0 < t ^ 后，進行以下操作之
①當培養基中含有選擇性雜菌抑制劑時，直接觀察毛細管的另一端，判斷是否有菌生長落，若有菌生長，則證明待檢樣本中含有目標微生物，若無，反之；
②當培養基中含有選擇性雜菌抑制劑時，直接觀察毛細管的另一端，判斷是否有菌生長，若有菌生長，則證明待檢樣本中含有目標微生物，將菌接種至目標微生物的常規選擇培養基上進行進一步的分離純化或培養，若無，反之；
③當培養基中含有目標微生物顯色劑時，直接觀察毛細管的另一端，判斷是否有特異顯色反應，若有特異顯色反應，則證明待檢樣本中含有目標微生物，若無，反之；
④當培養基中不含有目標微生物顯色劑，含有或不含有選擇性雜菌抑制劑時，觀察毛細管另一端是否有菌生長，若有菌生長，則將毛細管的另一端接入含有目標微生物顯色劑的半固體培養基或液體培養基或固體培養基中，培養后，觀察是否有特異顯色反應，若有特異顯色反應，則證明待檢樣本中含有目標微生物，若無，反之；若無菌生長，則證明待檢樣本中不含有目標微生物；
⑤當培養基中不含有目標微生物顯色劑，含有或不含有選擇性雜菌抑制劑時，觀察毛細管另一端是否有菌生長，若有菌生長，則將菌接種至目標微生物的常規選擇培養基上進行純化或培養；
⑥當培養基中含有或不含有選擇性雜菌抑制劑或/和目標微生物顯色劑時，也可將另一端接入一組液體或半固體生化鑒定培養基，對目標微生物進行鑒定，或者多根毛細管另一端分別接入一種液體或半固體生化鑒定培養基形成一組生化鑒定實驗。
所述毛細管的材質為玻璃、塑料、合成樹脂或硅膠中的一種；材質要求硬質不透水，透氣或不透氣根據目標微生物好氧情況選定，優選使用透明材質，透明材質易于觀察培養基裝填效果，也便于終點判定。最優選耐高壓硬質無毒透明材料。
所述毛細管為管徑小于0. 5cm、管長大于Icm的直管或彎管管徑小于0. 5cm，管徑比較小，填裝量少，節約培養基且易于通過虹吸裝填，而且在培養過程中切面橫向擴散影響小；管長大于1cm，管的長度選取依據具體的目標微生物和選擇性抑制劑對目標微生物和雜菌的分離能力通過實驗驗證來確定，達到既能較好的選擇性分離目標微生物，又能在較短時間內分離的最佳方案；管的形狀根據實驗的便利性可以進行一定程度的彎曲，以不影響實驗結果為前提。
所述填裝毛細管采用無菌虹吸法或灌注法。
所述目標微生物為帶有或不帶有鞭毛的細菌。
所述供目標微生物生長的營養物質選自能支持或促進微生物生長的碳源、氮源、 生長因子和無機鹽中的一種或任幾種。
所述目標微生物的選擇性顯色劑為目標微生物的特異生化酸堿指示劑、生化鑒定試劑或/和酶底物顯色劑，作用為使目標微生物特異生化反應通過顏色反應顯示出來。生化鑒定培養根據目標菌生化特征選擇項目，一般一種目標微生物需要一組生化反應鑒定， 因此生化鑒定培養基需要多管形成一組，有些生化底物可以幾個反應在一管內完成。
所述選擇性雜菌抑制劑為對目標微生物無抑制作用、對非目標微生物有抑制作用的試劑，或對目標微生物的抑制作用小于非目標微生物的抑制作用的試劑，或對目標微生物的生長促進作用相對大于對非目標微生物的生長作用的試劑；具體應用時，根據目標微生物選擇合適的選擇性雜菌抑制劑。
所述選擇性雜菌抑制劑選自膽鹽、脫氧膽酸鈉、碘、碘化鉀、煌綠、孔雀綠、亞硒酸鹽、胱氨酸、質量濃度在以上的氯化鈉溶液、吖啶黃、萘啶酮酸、月桂基硫酸鹽、氯化鋰、 結晶紫、中性紅、伊紅、美蘭、萬古霉素、新生霉素、兩性霉素、頭孢菌素、頭孢哌酮、多粘菌素、磺胺嘧啶、利福平、染料和抗生素中的一種或任幾種。
優選的，所述培養基為半固體培養基，比如由目標微生物的選擇性顯色劑、營養物質、0. 1.0% (質量分數)瓊脂和水組成的半固體培養基。
所述增菌液中含有能支持或促進目標微生物生長的營養物質，添加或不添加選擇性雜菌抑制劑。優先選用增菌液與待檢樣本體積比在10 1以上的樣液，增菌液含有營養物質，添加或不添加選擇性雜菌抑制劑根據目標微生物在樣本中的存活情況決定，樣本中目標微生物生存狀況比較好，可添加選擇性雜菌抑制劑，若樣本中目標微生物生存狀況不佳，則應不加選擇性雜菌抑制劑，以營養性恢復為主。
對于接入方式，若樣本為液體或半固體時可直接接入，接入方式優先選擇持續插入整個培養過程，根據目標微生物和樣本的情況，若污染嚴重或目標微生物含量比較高時， 可以將毛細管選擇性半固體培養基一端點觸待檢樣本或者待檢樣本的稀釋液或增菌液，所謂點觸，就是將毛細管接觸液體，然后短時間內離開，也可間接點觸，即通過棉棒、取菌環 (針)及其它有效工具先點觸待檢樣本或者待檢樣本的稀釋液或增菌液，然后再點觸毛細管選擇性半固體培養基一端。
所述培養時間為3 < t彡96h，優選12 < t彡24h0培養溫度和時間根據目標微生物的生長特性選定，如沙門氏菌可選36°C或42°C，單核細胞增生李斯特菌可選30°C。培養時間一般為3 96h。在培養過程中，混合菌體經過裝有特異性比較強的雜菌抑制劑的半固體瓊脂，隨著混合菌體向前生長或/和運動，雜菌會受到反復的抑制性選擇，而目標微生物保持正常或超常的向前生長或/和運動，類似化學成分在色譜中不斷進行再分配的過程，最后目標微生物會被釋放到毛細管另一端，從而實現目標菌的快速高效分離。
本發明利用毛細管培養法檢測或篩選微生物，大部分菌屬的檢測或分離時間由現有技術中的36 48小時縮短為12 M小時，具有快速、高效、省時省力、特異性好、敏感性強等優點。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1 一種毛細管選擇性半固體法檢驗沙門氏菌
步驟如下
1、毛細管的選取選取內徑0. 5讓、1111111、2111111，長度2、5、10、20011長玻璃毛細管若干根。
2、選擇性半固體培養基的制備按配方蛋白胨10. 0g、牛肉膏5. 0g、氯化鈉3. 0g、 碳酸鈣45. 0g、瓊脂粉4. Og和蒸餾水IOOOmL加熱溶解后取900mL，加入100mL50% (質量分數，下同)硫代硫酸鈉溶液、20. 0mL20%碘溶液(含25%碘化鉀)、2. OmLO. 5%煌綠水溶液、 50. OmLlO%牛膽鹽溶液，混勻滅菌，即得。
3、液體和半固體顯色培養基的制備將CHR0MAGAR沙門氏菌顯色培養基(鄭州博賽生物技術股份有限公司，批號1004)按照說明書比例加入去離子水配制成200mL懸液，磁力攪拌溶解15min后，靜置15min后取上清液IOOmL,該上清液為目標菌顯色劑和營養物質溶液，為液體顯色培養基(加熱滅菌后分裝每管ImL備用)；取50mL液體顯色培養基中加入0. 2g瓊脂加熱溶解滅菌，即得半固體顯色培養基。
4、半固體生化鑒定培養基的制備沙門氏菌生化鑒定培養基套裝產品(S005，北京陸橋技術有限責任公司)中三糖鐵為半固體培養基，因此可直接不經處理備用。其余生化管為目標微生物生化反應底物、生化反應指示劑、營養物質混合液(除三糖鐵外)，其余每支管ImL中添加瓊脂％ig，加熱溶解滅菌，即得。因三糖鐵為半固體培養基，因此該套裝中三糖鐵瓊脂可直接不經處理備用。
5、毛細管的填裝將無菌毛細管插入上述步驟2 4制備的融化狀態培養基，觀察毛細管虹吸上緣，使毛細管整管填充后，室溫靜置至凝固，選擇性半固體培養基裝入0. 5mm、 lmm、2mm內徑，5、10、20cm長毛細管若干根，半固體顯色培養基和半固體生化鑒定培養基分別裝入0. 5mm、lmm、2mm內徑，2cm長毛細管若干根。
6、樣本增菌夜的制備將約IO1CFUAiL的沙門氏菌加入到IOOmL鮮牛奶中作為樣本，取檢樣25g加入到225mL緩沖蛋白胨水培養基(北京陸橋技術有限責任公司，以下各實施例中增菌液所用成品培養基均為該公司生產，有效期內使用)中。
7、選取步驟5制備好的毛細管選擇性半固體培養基任意18根，將一頭插入樣本增菌液中，持續至整個培養過程。將其中15根按3根為一組，每組中另一頭分別插入上述制備的毛細管半固體顯色培養基、液體顯色培養基、毛細管半固體生化鑒定培養基、沙門氏菌生化鑒定培養基套裝產品(S005，北京陸橋技術有限責任公司)、營養肉湯中，剩余3根不插入任何培養基。
8、培養步驟7制備的毛細管選擇性半固體體系放入恒溫恒濕培養箱36°C，培養 24h0觀察其中3根毛細管半固體顯色培養基一端和3根液體顯色培養基均呈現紫紅色，初步判定樣本中檢出沙門氏菌。觀察毛細管半固體生化鑒定培養基、沙門氏菌生化鑒定培養基套裝產品的結果并記錄，鑒定表明檢出菌為沙門氏菌，結果見如表1所示
表 權利要求
1.一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)填裝毛細管以毛細管為容器，裝載培養基；所述培養基為半固體培養基或液體培養基或固體培養基；所述培養基中含有供目標微生物生長的營養物質；所述培養基中含有或不含有選擇性雜菌抑制劑或/和目標微生物顯色劑；(2)微生物檢測將上述填裝后的毛細管的一端接入待檢樣本或待檢樣本的稀釋液或增菌液中，或將待檢樣本接入毛細管的一端，培養0 < t ^ 后，進行以下操作之一①當培養基中含有選擇性雜菌抑制劑時，直接觀察毛細管的另一端，根據透明度對比判斷是否有菌生長，若有菌生長，則證明待檢樣本中含有目標微生物，若無，反之；②當培養基中含有選擇性雜菌抑制劑時，直接觀察毛細管的另一端，根據透明度對比判斷是否有菌生長，若有菌生長，則證明待檢樣本中含有目標微生物，將菌接種至目標微生物的常規選擇培養基上進行進一步的分離純化或培養，若無，反之；③當培養基中含有目標微生物顯色劑時，直接觀察毛細管的另一端，判斷是否有特異顯色反應，若有特異顯色反應，則證明待檢樣本中含有目標微生物，若無，反之；④當培養基中不含有目標微生物顯色劑，含有或不含有選擇性雜菌抑制劑時，觀察毛細管另一端是否有菌生長，若有菌生長，則將毛細管的另一端接入含有目標微生物顯色劑的半固體培養基或液體培養基或固體培養基中，培養后，觀察是否有特異顯色反應，若有特異顯色反應，則證明待檢樣本中含有目標微生物，若無，反之；若無菌生長，則證明待檢樣本中不含有目標微生物；⑤當培養基中不含有目標微生物顯色劑，含有或不含有選擇性雜菌抑制劑時，觀察毛細管另一端是否有菌生長，若有菌生長，，則將菌接種至目標微生物的常規選擇培養基上進行純化或培養；⑥當培養基中含有或不含有選擇性雜菌抑制劑或/和目標微生物顯色劑時，將另一端接入一組液體或半固體生化鑒定培養基，對目標微生物進行鑒定，或者多根毛細管另一端分別接入一種液體或半固體生化鑒定培養基形成一組生化鑒定實驗。
2.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述毛細管的材質為玻璃、塑料、合成樹脂或硅膠中的一種。
3.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述毛細管為管徑小于0. 5cm、管長大于Icm的直管或彎管。
4.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述供目標微生物生長的營養物質選自能支持或促進微生物生長的碳源、氮源、生長因子和無機鹽中的一種或任幾種。
5.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述目標微生物顯色劑為目標微生物的特異生化酸堿指示劑、生化鑒定試劑或/和酶底物顯色劑。
6.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述選擇性雜菌抑制劑選自膽鹽、脫氧膽酸鈉、碘、碘化鉀、煌綠、孔雀綠、亞硒酸鹽、 胱氨酸、質量濃度在以上的氯化鈉溶液、吖啶黃、萘啶酮酸、月桂基硫酸鹽、氯化鋰、結晶紫、中性紅、伊紅、美蘭、萬古霉素、新生霉素、兩性霉素、頭孢菌素、頭孢哌酮、多粘菌素、磺胺嘧啶、利福平、染料和抗生素中的一種或任幾種。
7.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述培養基為選擇性半固體培養基，由選擇性雜菌抑制劑、營養物質、0. 1. 0%瓊脂和水組成的半固體培養基。
8.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述培養基為半固體顯色培養基，為由目標微生物顯色劑、營養物質、0. 1.0%瓊脂和水組成的半固體培養基。
9.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述半固體生化鑒定培養基，為由目標微生物生化反應底物、生化反應指示劑、營養物質、0. 1.0%瓊脂和水組成的半固體培養基，或由酶底物試劑、營養物質、0. 1.0%瓊脂和水組成的半固體培養基。
10.根據權利要求1所述的一種利用毛細管培養法檢測或篩選微生物的方法，其特征在于所述培養時間為12 < t < 96h。
全文摘要
本發明公開了一種利用毛細管培養法檢測、分離或鑒定微生物的方法，包括以下步驟(1)填裝毛細管以毛細管為容器，裝載培養基；(2)微生物檢測將上述填裝后的毛細管的一端接入待檢樣本或待檢樣本的稀釋液或增菌液中，或將待檢樣本接入毛細管的一端，培養0＜t≤96h后，觀察是否有菌生長或是否有特異性反應，然后判斷是否含有目標微生物。本發明利用毛細管培養法檢測或篩選微生物，大部分菌屬的檢測或分離時間由現有技術中的36～48小時縮短為12～24小時，具有快速、高效、省時省力、特異性好、敏感性強等優點。
文檔編號C12R1/445GK102517375SQ20121000640
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者劉輝, 單曉英, 時玉雯, 李健, 李曉東, 楊月蓮 申請人:濟南市疾病預防控制中心