專利名稱：鼻咽癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及ー種鼻咽癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估鼻咽癌發病的風險級別，并作為預防和治療鼻咽癌的方向指導。
背景技術：
鼻咽癌是指發生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤。常見臨床癥狀是鼻塞、鼻涕流血、頭痛、耳鳴；晚期侵及顱腦，可出現耳鳴、耳聾、頭痛、復視及頸淋巴結腫大。在世界大多數國家，鼻咽癌發病率極低，但在中國南方部分省市和亞洲東南部ー些國家其發病率卻很高，其中我國南方廣東省是世界最高發地區，世界人ロ標化發病率高達男性約30/10萬，女性約13/10萬。研究結果表明，鼻咽癌具有顯著的地區差異、家族集聚現象和發病率相對穩定等流行病學特征，移民流行病學研究證據和符合分離分析研究結果均提示遺傳因素在鼻咽癌的發生發展中具有重要作用。細胞色素P450超家族是ー類重要的代謝酶基因。其編碼的CYP450酶能將無活性的前致癌物代謝轉變為具有活性的中間產物，這些中間產物具有親電子性而且可以與 DNA共價結合形成加和物，從而損傷DNA及引起癌基因和抑癌基因的改變，導致癌變形成。 CYP2E1酶主要代謝活化ー些低分子量的化合物，包括亞硝胺類、黃曲霉素BI、苯并花、四氯化碳等。TNF是體內具有多種生物活性的重要致炎細胞因子，主要由脂多糖激活的單核、巨噬細胞及淋巴細胞等分泌。TNF有抗病毒、廣泛的誘導炎癥和免疫調節功能，最突出的是其強大的抗腫瘤特性。從而在自身免疫性疾病、感染性疾病，特別是在惡性腫瘤的發生發展過程中起重要作用。研究表明TNF-PG252A單核苷酸位點多態性與鼻咽癌易感性密切相關， 因此可以作為鼻咽癌易感性的危險因素之一。谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)是人體內ー類具有重要解毒作用的多基因酶族，其中的GSTMl和GSTTl分別編碼GST- U和GST- 0同功酶，分別對多環芳烴類和環氧化物及殺蟲劑中的鹵代烷烴類有很強的解毒作用。研究表明GSTTl和GSTMl基因的缺失導致它們編碼的同功酶缺失，均可能影響機體對上述毒物的解毒功能，増加宿主對該類致癌物作用的敏感性。有研究表明GSTMl和GSTTl存在人群缺失多態，且地域不同缺失率有差異，中國人 GSTMl缺失率偏高，在35% -63%，尤其GSTTl缺失率高達58%，這部分人群相當于增加了環境毒素和致癌物質的濃度，提高了個體罹患一系列類型癌癥的風險。國內外研究表明，攜帶GSTMl和GSTTl缺失型的個體，鼻咽癌的風險增加，因此GSTM1/GSTT1缺失型是中國人群重要的鼻咽癌遺傳易感因素之一。綜上所述，鑒于CYP2E1基因上Rsall多態性，TNF-^基因上G252A位點多態性， GSTMl基因缺失與否(Present/Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)在鼻咽癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在鼻咽癌發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患鼻咽癌的高危人群，從而有針對性的預防和治療鼻咽癌，這對于降低鼻咽癌的發病率有非常重要的意義。

發明內容
基于CYP2E1基因上Rsall多態性，TNF-β基因上G252A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的4個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估鼻咽癌發病的危險因子的基礎上，本發明提供一種鼻咽癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP2E1基因上Rsall多態性，TNF-β基因上G252A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)； PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(1)CYP2E1 (Rsall)正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'CYP2E1 (Rsall)反向引物5' ATACAGACCCTCTTCCACCTT3'(2)TNF-@ (G252A)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'
TNF-P (G252A)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(3)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4) GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5 ill ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、 5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u I, ddH20 19. 175u I ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(1)CYP2E1 (Rsall)測序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'(2)TNF-P (G252A)測序引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'(3) GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(4) GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %こ醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%こ醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行預防鼻咽癌發病的基因無創檢測的服務I.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用ロ腔采樣拭進行ロ腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的CYP2E1基因上Rsall多態性， TNF-^基因上G252A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的4個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這4個SNPs位點的基因型。3.鼻咽癌發病高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具鼻咽癌易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者CYP2E1基因上Rsall多態性，TNF-β基因上G252A位點多態性， GSTMl基因缺失與否(Present/Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的4個基因上 SNP位點基因檢測信息、以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀鼻咽癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測鼻咽癌易感基因無創檢測試劑盒，其特征在于檢測CYP2E1基因上Rsall 多態性，TNF-^基因上G252A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對CYP2E1 基因上Rsall多態性，TNF-^基因上G252A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/ Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的4個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這4個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對CYP2E1 基因上Rsall多態性，TNF-^基因上G252A位點多態性，GSTMl基因缺失與否(Present/ Null)，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)的4個單核苷酸多態性位點而設計，能通過 DNA測序技術特異性檢測出上述4個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的4對特異性引物序列如下(1)CYP2E1(Rsall)正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'CYP2E1 (Rsall)反向引物5' ATACAGACCCTCTTCCACCTT3'(2)TNF- ^ (G252A)正向引物5' CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3'TNF-^ (G252A)反向引物5' TTCGTGCTTTGGACTACCG3'(3)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測序引物序列如下(1)CYP2E1(Rsall)測序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'(2)TNF-^(G252A)測序引物5, CAGAAGGAGGAGGTGTAGGGT3,(3)GSTMl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(4)GSTTl(Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)卩0 反應體系10\ 0 反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測鼻咽癌易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測CYP2E1基因上Rsal1多態性，TNF-β基因上G252A位點多態性，GSTM1基因缺失與否(Present/Null)，GSTT1基因缺失與否(Present/Null)的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與鼻咽癌發生密切相關的2個單核苷酸多態性位點的基因型來評估受檢者鼻咽癌患病的風險級別，并最終根據每一位受檢者的基因檢測結果從基因層面指導受檢者有針對性的預防鼻咽癌的發生，降低鼻咽癌的發病幾率。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102586446SQ201210053659
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司